Extracto
Antecedentes
cáncer de ovario
epitelial del Paciente (EOC) es la neoplasia ginecológica más letal en el Estados Unidos. Desafortunadamente, una prueba de biomarcador-detección de la proteína validado para detectar la enfermedad en estadio temprano de la sangre periférica aún no se ha desarrollado. La presente investigación se evalúa la capacidad para identificar las proteínas relevantes tumorales a partir de fluidos proximales de cáncer de ovario, incluyendo el tejido fluido intersticial (TIF) y ascitis correspondientes, de pacientes con EOC seroso papilar y traduce estos resultados para los inmunoensayos basados en sangre objetivo.
Metodología /Principales conclusiones
en combinación TIF y ascitis recogida de cuatro pacientes con EOC papilares serosos en el momento de la cirugía se sometió a immunodepletion, la resolución por electroforesis en gel 1D y en la digestión-gel para el análisis por espectrometría de masas en tandem con cromatografía líquida, que dio lugar a una identificación total de 569 y 171 proteínas de TIF y ascitis, respectivamente. De éstos, peroxiredoxin I (Prdx1) fue seleccionado para la validación en el suero por ELISA y demostró estar presente y significativamente elevados (p = 0,0188) en 20 pacientes EOC con un nivel medio de 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) en comparación con 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) de 16 pacientes con patología ovárica normal /benigna.
Conclusiones /Importancia
Hemos utilizado un flujo de trabajo para la recolección de fluidos biológicos proximales EOC-relevante, incluyendo TIF y ascitis, para el análisis proteómico. Entre las proteínas diferencialmente abundantes identificados a partir de estos fluidos proximales, Prdx1 se demostró que estar presente en el suero y se muestra por ELISA para ser elevado en casi 6 veces en pacientes EOC papilares serosos en relación con los pacientes normales /benignos. Nuestros resultados demuestran la capacidad fácil de descubrir potenciales proteínas EOC-relevantes en los fluidos proximales y confirmar su presencia en el suero de la sangre periférica. Además, nuestro hallazgo de niveles elevados de Prdx1 en el suero de pacientes con EOC frente a los pacientes normales /benignos garantiza una evaluación posterior como biomarcador específico de tumor de EOC
Visto:. Hoskins ER, Capucha BL, Sol M, Krivak TC, Edwards RP, Conrads TP (2011) Análisis proteómico de cáncer ovárico proximales Fluidos: Validación de elevada peroxiredoxina 1 en la circulación periférica del paciente. PLoS ONE 6 (9): e25056. doi: 10.1371 /journal.pone.0025056
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Junio, 2011; Aceptado: 23 Agosto 2011; Publicado: 30 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Hoskins et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue proporcionada por el programa de Proyectos Fundación Scaife piloto. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aproximadamente 22.220 mujeres son diagnosticadas cada año con cáncer de ovario epitelial (EOC) y más de 13.000 sucumben a esta enfermedad [1]. Las mujeres con EOC tienen una tasa de supervivencia a 5 años del 18-34%, donde el mal pronóstico se debe principalmente al hecho de que la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad en estadio avanzado [2]. La detección de la enfermedad en estadio temprano con una prueba de detección óptima tendría un impacto positivo sobre la supervivencia global; Sin embargo, no hay biomarcadores disponibles que son suficientemente sensibles o específicos para el despliegue de un ensayo adecuado para ser de utilidad para el cribado de la población general. La mucina 16, también conocida como antígeno de cáncer (CA) -125, fue descubierto por la producción de anticuerpos de xenoinjertos de tumores [3] y se detecta fácilmente en suero. Un inmunoensayo CA-125 aprobado por la FDA está actualmente en uso para monitorizar la respuesta al tratamiento quimioterápico la enfermedad y la recurrencia; Sin embargo, la medición de CA-125 es ineficaz para el cribado (un uso off-label) de EOC en la población general [4]. Mientras que la inmunodetección de antígenos asociados a tumores ha contribuido al conocimiento de la historia natural de la enfermedad, sus medidas no han identificado consistentemente EOC etapa temprana.
Alto rendimiento de análisis de expresión génica del tejido ovárico normal en comparación con el COE cuenta reveló firmas genéticas únicas expresadas en EOC. A pesar de estas firmas han proporcionado una mayor comprensión de la biología molecular del COE, la expresión de genes no se correlaciona necesariamente con la abundancia de proteínas [5], en particular en la sangre periférica, que representa la fuente de muestra clínicamente más relevante para el desarrollo de ensayos de rutina y medición [6]. Mientras perfiles proteómicos de suero representa un enfoque atractivo para el descubrimiento de biomarcadores, esta estrategia es analíticamente reto debido a la alta gama dinámica de la concentración de proteína en esta muestra, que impide descubrimiento de menor abundancia, las proteínas relacionadas con el tumor. Derivada de los retos inherentes analíticos relacionados con la proteómica suero, fluidos proximales han ganado cada vez más la atención de la realización de descubrimiento de biomarcadores de proteína candidata [7]. En el caso de EOC, ascitis representa una fuente de la muestra atractiva para el descubrimiento candidato ya que baña las células de cáncer no adherentes y las células mesoteliales adyacentes y contiene abundante información incluyendo el crecimiento, la supervivencia y factores de señalización metástasis [8]. Mientras que la ascitis es un medio importante para la realización de investigaciones de descubrimiento de biomarcadores de proteínas, al igual que el suero, también contiene proteínas presentes en una alta gama dinámica de concentración que requiere diversas técnicas de fraccionamiento a fin de identificar las proteínas de baja abundancia [9].
tejido líquido intersticial (TIF) es otra muestra que se ha ganado una creciente atención como un sustrato a partir del cual el descubrimiento de biomarcadores de proteínas candidato de tejido tumoral puede llevarse a cabo. Tejido líquido intersticial es una rica fuente de proteínas de la muestra que se planteó la hipótesis de que contienen secretada, arrojar y /o effluxed proteínas del estroma tumoral y la vecina. Celis et al. fueron los primeros en investigar las proteínas de cáncer de mama y TIF normal [10], donde se demostró que las proteínas identificadas por la proteómica basadas en MS podrían ser validados externamente en un microarray de tejido que contiene más de 70 muestras de tejidos de carcinoma de mama [11]. En una investigación más reciente, un flujo de trabajo basado en la proteómica-MS para la identificación de proteínas diferencialmente abundantes en el carcinoma de células renales (RCC) demostró niveles elevados de enolasa 2 (ENO2) y trombospondina-1 (TSP1) en TIF tumor. Estos también se verificaron como presente y en abundancia elevada en muestras de suero de pacientes de RCC en comparación con el control de suero [12]. Esta investigación demostró que las proteínas descubiertas en TIF poseen una alta propensión a la traducción de los ensayos basados en suero.
En el presente estudio, se utilizó un flujo de trabajo de la proteómica basada en MS para identificar las proteínas específicas de tumor de TIF y ascitis del COE pacientes. Entre las proteínas diferencialmente abundantes identificados a partir de estos fluidos proximales, peroxirredoxina 1 (Prdx1) se demostró que estar presente en el suero y se muestra por ELISA para ser elevado en casi 6 veces en pacientes EOC papilares serosos en relación con los pacientes normales /benignos. Nuestro estudio añade más apoyo a la hipótesis de que el TIF representa un biofluid proximal atractiva para la realización de descubrimiento candidato biomarcador para la detección temprana eventual del COE.
Resultados
El contenido de proteína recuperada de TIF y ascitis se visualizado mediante resolución sobre un gel 1D-PAGE (Figura 1). Una cantidad significativa de albúmina de suero humano (HSA) estaba presente en ambas muestras, aunque a niveles más bajos en TIF de ascitis. Este mayor nivel de HSA en la ascitis es significativo, ya que efectivamente aumenta el rango dinámico total de la concentración de proteínas entre las más altas (por ejemplo, HSA) y las proteínas más bajo abundantes en este tipo de muestras. Una mayor representación del proteoma es evidente en la muestra TIF debido a la contribución global inferior de HSA para el contenido total de proteínas. Teniendo en cuenta la diferente contribución de HSA en estas dos muestras, nuestra investigación utiliza un protocolo basado en immunodepletion afinidad para eliminar las proteínas de suero altamente abundantes clásicos presentes en cada muestra. Esta metodología resultó en una eliminación eficiente de un número de proteínas muy abundantes, como se muestra para una muestra TIF (Figura 1), lo que permite una comparación más completa del contenido proteómico de ascitis y TIF siguiente análisis LC-MS /MS.
(a) ascitis representativos y muestras TIF que ilustran la presencia de especies de proteínas abundantes en las dos muestras, así como la complejidad de la muestra TIF cosechado. (B) Una muestra representativa TIF antes y después de immunodepletion con la columna de inmunoafinidad Agilent MARS Hu-14.
ascitis por pares y el TIF se recogieron de los cuatro pacientes (tabla 1), immunodepleted y cantidades equivalentes de proteínas cada uno resuelto por 1D-PAGE. Cada carril de gel se cortó en cinco rebanadas equivalentes, en-gel digerido y las digestiones de péptidos se analizó por LC-MS /MS por duplicado, dando como resultado 10.274 proteínas identificadas en todas las muestras, incluyendo los identificados por un único péptido. Elegimos para imponer un criterio de exclusión de tal manera que sólo aquellas proteínas representadas por dos cargos espectrales o más a través de las cuatro muestras de pacientes de TIF o ascitis fueron retenidos para el análisis comparativo de los datos proteómicos, que dio lugar a un conjunto de datos compuesta por 569 y 171 proteínas identificados en las cuatro muestras de pacientes TIF y ascitis, respectivamente (Tabla S1; los archivos de datos de LC-MS /MS primas están disponibles para su descarga desde el repositorio de datos al Tramo https://proteomecommons.org/tranche/). Ingenuity Pathway Analysis anotación de la localización celular de las proteínas identificadas reveló un gran enriquecimiento en proteínas y derivados cytoplasmic--nucleares en TIF relativa a la ascitis (Figura 2). No es sorprendente que una alta proporción de proteínas extracelulares estaban presentes en ascitis en comparación con TIF. Las proteínas extracelulares dominaron las proteínas comunes identificadas, con la gran mayoría derivados de ascitis. proteínas subcelulares generalmente originados de TIF; estas proteínas se presentó en mayor concentración en formato TIF con niveles disminuidos de ascitis. Esta diferencia de contraste en el origen de localización celular sugiere que TIF contiene proteínas altamente reflectantes de la composición celular del microambiente del tejido.
Tissue líquido intersticial y las proteínas de ascitis que fueron identificados por dos o más recuentos espectrales en cada biofluido, respetuosamente, se analizaron para la compartimentación celular con ingenio Pathway Analysis (IPA). Casi 85% de las proteínas TIF se originó en el citoplasma y /o núcleo. Ascitis tenían un perfil de proteína de suero-como el 66% de las proteínas son de origen extracelular.
Entre las proteínas identificadas, peroxiredoxin 1 (Prdx1) fue identificado en mayor abundancia (un promedio de 13 -fold mayor recuento espectral) en muestras de TIF en comparación con ascitis. Se confirmó la presencia y abundancia de diferencial Prdx1 en ambas muestras biológicas por western blot (Figura 3). Mientras PDRX1 se identificó y estudió en el tejido de forma rutinaria, hemos tratado de determinar si la abundancia de Prdx1 fue elevado en el suero de una cohorte ingenuo (por ejemplo, no es parte de nuestro conjunto descubrimiento original) de 20 pacientes con estadio II o superior EOC (Tabla 2) en comparación con los pacientes con una patología benigna de ovario (Tabla 3). El nivel medio de Prdx1 de estos 20 pacientes de EOC se determinó que era 26,0 ng /mL (± 9,27 SEM) y 4,19 ng /mL (± 2,58 SEM) de las 16 de control /poblaciones ováricos benignos como se mide utilizando un PDRX1 ELISA disponible en el mercado. Este aproximada de 6 veces mayor abundancia de PDRX1 en el suero de pacientes con EOC se encontró que era estadísticamente significativa (Figura 4, p = 0,0188).
1 peroxiredoxina verificación a través de Western blot en la ascitis (A) y TIF ( B) recapitula los resultados obtenidos por el conde espectral (SC) los valores medidos de la cromatografía-espectrometría de masas en tándem análisis de líquido de estas muestras.
el suero de 20 pacientes con diagnóstico de Estadio IIC o de ovario superior ( casos) y suero de 20 pacientes con patología benigna de ovario (controles) se evaluó para la presencia y cantidad PDRX1 por ELISA. Hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los niveles medios PDRX1 (p = 0,0188) en los dos grupos.
Discusión
Presentación con plenitud abdominal, saciedad temprana , una masa pélvica y ascitis es típico para las mujeres con EOC, por desgracia, sin embargo, estos síntomas a menudo se presentan sólo cuando la enfermedad está muy avanzada en el escenario. Una prueba de detección para detectar el cáncer de ovario en estadio temprano, cuando la supervivencia a 5 años es casi el 70-90% [13], aún no se ha desarrollado. La baja incidencia de EOC etapa temprana impide amplio estudio de la patogénesis de la enfermedad, por lo que se presenta con mayor investigación en la enfermedad en etapa tardía. Se identificaron las mujeres con EOC avanzada y recogieron ascitis pareadas y TIF de los tumores de cáncer de ovario de cada paciente para el análisis proteómico. Ascitis y TIF fueron immunodepleted de muy abundantes proteínas antes del análisis LC-MS /MS. Nuestros datos revelaron que la ascitis y el puerto TIF muy diferentes perfiles de proteínas. Ascitis posee características proteómicos similares a la de suero, siendo compuestas en gran parte de las proteínas derivadas de el compartimiento extracelular. Por el contrario, TIF se compone de proteínas más representativo de un microambiente del tejido, con muchos derivados de diversos compartimentos de las células.
En nuestro análisis, se identificaron 569 proteínas en común entre todas las muestras de pacientes TIF, en comparación con 171 proteínas comúnmente identificado en correspondiente fluido de ascitis. Entre estos, Prdx1 fue identificado en mayor abundancia en muestras de TIF en comparación con ascitis. TIF es la hipótesis de contener una concentración relativa más alta de proteínas derivadas a través pasivo /enzimática vertimiento, secreción, flujo de salida y la apoptosis. En una manera similar, estos mismos procesos probablemente resultaría en "fuga" de algunas o todas de estas mismas proteínas en la vasculatura y la circulación periférica. El mayor nivel de Prdx1 en formato TIF en relación con ascitis observada no es inesperado para biológicamente múltiples y motivos relacionados analíticamente. Desde un punto de vista biológico, TIF se deriva en gran parte del microambiente del tumor y por lo tanto probable que contenga concentraciones relativas más altas de proteínas tumorales /estroma derivadas en comparación con otros fluidos corporales periféricos, tales como ascitis y suero. La consecuencia de esta diferencia en el rango dinámico de concentración de proteína entre estos fluidos corporales reduce eficazmente la gama dinámica de la concentración de proteína en la ascitis y /o suero en comparación con TIF. Por estas razones, la inclusión de fluidos proximales como TIF en las investigaciones de descubrimiento de biomarcadores basados en proteómica representa una nueva estrategia para la recolección arrojar y secretada proteínas proximal al microambiente del tejido tumoral cuya presencia es probable que se refleja en el suero de los mismos pacientes.
Prdx1 es una proteína derivada de tejido ubicua con función conocida como un antioxidante. Prdx1 protege principalmente las células del daño de ADN y el potencial mutagénesis por alcoholes que forman siguientes reacción enzimática con especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo [14]. Prdx1 es de particular interés debido a su elevado nivel conocido de la expresión génica en numerosos tipos de cáncer [15], [16]. presencia Prdx1 en carcinomas se asocia con la inhibición de la apoptosis, lo que equivale a un aumento de la supervivencia del tumor [16], [17], [18]. Si bien hay datos limitados con respecto a Prdx1 y sus efectos en la EOC patogénesis y los resultados clínicos, Chung et al. han propuesto que la expresión Prdx1 en EOC es un indicador pronóstico de la disminución de la supervivencia [19]. Además, se cree que varios otros miembros de la familia peroxirredoxina (PRDX2-6) estar relacionado con la carcinogénesis ovárica, cuando éstas se han notificado a ser elevados en los tumores de ovario borderline en comparación con las lesiones benignas de ovario [20]. Maxwell et al. llevado a cabo recientemente un amplio análisis proteómico escala de láser microdissected tejido cáncer de endometrio y señaló que incluso la etapa I de endometrio cánceres tenían niveles elevados de proteínas involucradas en el estrés oxidativo y la inflamación en comparación con endometrio normal. Prdx1 fue una de las proteínas de estrés oxidativo que fue validado ser significativamente elevados en la etapa I del tejido cáncer de endometrio [21]. En el presente estudio, la presencia de Prdx1 en formato TIF y ascitis de pacientes con cáncer de ovario se verificó mediante western blot para ser elevado en abundancia en TIF en comparación con ascitis. Basado en la hipótesis de que un subconjunto de proteínas TIF representan vertido /proteínas secretadas desde el microambiente y por lo tanto puede ser intercambiable, y por lo tanto detectable, dentro de la sangre periférica, se intentó determinar los niveles de Prdx1 en el suero sanguíneo usando un altamente validado, disponible comercialmente ELISA. Estos resultados demostraron que los pacientes con EOC avanzado tenían un nivel elevado 6 veces de Prdx1 en su suero en comparación con los pacientes con ovarios normales /benignos (p = 0,0188).
Aunque Prdx1 no se ha informado anteriormente de estar presente en el suero, basado en la hipótesis de que algunos (si no todas) las proteínas TIF son intercambiables con la circulación periférica, se utilizó un enfoque basado en ELISA el fin de comprobar primero esta hipótesis y en segundo lugar a la pregunta de si esta proteína es diferencialmente abundante en el suero de los pacientes con EOC, en comparación con los individuos con patologías benignas del ovario. Hemos limitado esta validación externa de Prdx1 al suero ya que los niveles elevados de Prdx1 ya han sido demostrados en el tejido de cáncer de ovario por Western Blot e inmunohistoquímica [19]. Idealmente, es probable que necesitan paneles de biomarcadores seleccionados con el fin de desarrollar una prueba de detección validado para la detección EOC temprana [22], nuestro único objetivo era demostrar la viabilidad de la traducción de los descubrimientos proteómicos basados en MS de TIF en ensayos basados en suero específico, en Prdx1 este caso. Reconocemos que no podemos concluir que Prdx1 es suficientemente sensible y específico para ser considerado como un biomarcador de cribado para EOC basado en nuestra cohorte muestra de validación limitada, sin embargo, que es detectable y elevados en el suero del paciente de cáncer de ovario en comparación controles benignos emparejados proporciona apoyo adicional evidencia para la hipótesis de que los candidatos de proteínas descubiertas en TIF son propensos a estar presentes en la circulación periférica.
Materiales y Métodos
Selección de pacientes
la investigación se realizó en la Universidad de Pittsburgh Junta de Revisión institucional aprobó el protocolo#IRB0406147. Todas las muestras se obtuvieron después de la revisión del consentimiento informado por escrito y se des-identificados en el ordeño y analizados de forma anónima. colección intraoperatoria de tumor, ascitis y suero eran de pacientes con sospecha de cáncer de ovario en el momento de la cirugía inicial y ocurrió dentro de 30 min de la extirpación quirúrgica. Todos los pacientes eran quimioterapia y la radioterapia ingenuo. Se seleccionaron pacientes con EOC avanzado (estadio IIC o mayor) y el subtipo de carcinoma de ovario seroso papilar patología probada para el procesamiento y análisis de muestras. El suero utilizado para la validación de Prdx1 se deriva de una base de datos interna de los pacientes de-identificado clasificados con EOC o patología ovárico benigno. Clinicopathological detalles de estos pacientes se limitan a su historia ginecológica.
Tratamiento de la muestra
Para el tratamiento de los TIF, aproximadamente 0,25-0,50 gramos de peso húmedo de tejido obtenido en la cirugía de inmediato se lavó dos veces para 5 min con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los tejidos fueron incubadas en 1 ml de PBS durante 1 h a 37 ° C. Después de la incubación, se retiró el tejido y el sobrenadante se aclaró TIF de restos celulares por centrifugación a 1000
× g
durante 2 min y se almacenó a -80 ° C. ascitis muestras se dividieron en alícuotas en tubos de microcentrífuga, aclararon en 1000
xg
durante 2 min y se almacenaron a -80 ° C. La proteína total en las muestras de TIF y ascitis se cuantificó por el (BCA) ensayo bicinconínico (Pierce, Rockville, IL). Las muestras se concentraron usando Microcon-3 dispositivos de filtro centrífugos (Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante y se sometió a immunodepletion de las 14 proteínas de suero más abundantes utilizando el sistema de eliminación de Affinity múltiple (Hu-14, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, con la sustitución de un tampón de dilución de la muestra 4 × en lugar de la 1 x tampón para prevenir la pérdida de la muestra debido a la extensa concentración del TIF y ascitis. Las muestras TIF y ascitis empobrecido se intercambiaron en bicarbonato de amonio 25 mM y la proteína se cuantificó mediante el ensayo BCA. Se recogieron muestras de sangre correspondientes en rojo-top tubos de recogida venosa vacutainer (Becton, Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ), permite coagular a temperatura ambiente durante 45 min, se centrifuga a 2200
× g durante 10 min
para recoger el suero y alícuotas y se almacenaron a -80 ° C.
en-gel digestión Protocolo
Diez microgramos cada una de ascitis o TIF se resolvieron mediante bandas 1D-PAGE y en gel se visualizaron por Coomassie azul. Cinco bandas de gel fueron extirpados de manera uniforme en todas las muestras y se destiñeron en bicarbonato de amonio 25 mM, 50% ACN. cortes de gel se redujeron con DTT 10 mM a 56 ° C durante 1 h seguido de alquilación con yodoacetamida 55 mM durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se digirieron con tripsina durante la noche y los péptidos fueron extraídos de bandas de gel con ácido fórmico /5% 70% ACN. Todas las muestras se liofilizaron a sequedad y se volvieron a suspender en ácido trifluoroacético al 0,1% antes del análisis por cromatografía líquida (LC) -tandem espectrometría de masas (MS /MS).
espectrometría de masas y análisis bioinformáticos
La extractos peptídicos de cada banda muestra de gel se analizaron por duplicado en un 3000 sistema de cromatografía de líquidos de Dionex último (Dionex, Sunnyvale, CA) acoplado en línea a través de ionización por electrospray a una trampa de iones lineal (LTQ) MS (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Las separaciones se realizaron con 75 micras de id × 360 OD m × 20 cm de largo fusionados columnas capilares de sílice (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) suspensión envasados en casa con 5 micras, 300 un tamaño de poro C-18 de fase estacionaria de sílice-consolidado (Júpiter, Phenomenex, Torrance, CA). Después de la inyección de la muestra en una precolumna C-18 (Dionex), la columna se lavó durante 3 min con fase móvil (acetonitrilo 2%, 0,1% de ácido fórmico) A a una velocidad de flujo de 30 l /min. Los péptidos se eluyeron usando un gradiente lineal de fase móvil B 0,33% (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo) /minutos para 130 min, luego a 95% B en 15 min adicionales, todo a un caudal constante de 200 nL /min. lavado en columna se realizó en 95% de B durante 15 min para todos los análisis después de lo cual la columna se volvió a equilibrar en la fase móvil A antes de las inyecciones posteriores. La MS se hizo funcionar en un modo MS /MS dependiente de los datos en el que cada MS de barrido completo fue seguido por siete MS scans /MS se realizan en la trampa de iones lineal (LIT), donde se seleccionaron los siete iones moleculares más abundante de péptidos para inducida por colisión disociación (CID) usando una energía de colisión normalizada del 35%. Los datos se recogieron en un rango de exploración de selección ion precursor amplio (
m /z
375-1.800) y se habilitan exclusión dinámica para reducir al mínimo la selección redundante de péptidos seleccionados previamente para CID
. Los espectros de masas
Tandem se realizaron búsquedas en la base de datos UniProt proteína humana (11/09 liberación) del Instituto Europeo de Bioinformática (http://www.ebi.ac.uk/integr8), utilizando SEQUEST (Bioworks 3.3.1, ThermoFisher Scientific). Los criterios de búsqueda se establecieron de la siguiente manera: los péptidos se buscaron plenamente tríptico con hasta dos perdimos sitios de escisión, modificaciones dinámicas de la oxidación de metionina (15,9949 Da) y carboxiamidometilación cisteína (57,0215 Da), precursor de tolerancia de masa de 1,4 Da y de iones fragmento de la tolerancia de 0,5 Da . Los péptidos identificados se consideraron legítimamente si cumplían estado de carga específica y la escisión proteolítica dependiente de las puntuaciones de correlación cruzada de 1,9 para [M + H]
1 +, 2.2 para [M + 2H]
2 + y 3,5 para [M + 3H]
3+, y una correlación delta mínimo de 0,08. Una tasa de descubrimiento péptido falsa de menos de 2% se determinó mediante la búsqueda en el tándem primaria MS datos utilizando los mismos criterios contra una base de datos de señuelo en el que las secuencias de la proteína se invierten [5]. Los resultados fueron filtrados utilizando el software de desarrollo propio, y las diferencias en la abundancia de proteínas entre muestras se obtuvieron sumando los eventos CID totales que dieron lugar a un péptido identificado positivamente para una determinada accesión de proteínas en todas las muestras (recuento espectral) [23].
Análisis Western Blot
Diez g de proteína total de cada muestra fue resuelto por 1D-PAGE utilizando geles NuPAGE 4-12% 7% Tris-acetato (Invitrogen Carlsbad, CA) Bis-Tris o y se transfirió a membranas de PVDF Immobilon-PSQ (Millipore) utilizando el Módulo Blot Invitrogen XCell II según el protocolo del fabricante. El anticuerpo primario era monoclonal de rata Prdx1 anti-humano (Abcam, Cambridge, MA) y el anticuerpo secundario fue conjugado de peroxidasa de rábano burro anti-rata (Abcam Cambridge, MA), pre-absorción con suero. Las membranas se bloquearon con 0,5% de leche seca con TBS con 0,1% de Tween-20 (TBST) como diluyente. El anticuerpo primario se aplica en 1:1000 en TBST y las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario (1:75,000 dilución) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con Pico Super Señal ECL (ThermoFisher) durante 5 min antes de la exposición quimioluminiscente.
peroxiredoxina 1 ELISA
Los niveles de abundancia de Prdx1 en sueros de pacientes se midieron utilizando la peroxiredoxin 1 ELISA Human kit (BioVendor, Candler, NC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero de pacientes con cáncer de ovario y patología benigna se diluyeron 1:03 antes de la medición y se ensayaron simultáneamente y por duplicado. Las diluciones en serie de la norma Prdx1 se ensayaron en paralelo con las muestras de suero. La densidad óptica se representa frente a las concentraciones de Prdx1 estándar para generar la curva estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizó una prueba de suma de rangos no paramétrica de Wilcoxon para determinar la significación de la diferencia entre las cantidades PDRX1 la mediana en el suero de pacientes con patología benigna de ovario en comparación con pacientes con EOC avanzada. La hipótesis nula es que los datos de los dos grupos de observación son muestras independientes de distribuciones continuas idénticas con medianas iguales en contra de la hipótesis alternativa, que los grupos no tienen los mismos puntos medios. La significancia se aceptó a un valor de p & lt de dos colas;. 0.05
Apoyo a la Información sobre Table S1.
proteínas identificadas a partir de ascitis acertaron cuatro epiteliales de pacientes de cáncer de ovario y el líquido intersticial del tejido (TIF). La lista de proteínas identificaciones (filas) representan los recuentos espectrales sumadas (valores) de los análisis de la ascitis y TIF, cada uno de los cuales se resolvieron por electroforesis en gel de desnaturalización de las que cinco bandas de gel estaban en gel digerido y analizado por duplicado mediante cromatografía de tándem líquido espectrometría de masas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025056.s001 gratis (XLS)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Christopher Vanselow, Maria Vandamme y Agilent Technologies para la 4 x tampón a formulación usada en el protocolo de agotamiento MARS. Los autores también desean agradecer el valioso aporte de los árbitros anónimos a través de la revisión externa de este artículo.