Extracto
Con el fin de comprender los mecanismos moleculares de Bifidobacterium infantis timidina quinasa /ganciclovir análogo de nucleósido (BI-TK /GCV) sistema de tratamiento que se ha demostrado que exhiben actividad de crecimiento anti-tumor sostenible e inducir la apoptosis en el cáncer de vejiga, un enfoque proteómico de etiquetas isobáricas para relativa y absoluta cuantificación (iTRAQ), seguido por espectrometría de masas en tandem con cromatografía líquida se utilizó (LC-MS /MS). 192 las reguladas y se identificaron 210 proteínas regulados hasta después del tratamiento con el sistema BI-TK /GCV en ratas Sprague-Dawley (SD) ratas. Western blot y análisis de inmunohistoquímica confirmaron que peroxiredoxina-I (PRX-I) era significativamente las reguladas en el cáncer de vejiga después del tratamiento. PRX-I silenciar mediante transfección de PRX-I shRNA crecimiento suprimió de forma significativa, así como la muerte y se regula el ciclo celular en células T24 y redujo la expresión de fosfo-NF-kB p50 y la proteína p65, que reveló los vínculos entre PRX-I y NF-kB vía implicada por la vía de análisis Ingenuity (IPA). Estos resultados arrojan nuevos conocimientos sobre la terapia del cáncer de vejiga, revelando PRX-I como una nueva diana terapéutica e indicando sistema de GCV BI-TK /como una terapia potencial de baja regulación de PRX-I a través de la vía de señalización NF-kB.
Visto: Jiang L, Xiao X, J Ren, Tang Y, Weng H, Q Yang, et al. (2014) Análisis proteómico de cáncer de vejiga Indica PRX-I como una molécula clave en la BI-TK Sistema /GCV tratamiento. PLoS ONE 9 (6): e98764. doi: 10.1371 /journal.pone.0098764
Editor: Hari K. Koul, centro de Louisiana State University Health Sciences, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Diciembre, 2013; Aceptado: May 6, 2014; Publicado: 6 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la beca de investigación de la Fundación Científica Naturales de China (Nº 81072087 /H1619). La dirección URL de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China: http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/default.htm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de vejiga es el cáncer más común en urológica. Asia y su manejo clínico es extremadamente caro [1]. En 2014, se espera que alrededor de 74.690 nuevos casos de cáncer de vejiga para ser diagnosticado, y alrededor de 15.580 de ellos morirán [2]. El cáncer de vejiga se puede dividir en dos grandes subtipos clínicos y patológicos: tipo no invasivo del músculo superficial y el tipo de músculo invasivo avanzado [3]. En general, el cáncer superficial de vejiga es tratado con resección endoscópica con un pronóstico favorable, pero a veces se vuelve a producir con la progresión de grado [4]. El tratamiento del cáncer de vejiga avanzado es un reto importante, y estos pacientes tienen un pronóstico menos favorable, con una tasa de supervivencia muy baja de 5 años; Por lo tanto, las opciones terapéuticas más agresivas son necesarias, tales como la cistectomía radical y derivación urinaria [5]. Además, el cáncer de vejiga en especial el tipo avanzado vuelve a aparecer en un número considerable de pacientes, e incluso resulta en la muerte, y por lo tanto, preferentemente métodos menos agresivos debe ser desarrollado para combatir la enfermedad.
Virus del herpes simple timidina quinasa (HSV TK) mediada por la terapia génica suicida como una estrategia ampliamente aceptada para el cáncer de vejiga se puede convertir el ganciclovir análogo de nucleósido no tóxico (GCV) en una forma trifosforilada tóxico, que posteriormente causa la muerte de las células que se dividen rápidamente [6]. Anteriormente hemos recurrido a
Bifidobacterium infantis
(BI), que es una bacteria de metas de tumor, ya que localiza y prolifera en las regiones hipóxicas de tumores como una bacteria no patógena y anaeróbico selectivamente [7], [8] . Se encontró que el BI y TK /GCV sistema (BI-TK /GCV) exhibieron un crecimiento de la actividad antitumoral sostenible en el modelo de cáncer de vejiga de roedores in vivo, que involucró a dos vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis [9].
En un esfuerzo por comprender los mecanismos moleculares subyacentes e identificar el potencial molécula de proteína objetivo de este sistema de tratamiento seguro y eficaz, que recurrió a espectrometría de masas (MS) etiquetas isobáricas poblacionales para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) para obtener diferencial integral los perfiles de proteínas. Además, se investigó el mecanismo molecular de peroxiredoxina-I (PRX-I), una de las proteínas reguladas por los identificados en el cáncer de vejiga identificado por iTRAQ después del tratamiento con BI-TK /GCV.
Materiales y Métodos
Materiales
El sistema de BI-TK /GCV tratamiento se construyó con éxito por nuestro grupo de investigación (Chongqing, china) [9].
Los animales experimentales
setenta ratas Sprague-Dawley hembra (6-8 semanas de edad, con un peso de 180-200 g) fueron adquiridos de Chongqing Base Nacional de la Industria Biológica del Centro Experimental de Animales (china) y alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos a 23-27 ° C y la humedad 55-65% con ciclos de luz-oscuridad de 12 h. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Chongqing. Un modelo de tumor de vejiga de rata fue construido por la perfusión de N-metil-nitrosourea (MNU) (Sigma, EE.UU.). MNU se diluyó en 20 g /l de una solución tampón de ácido cítrico. Cada vejiga se perfundió con 0,1 ml una vez cada 2 semanas, para un total de cuatro perfusiones.
Los estudios in vivo
Sesenta ratas Sprague-Dawley que tienen tumores fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (cada uno
n
= 15): un grupo normal de solución salina, un grupo BI, un grupo BI /pGEX-1, y un grupo BI-TK. Después de la Bifidobacterium se concentró, se inyectaron aproximadamente 0,5 ml de las intervenciones correspondientes a través de la vena de la cola (recuento de bacteria, 4,4 × 10
9) una vez a la semana durante 4 semanas. Todos los grupos recibieron una inyección intraperitoneal diaria de GCV (50 mg /kg) durante 28 días. Todas las ratas se sacrificaron bajo anestesia con pentobarbital sódico. Parte de los tejidos de cáncer de vejiga de los cuatro grupos se conservaron en parafina para el análisis inmunohistoquímico (IHC), y el resto de los tejidos se mantuvieron a -80 ° C para su posterior análisis.
preparación de la muestra de proteína y etiquetado iTRAQ
Los tejidos fueron lisadas en un tampón de lisis (7 m de urea, 1 mg /ml ADNasa I, 1 MMNA
3Vo
4, y 1 mm fenilmetano sulfonylfl fluoruro, PMSF) y se centrifugó a 6000 g y 4 ° C durante 30 min. El sobrenadante se recogió y el contenido total de proteína se midió utilizando kit de cuantificación de 2D (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Cada muestra se digirió con 20 l de solución de 0,1 g /l de tripsina (Promega, Madison, EE.UU.) a 37 ° C durante la noche y luego marcadas con las etiquetas iTRAQ como sigue: (i) grupo de solución salina normal, 114 etiquetas; (Ii) el grupo BI-TK, 115 etiquetas; (Iii) BI /pGEX-1 grupo, 116 etiquetas; (Iv) el grupo BI, 117 etiquetas. Las muestras marcadas se agruparon antes de su posterior análisis.
intercambio catiónico fuerte (SCX) cromatografía
Para reducir la complejidad de las muestras para la cromatografía líquida (LC) -MS /MS análisis, las muestras fueron agrupados diluyeron 10 veces con un SCX tampón a (10 mm KH
2 PO
4 en 25% de acetonitrilo a pH 3,0) y se utilizan para una 2,1 x 200 mm polisulfoetil una columna SCX (PolyLC; Columbia, EE.UU.). La columna se eluyó con un gradiente de 0 a 25% de tampón B SCX (KH 10 mM
2 PO
4 a pH 3,0 en 25% de acetonitrilo que contiene KCl 350 mM) durante 30 min, seguido de un gradiente de 25 100% de tampón B SCX durante 40 min. Estas fracciones de SCX se liofilizaron en un concentrador de vacío y sometidos a C-18 (100 mg capacidad, Supelco; Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) limpieza utilizando una columna de extracción
Tiempo de iones cuadrupolo por electropulverización. -de-vuelo MS (ESI-Q-TOF-MS) Análisis
MS se realizó con un nano-LC acoplado en línea a un espectrómetro de masas QStar Elite (Applied Biosystems). El eluyente LC fue dirigida a una fuente de ESI para el análisis Q-TOF-MS. El espectrómetro de masas fue ajustado para llevar a cabo la adquisición dependiente de información (IDA) en el modo de ion positivo, con un intervalo de masa seleccionado de 300-2.000 m /z. Se seleccionaron péptidos con 2 a 4 estados de carga para la espectrometría de masas en tándem, y el tiempo de la suma de los eventos de MS /MS se fijó a 3 s. Cuantificación relativa de las proteínas, en el caso de iTRAQ, se realizó en las exploraciones de MS /MS y fue la relación de las áreas bajo los picos a 113, 114, 115, y 116 Da, que eran las masas de las etiquetas que corresponden a la reactivos iTRAQ.
el análisis proteómico
los procesos de bioinformática y la función molecular de las proteínas identificadas en el grupo BI-TK después del tratamiento fueron clasificados por el sistema de clasificación PANTHER (www.pantherdb.org). Las vías de proteínas expresadas diferencialmente identificados por iTRAQ se analizaron mediante el programa de análisis de la vía Ingenio (IPA) (http://www.ingenuity.com). En el ingenio software, se utilizaron los datos para extraer las redes interactivas entre las proteínas en la base de datos de Índice Internacional de Proteínas (IPI). Una red con una puntuación superior a 2 por lo general se considera válido.
Validación por IHC y Western blot
Western Blot y IHC se utiliza para confirmar la expresión de PRX-I. T Las muestras de proteína (aproximadamente 20 mg) se separaron mediante SDS-PAGE. Después de la electroforesis SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. Posteriormente, los lisados se incubaron con un anticuerpo primario anti-Prx-I monoclonal de conejo (1:1500) (Abcam, EE.UU.). Las señales inmunorreactivas se detectaron mediante el kit de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences, Suecia). Los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. tejidos de cáncer de vejiga de cuatro grupos se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios. Los tejidos se incubaron con anticuerpos secundarios durante 2 h. Los núcleos celulares se contratiñeron con hematoxilina. La proporción de células tumorales teñidas positivamente se determinó por Image-Pro Plus (IPP) 6,0 y se calificó de la siguiente manera: 0, negativo; 1, & lt; 10%; 2, 10-50%; 3, & gt; 50%. La intensidad de la inmunotinción se puntuó como sigue: 0, ausente; 1, de color amarillo claro; 2, de color pardo amarillento; 3, de color marrón. La proteína en los tejidos de cáncer de vejiga se evaluó utilizando el índice de tinción (SI):.
SI =
proporción × intensidad de las células tumorales positivas
PRX-1 desmontables por shRNA
Las células T24 se sometieron a Prx1 caída. ARN corto horquilla (shRNA) se exprssed con el sistema GV102 (GeneChem, China). Los tres pares de secuencias sentido y antisentido de oligonucleótidos que hibridan en Prx1 humana (GeneBank_ID: NM_002574) fueron los siguientes: Prdx1 RNAi (sh-1) cadena sentido 5'-GATCCCGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCTTTTTGGAT-3 ', Prdx1 RNAi cadena antisentido (sh-1) 5'-AGCTATCCAAAAAGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCGG-3 '; Prdx1 RNAi (sh-2) cadena sentido 5'-GATCCCGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCTTTTTGGAT-3 ', cadena antisentido Prdx1 RNAi (sh-2) 5'-AGCTATCCAAAAAGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCGG-3'; Se utilizó Prdx1 RNAi (SH-3) cadena sentido 5'-GATCCCCCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGTTTTTGGAT-3 ', cadena antisentido Prdx1 RNAi (SH-3) 5'-AGCTATCCAAAAACCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGGG-3'.A revueltos secuencia de la diana PRX-I como un negativo de control (con sh). las células T24 se transfectaron transitoriamente con los vectores de expresión Prx1-shRNA utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.). T24 células no infectadas (de los padres) y PRX-controlo shRNA infectado las células T24 (con sh) también se utilizaron. La mayor eficiencia de caída por shRNA vectores en células T24 se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). El primer secuencias de PRX-I fueron 5'-AGCCTGTCTGACTACAAAG-3 '(hacia delante) y 5'-TCTGCCCTATCACTGAAAG-3' (hacia atrás), que obtuvo un producto de 104 pb. Las secuencias de los cebadores para el control interno GAPDH fueron 5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 '(hacia delante) y 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' (hacia atrás), que obtuvo un producto de 110 pb. El valor de la expresión de Prx-I en comparación con la de GAPDH se calculó como 2-ΔΔCt. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. A continuación, las expresiones de Prx-I en las células T24 derribados por shRNAs se midieron mediante transferencia Western.
proliferación de las células de ensayo
Después de la transfección con Prx-I shRNA durante 24 h, las células T24 fueron se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 4 x 10
3 células en un volumen final de 100 l /pocillo, y las células no transfectadas se utilizaron como control. La tasa de proliferación celular se calculó en diferentes puntos de tiempo (24, 48 y 72 h) utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma, EE.UU.). Los experimentos se realizaron según el protocolo del fabricante. La absorbancia a 450/630 nm se midió con un espectrofotómetro Thermo (Waltham, EE.UU.). Se calculó la absorbancia promedio de seis pocillos por grupo.
análisis de citometría de flujo
Después de la transfección durante 48 h, se trataron con tripsina y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min las células. Las células se recogieron y se lavaron con PBS dos veces. Después se tiñeron con 50 mg /ml de isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC) (BD Biosciences, EE.UU.) y 20 l de 500 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (Sigma, EE.UU.) para la detección de la apoptosis, las células se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min y se sometieron a análisis de citometría de flujo (FACS). A continuación, las células se recogieron, se lavaron con PBS, se fijaron con 75% de etanol a -20 ° C durante la noche. Las células fijadas se lavaron con PBS frío dos veces, añadido 500 l de solución de ADN tinción (incluyendo 200 mg /ml de RNasa A y solución de tinción de yoduro de propidio /ml 20 g) y se incubaron durante 30 minutos. Finalmente, las células se sometieron a análisis del ciclo celular mediante FACS. fueron analizados y evaluados en el programa ModFit (Topsham, EE.UU.). Los datos
Efecto de PRX-I en fosfo-p50 NF-kB y p65
El vínculo entre PRX-I y la NF-kappa-B (NF-kB) de señalización complejo había sido implicado en la vía de la proteína de la IPA. Por lo tanto, con el fin de explorar si el efecto de PRX-I en las proteínas de señalización de apoptosis fue atribuible a la inhibición de NF-kB, se evaluaron los niveles nucleares de fosfo-p50 NF-kB y p65 (Abcam, EE.UU.) por Western blot.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (dE) y se compararon mediante análisis de varianza. El nivel de diferencia significativa se definió como p & lt; 0,05. Todos los análisis se realizaron en SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, EE.UU.) para Windows.
Resultados
Cuantificación e identificación de proteínas expresadas diferencialmente por iTRAQ
Un total de 2343 singular proteínas se identificaron con una confianza del 95% por el algoritmo de búsqueda ProteinPilot contra el IPI rata v3.49 de datos de proteínas. Un valor de corte estricta de un cambio de 1,3 veces dio lugar a un conjunto final de 402 proteínas expresadas diferencialmente, incluyendo proteínas 192-regulado por proteínas y 210 hasta reguladas en el grupo BI-TK después del tratamiento. Sorprendentemente, una nueva molécula de Prx- me llamó la atención en particular, con una disminución de 0,52 veces mayor en el grupo BI-TK en comparación con el grupo de solución salina normal. Un diagrama esquemático de iTRAQ se muestra en la Figura 1A, y el espectro de MS /MS de Prx- I (secuencia peptídica: VVGDHVEVHAR) se muestra en la Figura 1B. Las etiquetas iTRAQ son los siguientes: (i) el grupo de solución salina normal, 114 etiquetas; (Ii) el grupo BI-TK, 115 etiquetas; (Iii) el /pGEX-1 grupo BI, 116 etiquetas; (Iv) el grupo BI, 117 etiquetas. La Identificación de proteínas en el IPI, el nombre y las funciones principales con los cambios de abundancia se resume en la Tabla S1
A:. Diagrama esquemático que muestra el flujo de trabajo de iTRAQ. B: espectro de MS /MS que muestra los péptidos de PRX-I (secuencia peptídica: VVGGDHVEVHAR). Los contornos de pico 4 describen que los volúmenes de muestra son los mismos que garantiza los resultados son auténticos y fiables.
análisis funcional bioinformático de proteínas expresadas diferencialmente después del tratamiento con BI-TK /GCV
Para indagar en sus funciones biológicas en el efecto curativo de la BI-TK /GCV en el cáncer de vejiga, las proteínas expresadas diferencialmente se clasifican en varios procesos y clases de función basados en el sistema de clasificación PANTHER. En el análisis de proceso biológico, la mayor proporción de proteínas expresadas diferencialmente estaba en proceso metabólico, seguido de proceso celular y el proceso de comunicación de la célula (Figura 2A). En particular, las proteínas implicadas en la actividad catalítica, la unión, la actividad de la molécula estructural, regulador de la actividad de la enzima, y la actividad de los receptores eran las cinco principales categorías de función molecular (Figura 2B). Por otra parte, las proteínas implicadas en la actividad antioxidante representaron el 1,3%, respectivamente. La figura 2C representa las vías primarias generadas por IPA de las proteínas expresadas diferencialmente. Esta red anotó 36 y consistía de 37 proteínas implicadas en la apoptosis, el estrés oxidativo, y el metabolismo. En particular, PRX-I, la proteína marcada hacia abajo-expresó después del tratamiento, está directamente relacionada con el factor de transcripción NF-kappa-B (NF-kB) vía compleja en esta red, lo que indica que PRX-I puede desempeñar un papel importante en el apoptosis de cáncer de vejiga en un sistema de BI-TK /GCV en parte a través de la vía de señalización NF-kB.
PANTHER clasificación de proteínas basado en el procedimiento (a) Biológica y la función molecular (B). (C) interplaying red de proteínas con el cambio de la abundancia generada por la vía de análisis Ingenuity (IPA). La red implicaba la conexión del complejo PRX-I y NF-kB.
Validación de PRX-I por IHC y Western blot
Los niveles de expresión diferencial de Prx- me identifica por enfoque iTRAQ fueron validados por transferencia Western (Figura 3A). En comparación con el grupo de solución salina normal, la expresión de Prx-I es regulada hacia abajo en los otros tres grupos (especialmente en el grupo BI-TK), que es similar a los resultados obtenidos por iTRAQ. Además, la expresión Prx-I en los tejidos tumorales se verificó mediante análisis IHC (Figura 3B). El contenido Prx-I en células de cáncer de vejiga de grupo BI-TK fue significativamente menor que en los otros grupos (p & lt; 0,05, Figura 3B)., Que es coherente con los resultados obtenidos por iTRAQ y Western blot
R: Las expresiones de PRX-I en cuatro grupos mediante análisis de transferencia Western. Beta-actina se utilizó como control de carga. B: Imágenes representativas que muestran la inmunoexpresiones de PRX-I en los tejidos tumorales de cuatro grupos. En comparación con el grupo de solución salina normal, la expresión de Prx-I es regulada hacia abajo en los otros tres grupos (especialmente en el grupo BI-TK), que es similar a los resultados obtenidos por iTRAQ. (El asterisco (*) indica P & lt; 0,05 en el grupo BI-TK frente al grupo de solución salina normal)
qPCR y Western blot para la eficiencia de interferir en las células T24
En primer lugar, la Prx- I niveles de mRNA de cuatro vectores shRNA transfectadas durante 48 h en las líneas celulares T24 se midieron por qPCR utilizando Lipofectamine 2000. la expresión Prx-I disminuyó en ~ 40%, 26%, 18% y 1% en el sh-1, sh -2, grupos SH-3 y con sh, respectivamente, en comparación con el grupo parental (Figura 4A). Para confirmar esta eficiencia de interferencia, los niveles de expresión de proteínas de Prx-I en las células T24 después de la transfección se examinaron por transferencia Western. Los resultados mostraron que los niveles de PRX-I disminuyeron significativamente por ~48%, 30%, 18% y 3% del valor basal en el SH-1, 2-SH, grupos SH-3 y CON SH, respectivamente (Figura 4B), lo que indica que la mayor eficiencia interferir en las células T24 estaba en el grupo SH-1 |
a:. la expresión de PRX-I mRNA fue examinado por qPCR. GAPDH sirvió como un control interno. B: Los niveles de proteína PRX-I se analizaron por Western blot después de la transfección. Sh-1 tratamiento condujo a una reducción significativa en la expresión de la proteína Prx-I en T-24 células. (El asterisco (*) indica P & lt; 0,05 en sh-1 grupo frente al grupo de los padres)
PRX-I inhibe la caída T-24 el crecimiento celular
Los efectos de PRX-I shRNA transfección sobre el crecimiento celular T24 fueron investigados a través de ensayos CCK8. Se observó una ligera inhibición en el crecimiento a las 24 h después de la transfección. Además, se observaron efectos inhibidores evidentes sobre la proliferación celular en Prx-I desmontables células a las 48 y 72 h, en comparación con los grupos SH de los padres y con (Figura 5, p & lt; 0,05), sugiriendo que la inhibición de la Prx-I podría suprimir crecimiento de las células T24 in vitro.
las tasas de crecimiento en PRX-I desmontables grupo se redujo significativamente, en comparación con los grupos SH de los padres y en contra, medido por el ensayo de CCK8.
Efecto de PRX-I shRNA transfección en el ciclo celular y la apoptosis de las células T-24
los efectos de PRX-I caída sobre la apoptosis y el ciclo celular de las células T24 fueron investigados. Después de 48 h de transfección, la tasa de apoptosis en el grupo SH-1 (21,99 ± 1,10%) fue significativamente mayor en comparación con el grupo con shRNA (4,51 ± 0,73%) y el grupo parental (4,96 ± 0,46%) (P & lt; 0,05) (Figura 6A). Análisis del ciclo celular mostró que la relación de fase G0 /G1 en el grupo SH-1 (61,13 ± 0,50%) fue significativamente mayor en comparación con el grupo con sh (49,62 ± 0,84%) y el grupo parental (48,03 ± 1,17%) (P & lt; 0,05) (Figura 6B)
a:. apoptosis-I Prx caída inducida en células T24. B:. Cuadros representativos de análisis FACS que muestra-I Prx caída inducida detención del ciclo celular G0 /G1 en las células T24 con la correspondiente disminución en las células en fase S (P & lt; 0,05) guía empresas
Efecto de Prx- I sobre NF-kB vía
Como se describió anteriormente, PRX-I está directamente enlazado al complejo NF-kB, que ha sido implicado en la vía de la proteína (Figura 2C). Para explorar si los efectos de la Prx-I en proteínas de señalización de apoptosis eran atribuibles a la inhibición de NF-kB, las formas activadas de p50 fosfo-NF-kB y p65 se examinaron mediante transferencia Western después de la transfección con Prx-I shRNA en células T24. se observó en la expresión de la proteína tanto de p50 fosfo-NF-kB y p65 en sh-1 grupo (Figura 7), en comparación con los grupos con SH y parentales, lo que indica que PRX-I; Una disminución significativa (0 · 05 P & lt) desmontables inhibido la activación de NF-kB P50 y p65 en células T24.
Una disminución significativa en la expresión de la proteína de ambos fosfo-p50 NF-kB y p65 en sh-1 grupo. (El asterisco (*) indica P & lt; 0,05 en sh-1 grupo frente al grupo de los padres)
Discusión
En nuestro estudio anterior, BI-TK /GCV se construyó y probó ser efectiva en inhibir el crecimiento progresivo del tumor de vejiga que estaba relacionado con la apoptosis in vivo [9], [10], lo que indica que BI-TK /GCV fue un sistema de éxito del tratamiento y puede proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento de cáncer de vejiga avanzado o metastásico en el futuro .
En este estudio, se utilizó un enfoque proteómico iTRAQ para identificar proteínas expresadas diferencialmente, con el objetivo de revelar los mecanismos moleculares y proporcionar el apoyo teórico para la eficacia del sistema BI-TK /GCV. iTRAQ identificado 402 proteínas expresadas diferencialmente en los tejidos de cáncer de vejiga después del tratamiento, incluyendo proteínas downregulated 192 y 210 proteínas upregulated. Las proteínas de orientación con abundancia diferencial (Tabla S1) juegan un papel fundamental en una serie de rutas celulares, incluyendo el metabolismo, la apoptosis, la actividad antioxidante, el ciclo celular, la proliferación, la transducción de señales y la adhesión celular. Aunque el mecanismo exacto por el que BI-TK /GCV llega a sus dianas intracelulares está claro, se supone que las proteínas de focalización de BI-TK /GCV a participar en la proliferación y la apoptosis de las células de cáncer de vejiga, y proporcionar nuevos objetivos para la terapia futura.
PRX-me quedé a cabo en nuestro análisis proteómico, ya que rara vez se había vinculado directamente con el cáncer de vejiga, aunque se ha mostrado abajo-expresa en tejidos de cáncer de vejiga después del tratamiento con BI-TK /GCV. La familia peroxiredoxin mamíferos (Prx) que consta de seis proteínas es H
2O
2 de barrido enzimas presentes en las células procariotas y eucariotas [11] - [13]. PRX-i pertenece al típico-2-Cys y es la isoforma más abundante y ubicua distribuida de PRDX [14], [15], que ha sido estrechamente relacionados con la proliferación y la diferenciación celular, la señalización redox intracelular, y la apoptosis [16] - [19]. PRX-I es altamente expresado en órganos sólidos y en los tejidos de algunos tipos de cáncer [20] -, y también se asocia positivamente con las tasas de recurrencia y progresión del cáncer de vejiga [24], [25]. Del mismo modo, Prx-I sobre-expresión se asocia con disminución de la supervivencia en general, pobres resultados clínicos, y la resistencia de las células cancerosas a la radioterapia y la quimioterapia [26] - [28], mientras que la baja expresión de Prx-I por RNAi se asocia con retos terapéuticos para el cáncer de hígado, cáncer de esófago y cáncer de tiroides [29] - [31]. En realidad, en base al análisis iTRAQ (Tabla S1), Western blot (Fig. 3A) y el análisis de IHC (Fig. 3B) en el presente estudio, Prx-I expresión disminuyó significativamente en tejidos de cáncer de vejiga después del tratamiento con BI-TK /GCV , lo que indica que Prx-I puede contribuir al efecto del tratamiento BI-TK /GCV en anti-crecimiento y pro-apoptosis de cáncer de vejiga. Desmontables de gen PRX-I por shRNA suprimió significativamente el crecimiento, la apoptosis promovida y regula el ciclo celular en células de cáncer de vejiga (Figura 6, 7). Estos resultados demuestran el papel positivo de PRX-I en el desarrollo de cáncer de vejiga. Suponemos que el sistema de tratamiento BI-TK /GCV es capaz de prevenir el crecimiento del tumor e inducir la apoptosis en el modelo de cáncer de vejiga de roedores por la expresión Prx-I-regulación hacia abajo. Pero, ¿qué vía de señalización es a través de
Afortunadamente, los vínculos entre Prk-I y el complejo de señalización NF-kB se han implicado en la vía de la proteína de la IPA (Figura 2C), que nos llevan a encontrar la pista . Prxs han sido implicados como factores clave de regulación en la señalización redox [32] - [34]. Prxs sea capaz de extinguir el segundo mensajero H
2O
2 e inhibir la transducción de señales mediante la activación del metabolismo de H
2O
2. Sobreoxidación de Prx de un ácido cisteína-sulfónico (Cys-SOH) a un ácido cisteinsulfınico (Cys-SO
2 H) puede detener el metabolismo de H
2O
2, lo que permite la acumulación de H
2O
2 la concentración y la propagación de la transducción de señales. Reducción de la Cys-Cys-SO2H a SOH se logra a través de las acciones de sulfirredoxina, que restaura mediada por Prx H
2O
2 metabolismo [35] - [37]. Prx1 citoplasmática regula H
2O
2-dependiente de la activación de NF-kB y la translocación nuclear y Prx1 nuclear regula NF-kB /unión al ADN mediante la eliminación de H
2O
2 como un oxidante subunidad p50 [ ,,,0],38]. Prx1 mejora la ciclooxigenasa p65 mediada (COX) -2 la expresión génica en los receptores de estrógenos (ER) de las células de cáncer de mama humanos deficientes (MDA-MB-231), y desmontables de Prx-I pueden atenuar COX-2 expresión mediante la reducción de la ocupación de NF -κB en su elemento promotor aguas arriba, lo que indica que PRX-I actúa como un chaperón para mejorar el potencial de transactivación de NF-kappaB en células de cáncer ER-deficientes de mama [39]. En realidad, en el presente estudio, desmontables de Prx-I reduce expresiones de proteínas de fosfo-NF-kB p50 y p65, y por lo tanto suprime el crecimiento, promueve la apoptosis y regula el ciclo celular de células de cáncer de vejiga mediante la inhibición de la ruta de NF-kB, que se ajusten a la red IPA (Figura 2C).
Conclusiones
en conjunto, hemos identificado que PRX-I junto con la ruta de NF-kB contribuyó al cáncer de vejiga por primera vez. El sistema de tratamiento de BI-TK /GCV exhibió un crecimiento de la actividad antitumoral sostenible y la apoptosis inducida en tejidos de cáncer de vejiga mediante la inhibición de PRX-I a través de la ruta de NF-kB. Nuestra investigación ofrece una nueva visión en el tratamiento del cáncer de vejiga e indica que el sistema de tratamiento GCV por la orientación al BI-TK /PRX-I puede ser una nueva estrategia terapéutica en el futuro.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Análisis FODA iTRAQ de proteínas expresadas diferencialmente en el grupo de solución salina normal (iTRAQ 114), grupo BI-TK (iTRAQ 115), BI pGEX-1 grupo /iTRAQ (116) y el grupo BI (117) guía iTRAQ doi.: 10.1371 /journal.pone.0098764.s001 gratis (DOCX)