Extracto
heterogeneidad celular juega un papel fundamental en una variedad de procesos funcionales in vivo, incluyendo la carcinogénesis. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de las diferencias de diversidad y cómo la célula a célula en las células individuales se manifiestan en alteraciones a nivel de la población sigue siendo muy limitado, principalmente debido a la falta de herramientas adecuadas que permitan a los estudios a nivel de una sola célula. Se presenta un estudio sobre los cambios en la heterogeneidad celular en el contexto de la progresión de pre-malignas en respuesta al estrés hipóxico. Utilizando la progresión de pre-malignas de esófago de Barrett (EB) como un sistema modelo de enfermedad que estudiamos los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la metaplasia de displásicos etapa (pre-cancerosos). Se utilizaron los métodos que permitan mediciones de diferencias de célula a célula en el número de copias de ADN mitocondrial, los niveles de expresión de un conjunto de genes mitocondriales y nucleares implicados en las vías de respuesta a la hipoxia, y el potencial de membrana mitocondrial de nuevo desarrollo. En contraste con los estudios de células a granel se informó anteriormente, nuestro estudio muestra diferencias significativas entre metaplásico y displásicos ser células de ambos valores medios y las distribuciones de los parámetros de una sola célula de ADNmt número de copias, la función mitocondrial, y los niveles de expresión de mRNA de los genes estudiados. Con base en el análisis de datos de una sola célula, proponemos que las mitocondrias pueden ser uno de los factores clave en la progresión premalignas en BE
Visto:. Wang J, Shi X, Johnson RH, Kelbauskas L, Zhang W, Meldrum DR (2013) Análisis unicelular revela manifestación temprana del fenotipo canceroso en células esofágicas premalignas. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10.1371 /journal.pone.0075365
Editor: Nagendra Yadava, Escuela /Universidad de la Universidad de Massachusetts-Amherst de Medicina de Tufts, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de Junio, 2013; Aceptado: August 12, 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos provinieron de los Institutos nacionales de Salud (NIH), Instituto Nacional de Investigación del Genoma humano (NHGRI), Centro de Excelencia en Ciencias Genómicas (CEGS) y microescala Life Sciences Center subvención No. 5 P50 HG002360 (DRM PI) http: //www.genome .gov /. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el adenocarcinoma de esófago (EAC) es un tipo de cáncer altamente letal y se cree que se desarrolla a partir de células epiteliales del esófago a través de una compleja serie de transformaciones graduales a nivel biomolecular [1] - [6]. Una vez transformado, las células EAC producen niveles significativamente más altos de moléculas antioxidantes haciéndolos resistentes a niveles elevados de especies de oxígeno reactivas (ROS) [2]. Aunque los estudios recientes han demostrado que la secuencia de transformación consiste en el desarrollo de la hiperplasia y metaplasia causada por la inflamación crónica del epitelio esofágico escamoso, seguido de displasia multifocal, carcinoma
in situ
y, por último, invasor EAC [1], [7], [8], el mecanismo molecular detallado que subyace a esta transformación queda por aclarar
la hipoxia juega un papel fundamental en el cáncer [9] -. [16]. Al igual que en los tumores casi todos sólidos, suministro de oxígeno a las células de cáncer se ve comprometida en gran medida debido al crecimiento celular descontrolado y desarrollo inadecuado de la microvasculatura. La mitocondria, la central eléctrica de la célula y la principal fuente de adenosina trifosfato (ATP) en las células normales, es el lugar donde la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) se lleva a cabo. Las mitocondrias también se han encontrado para jugar un papel importante en la muerte celular programada, o apoptosis, y su disfunción está asociada con una variedad de enfermedades. Por ejemplo, las variaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) del número de copias se han asociado no sólo con diferentes condiciones fisiológicas celulares sino también con diversos cambios de microambientes internos y externos [17], [18]. Se ha demostrado que las mitocondrias pueden generar mayores niveles de ROS durante la hipoxia [19], lo que condujo al postulado de que las mitocondrias, el objetivo principal para el daño oxidativo, puede funcionar como un sensor de oxígeno endógeno
.
Una de las los factores más importantes que determinan la respuesta al fármaco y la agresividad de los tumores es la gran heterogeneidad intratumoral. Estudios recientes han demostrado que incluso las células en una población clonal o tejido aparentemente homogénea exhiben variabilidad sustancial de características diferentes que van desde los niveles de expresión de genes a las características fenotípicas [20] - [22]. Está ampliamente aceptado que la heterogeneidad mitocondrial, incluyendo variaciones en el ADNmt número de copias, la mutación del ADN /agotamiento, expresión y regulación de los genes codificados por el ADNmt y los niveles de actividad, es un importante contribuyente a la complejidad mitocondrial y contribuye a la heterogeneidad general célula-célula [23] - [25]
la mayoría de las técnicas de bioanálisis actuales recogen datos usando miles de millones de células, inherentemente proporcionar resultados promediados sobre una población de células grandes.. Tales enfoques de células granel potencialmente podrían perder información importante y valiosa cuando se trata de sistemas muy heterogéneos [26] como el cáncer [27]. Por lo tanto, el desarrollo y la aplicación de técnicas capaces de realizar análisis a nivel de células individuales son críticos, no sólo para una mejor comprensión de los procesos celulares básicos, sino también para los nuevos, las estrategias más eficaces para la prevención de enfermedades, manejo y tratamiento [28 ] - [31].
En este estudio utilizamos dos inmortalizada de Barrett humana esofágico líneas celulares epiteliales CP-A y CP-C que se deriva originalmente de pacientes con esófago de Barrett (EB) sin displasia y con displasia, respectivamente [32]. Aunque ambos son células epiteliales no malignas, se encontró que las células CP-C eran más resistentes al estrés oxidativo inducido por el ácido biliar (ácido quenodesoxicólico (CDCA)) que CP-A, lo que sugiere que, al menos con respecto a la respuesta de ácido, CP- células C se comportan más como líneas celulares de cáncer de esófago en comparación con células CP-a [2]. En este estudio, nuestro objetivo es dilucidar los posibles mecanismos que conducen a la transformación maligna en BE mediante la cuantificación de las diferencias en la forma en que las células responden al estrés oxidativo causado por la hipoxia. Hemos aplicado una técnica basada en qPCR desarrollado en nuestro laboratorio para determinar el número de copias de ADNmt y los niveles de expresión de genes mitocondriales y nucleares en células individuales. Utilizando el análisis de una sola célula distinguimos las diferencias en el número de copias de ADNmt, potencial de membrana mitocondrial, y respuesta a la hipoxia niveles de expresión génica entre CP-A y células CP-C, que no se pueden predecir por análisis de células a granel. La aplicación de estos nuevos métodos, junto con una sola célula de O
2 mediciones de consumo de [33] - [35], permitió la caracterización de las diferencias de respuesta a la hipoxia sutiles entre CP-A y células CP-C. Una mejor comprensión de las bases moleculares de la iniciación y el desarrollo de la CAO facilitará los esfuerzos para definir posibles dianas terapéuticas.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamiento de hipoxia
esófago de Barrett líneas de células epiteliales CP-a y CP-C se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en Gibco® de queratinocitos libre de suero medio (SFM) medio de crecimiento celular (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado con hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) a 5,0 g /L, BPE (extracto de pituitaria bovina) en 50 mg /L y penicilina /estreptomicina solución (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 100/100 mg /ml en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C en aire humidificado con 5 % de CO
2. Antes de los experimentos, las células se cultivaron en un 75 cm
2 matraz a aproximadamente 80% de confluencia. Las células en fase G1 ordenados con FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) fueron utilizados en experimentos de qPCR en este estudio. Para la hipoxia, las células CP-A y CP-C a 80% de confluencia se incubaron en el medio de queratinocitos SFM que contiene 2% (v /v) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, OH) a 37 ° C durante 30 minutos, que es el tiempo de tratamiento óptimo Oxyrase como se determinó anteriormente [31]. Las células se tripsinizaron, posteriormente, en 0,05% (v /v) de solución de tripsina que contiene 2% (v /v) Oxyrase a 37 ° C durante 9 min. La tripsinización se bloqueó mediante la adición de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) supplmented con 5% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen) que contiene 2% (v /v) Oxyrase.
Single-cell cosecha
recolección de celda única (aspiración y dispensación) se ha realizado mediante un micromanipulador desarrollado por nuestro grupo [36], [37] (Métodos S1).
Primer diseño y selección de gen diana
los fragmentos de la región hipervariable I (HVI) en el ADNmt fueron escogidos para el análisis del número de copias [38], [39]. El ADN total aislado de muestras a granel (1 × 10
4 células) se utilizó como molde para la ADNmt copia medida numérica, y se cuantificó usando un sistema en tiempo real qPCR (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) usando cebadores optimizados ( Métodos S1). Para el análisis de nivel de expresión de RT-qPCR, cuatro genes codificados mitocondrial (16S rRNA,
Coxi
,
COXIII, CYTBI
y cuatro genes nucleares (28s rRNA, VEGF, MT3, y PTGES) (cebadores como secuencias [31]) fueron elegidos (Métodos S1).
una sola célula ADNmt número de copias Determinación
Después de la cosecha, tubos que contienen cada uno una célula en suspensión en 6 l de tampón de lisis DNaST [26] se congelaron inmediatamente en hielo seco y, a continuación, se almacenó a -80 ° C hasta su análisis qPCR. Cada qPCR se realizó en un volumen total de 10μL, que contiene 2 l de lisado de solución DNaST como una plantilla. Para determinar el número de copias de ADNmt, los productos de qPCR de muestras a granel fueron purificados, cuantifican y se diluyeron en serie (número de copias de 10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) para una serie de reacciones de qPCR. los resultados se utilizaron para trazar una curva estándar para cada gen. El valor de Ct de cada célula individual se transfirió entonces en el número de copias de ADNmt absoluto el uso de las curvas estándar obtenidos.
mitocondrial potencial de membrana
potencial de membrana mitocondrial (MMP) se cuantificó con el análisis de microscopía confocal usando el colorante potenciométrico JC-1 (100 ng /ml) como fluoróforo y publicado protocolos de tinción [40 ], [41] (Métodos S1).
Una sola célula análisis de expresión génica
Una sola célula de RT-qPCR se llevó a cabo como se describe anteriormente [31], [42].
Análisis analiza
datos
estadísticos, incluyendo pruebas de significación, se llevaron a cabo utilizando el paquete de software OriginPro (v. 8, Origin, Northampton, MA). los niveles de significación estadística se calcularon mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney-Wilcoxon de dos colas.
Resultados
Método basado en la PCR cuantitativa para el ADNmt número de copias Adetermination en células individuales
varias regiones de ADN mitocondrial, como HVI, se han utilizado como objetivos para el análisis de número de copias de ADNmt basada en la PCR en muestras a granel antes [43]. Un par de cebadores con el valor más bajo Ct, control negativo distinto, picos agudos y distintos del producto de amplificación en las curvas de fusión, y el producto de amplificación correcto tal como se confirma por secuenciación fue seleccionado para cada región para su posterior análisis de una sola célula (Fig. S1 ,
HV1
). diluciones en serie de fragmento de ADNmt amplificado por PCR que contenía la región HVI se utilizó para hacer qPCR curvas estándar para el número de copias de ADNmt. Con los pares de cebadores seleccionados, la región de HVI fue demostrado tener el mejor rendimiento, con
R
2 = 0.9925, para el número de copias de ADN que van desde 10
2 a 10
6 ( la Fig. S2).
RT-qPCR para el análisis de expresión génica en células individuales
Recientemente hemos informado sobre una nueva técnica que permite el aislamiento, purificación y la transcripción inversa del ARN total a partir de un único de células de mamífero seguido por el análisis de RT-qPCR de los niveles de expresión de genes nucleares codificados por [31]. Siguiendo el mismo procedimiento, se determinó en células individuales de los niveles de expresión de varios genes seleccionados que participan en respuesta a la hipoxia, incluyendo mitocondrial codificada
COXI
,
COXIII
, y
CYTBI
[43] - [45], y el
VEGF
,
MT3
,
ANGPTL4
y
PTGES
genes codificados por el ADN nuclear, con 16S rRNA y 28S rRNA se utilizaron como controles internos [31], [38], [46] - [48].
Una sola célula ADNmt Copia Análisis Número de CP-a y Líneas celulares CP-C
los estudios previos basados en el análisis de células mayor indicaron que la masa mitocondrial promedio no difiere significativamente entre PP-a y células CP-C [2]. En este estudio, los resultados del análisis inicial de células a granel también mostró un poco más altas, aunque estadísticamente no significativas ADNmt promedio de número de copias en las células CP-C (~1,530 por célula), en comparación con CP-A (~1,392 por célula) (Fig. S3). El análisis de una sola célula basado en 99 células individuales de cada línea celular reveló diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,002) en el número de copias de ADNmt entre PP-A y células CP-C (Fig. 1A, B). 92 de 99 (92%) de las células CP-A mostró ADNmt número de copias que oscilan entre 106-1,900 por célula con células sólo 8 (8%) que contienen más de 2.000 copias por célula, mientras que en 92 de cada 99 células CP-C ADNmt el número de copias oscilaron entre 171-2,952 por célula, con 8 células que tienen más de 3.000 copias por célula (Fig. 1A). Por término medio, las células CP-C tenía aproximadamente 43% más de ADNmt que las células CP-A (1363 (CP-C) vs. 951 (CP-A); La Fig. 1B, Tabla 1). Se calcularon los parámetros descriptivos de los histogramas de población de ADN mitocondrial, incluyendo la asimetría (medida de simetría), curtosis (medida de peakedness) y el factor de Fano (medida de dispersión). Ambos valores asimetría y la curtosis fueron estadísticamente significativamente menor en las células CP-C en comparación con las células CP-A, mientras que el factor de Fano no fue significativamente diferente (Tabla 1).
A) Una sola célula de copia ADNmt distribución de los números de células de metaplasia (CP-a) y displásicas (CP-C), B) diagramas de cajas de las dos distribuciones se muestran en el panel A. siguientes valores se representan: plaza abierta - media; línea continua - mediana; líneas superior e inferior de la caja - la 75
y 25
º percentiles, respectivamente; superiores e inferiores barbas - el
º 95 y 5
º percentiles, respectivamente; x - los valores mínimos y máximos de la distribución. El valor de p & lt; 0,002 se calculó mediante la prueba de significación estadística no paramétrica de Mann-Whitney de dos colas (n = 99); ADNmt copia oscilan números entre 150-1,900 C-D) JC-1 micrografías de fluorescencia de hipóxico CP-A (C) y las células hipóxicas CP-C (d); distribuciones de células individuales del potencial de membrana mitocondrial en relación CP-A (E) y células CP-C (F). Se analizaron JC-1 señales de alrededor de 100 células por línea celular y el estado; G) la representación estadística de la distribución de MMP en ambos tipos de células /condiciones.
Respuestas
diferenciales a la hipoxia entre las células CP-A y CP-C a nivel de células individuales
potencial de membrana mitocondrial difiere significativamente entre CP-A y células CP-C.
potencial de membrana mitocondrial (MMP) generado por la cadena de transporte de electrones mitocondrial refleja el estado funcional de la mitocondria. Se ha relacionado a la respuesta fisiológica y la producción de ROS [49]. JC-1 ha sido ampliamente utilizado en estudios de apoptosis para monitorear la salud mitocondrial y la disfunción en el contexto del cáncer y las enfermedades neurodegenerativas [40], [41].
utilizando imágenes de fluorescencia JC-1 tinción reveló diferencias entre CP golpear -A y células CP-C (100 células de cada tipo) bajo ambas condiciones de control y de hipoxia (Fig. 1C, D). Bajo condiciones de crecimiento de normoxia (21% O
2), las células CP-A mostró relativamente bajo de color rojo (590 nm) a (529 nm) relación de intensidad verde de fluorescencia con un promedio de 2, mientras que las células CP-C mostraron una relación media de 3,8 (Fig. 1E-G). Después de la exposición a la hipoxia de 30 min (ver Métodos), las células de ambos tipos demostraron una reducción de relaciones de intensidad de fluorescencia rojo /verde, con un promedio de 0,6 y 1,5 para CP-A y células CP-C, respectivamente (Fig. 1G). Los datos de la estadística descriptiva se resumen en la Tabla 2.
heterogeneidad mitocondrial dentro y entre los diferentes tipos de células se había informado anteriormente, que revela grandes variaciones en MMP entre células del mismo tipo dentro de una única placa de cultivo [23] . En nuestro estudio, el análisis de los datos de MMP unicelulares reveló estadísticamente los valores de curtosis significativamente más altos en las células CP-C normoxia en comparación con células de normoxia CP-A, mientras que la asimetría era comparable. Bajo condiciones de hipoxia se observó una tendencia opuesta, con células CP-A que muestran valores significativamente más altos de curtosis que las células CP-C, mientras que los valores de asimetría no fueron significativamente diferentes. Estos datos indican respuestas diferentes a la hipoxia entre las dos líneas celulares, e implica que los dos tipos de células reaccionan a la hipoxia de otra manera, no sólo en términos de la media de MMP, pero también con respecto a su distribución entre las células individuales. Los valores de curtosis distribución de MMP sugieren mayor heterogeneidad MMP de las mitocondrias en displásicos (CP-C) que metaplásico (CP-A) SER células.
Análisis de la expresión del gen mitocondrial en células individuales.
Tres genes codificados vista mitocondrial,
COXI
,
COXIII
y
CYTBI
, fueron seleccionados para el análisis de expresión debido a su importante papel en la función mitocondrial y la participación en respuesta a la hipoxia [44], [45]. En primer lugar, se compararon los niveles relativos de expresión de estos genes entre las condiciones de normoxia e hipoxia en muestras de células a granel utilizando 16S rRNA mitocondrial como referencia interna. Los tres genes mitocondriales mostraron un patrón de respuesta a la hipoxia muy similar: un aumento de 1.5 a 2.6 veces se observó con gran variabilidad tanto en las células CP-A y CP-C (Fig S4A, B).
Para gen. análisis de la expresión a nivel de una sola célula, un total de 24 células de cada tipo celular y el estado (normoxia e hipoxia) fueron aislados. Los resultados mostraron un alto grado de variabilidad de célula a célula en los niveles de expresión de los cuatro genes mitocondriales en las células de ambos tipos (Fig. 2-4). Por ejemplo, los valores de Ct de ARNr 16s en células CP-A variaron del 20 al 26 (llegando a 30 en un caso), y el rango de células CP-C fue de entre 20 y 25. Los valores de Ct de
COXI
,
COXIII
y
CYTBI
en ambas líneas celulares tenían entre 20 y 35 con valores medios de Ct 22.4~27.9, 26.8~28.2 y 28.3~30.2, respectivamente (Fig. 2, 3 ). Una reducción significativa en el valor de Ct del gen 16S rRNA (
p Hotel & lt; 0,05, n = 24) se observó en los A-CP individuales células hipóxicas, mientras que sólo un leve pero estadísticamente se detectó cambio significativo en la CP- hipóxica Las células C (
p Hotel & lt; 0,05, n = 24) (Fig. 3,
16s rRNA
). Del mismo modo, una disminución significativa en el valor de Ct para
COXI
(
p
& lt; 0,001, n = 24) se observó en CP-A, pero no en células CP-C en condiciones hipóxicas como en comparación con la normoxia (Fig. 2, 3,
COXI
). Dado que los valores de Ct menores significan mayores números de copias de ARNm, ARNr 16s y
Coxi
niveles de mRNA en células CP-A fueron significativamente hasta regulados por la hipoxia, lo que indica que ambos genes en células CP-A responden a la hipoxia. Curiosamente, cuando la media Ct
Coxi
valores se normalizaron frente al nivel de expresión de 16S rRNA Ct
16S
, un paso estándar para el cálculo de los niveles de ARNm relativos a granel muestras de células, la reducción de
COXI
valores de Ct en respuesta a la hipoxia no fue significativa, lo cual es consistente con los resultados de análisis de la expresión génica de nivel mayor de este estudio (Fig. S4). En contraste, se detectó un aumento significativo en el valor de Ct
CYTBI gratis (
p = 0,03
, n = 24) en células CP-C pero no en células CP-A (
p
= 0,43, n = 24) (Fig. 2, 3,
CYTB1
), lo que sugiere una regulación a la baja por la hipoxia de este gen mitocondrial codificada en las células CP-C. Es interesante observar que los niveles de expresión de 16S rRNA en las células CP-C normoxia son más altos que en las células normóxicas CP-A (C
t (CPC) = 22,73 vs. C
t (CPA) = 23,66 , p & lt; 0,006) y enfoques de los niveles en las células hipóxicas CP-a (C
t (CPA) = 22.09). Sin embargo, nuestro estudio también ha demostrado que el número medio de copias de ADNmt por célula son más altos en las células CP-C (Fig. 1B, Tabla 1). Por lo tanto, para hacer una comparación directa entre las dos líneas celulares posible, se calculó las diferencias relativas en los niveles de expresión de genes y los normalizaron en contra de los medios de ADNmt número de copias utilizando la siguiente ecuación: donde ADNmt es el promedio del número de copias de ADN mitocondrial por célula. Mediante el cálculo de r
norma podemos determinar las diferencias relativas en los niveles de expresión génica entre los dos tipos de células por cada molécula de ADNmt. Este parámetro también se puede interpretar como una medida de la "actividad ADNmt", ya que representa la relación entre los niveles relativos de expresión de genes y el número de copias de ADNmt. Utilizando esta expresión nos encontramos con que en condiciones de normoxia 16S rRNA se expresa un 33% más por molécula de ADN mitocondrial en las células CP-C que en las células CP-A. Un resultado similar es válido para
COXI gratis (28% más alto en CP-C que en la CP-A) y
COXIII gratis (32%), mientras que
CYTBI
exposiciones 2.45- veces menor expresión por molécula de ADNmt en CP-C en comparación con las células CP-a. Por otra parte, observamos diferencias en la distribución de la expresión de genes parámetros de asimetría y curtosis-entre las respuestas de la hipoxia en la CP-A y células CP-C (Fig. 4) Marcado. Aunque hay una tendencia clara en la asimetría de distribución o curtosis es obvio en respuesta a la hipoxia en las células CP-A (Fig. 4A, C, E, G), las células CP-C muestran un aumento claro y estadísticamente significativa tanto en la asimetría y curtosis de la distribuciones de
COXI
,
COXIII
y
CYTBI
la expresión de genes (Fig. 4F, H). Por otra parte, a excepción de
PTGES
, los genes nucleares estudiados no mostraron diferencias significativas en los parámetros de la distribución en las células CP-C (Fig. 4B, D). Es importante señalar que los valores medios de
COXI
y
COXIII
niveles de expresión en las células normóxicas e hipóxicas CP-C no fueron significativamente diferentes en el nivel mayor (Fig. S4). Este hallazgo demuestra de nuevo la utilidad de una sola célula de análisis para obtener acceso a la información disponible de otra manera.
Los histogramas de los niveles de expresión de genes en el control (
barras vacías
) y se trató por hipoxia (30 minutos ,
barras sólidas
) células CP-A y CP-C. Los histogramas de distribución se generaron utilizando el mismo tamaño bin.
Los diagramas de caja de una sola célula de los niveles de expresión de genes y
p-valores
asociado con las diferencias entre normoxia e hipoxia en condiciones las dos líneas celulares. Muestra el gráfico siguiente cuadro valores estadísticos: Abrir cuadrados - medias, línea continua - la mediana, las líneas superior de la columna inferior - los 75º y 25º percentiles, respectivamente, barbas superior e inferior - el 95 y percentiles 5º, respectivamente, x - máxima y mínima los valores.
Comparación de la asimetría de distribución (A, B, e, F) valores de las distribuciones de nivel de una sola célula de la transcripción de genes entre normoxia y condiciones de hipoxia y la curtosis (C, D, G, H) . Una clara tendencia de aumento tanto asimetría y curtosis de la distribución de la expresión de genes codificados mitocondrialmente se puede ver en las células CP-C en respuesta a la hipoxia, pero está ausente en las células CP-A. Entre los genes nucleares estudiados sólo el gen PTGES mostró cambios significativos en los parámetros de asimetría y curtosis en células CP-C.
Expresión
diferencial de genes de respuesta de hipoxia nuclear.
Hemos demostrado que los niveles de expresión de genes determinados a partir de análisis de una sola célula no siempre fueron consistentes con los obtenidos mediante el análisis de células a granel. Se observó la expresión diferencial de dos genes nucleares en respuesta a la hipoxia entre mayor CP-A y muestras CP-C. En contraste con las células CP-A, donde
MT3
fue hasta reguladas ~ 7 veces y
VEGF
no mostró ningún cambio, las células CP-C mostraron un aumento de ~ 5 veces en
VEGF
expresión mientras que
MT3
no mostró ningún cambio significativo (Fig. S4A, B). A nivel de una sola célula nos dimos cuenta de que incluso los
28s rRNA
, que es comúnmente utilizado como referencia interna en los estudios de células mayor, mostró importantes sobre regulación en la CP-A (
p Hotel & lt; 0,05, n = 36), pero no en CP-C (
p
= 0,05, las células n = 36) en condiciones de hipoxia (Fig. 5,
28s
). Debido a los diferentes niveles de expresión de
28s rRNA
, se utilizaron los valores de Ct primas de genes de respuesta a la hipoxia en lugar de delta Ct tradicional (normalizado contra un gen de mantenimiento) para su posterior análisis.
Los histogramas de los niveles de expresión génica en el control (
barras vacías
) y la hipoxia-tratada (30 minutos,
barras sólidas)
células. Los histogramas de distribución se generaron utilizando el mismo tamaño bin.
A pesar de
28s rRNA
expresión se detectó en todas las células individuales en el estudio, las transcripciones de los otros tres genes codificados nucleares no eran siempre detectado en las células CP-a de ambos grupos de hipoxia de control y, muy probablemente debido a su baja abundancia. Por ejemplo, de las 36 células individuales,
se detectaron MT3
transcripciones en el 33 y 34 de control de las células individuales de hipoxia,
Hoteles en PTGES 29 y 36, y
VEGF Hoteles en 16 y 24. en las células individuales CP-C, sin embargo, a excepción de
VEGF gratis (33 de 36), se detectaron las transcripciones de todos los genes en los 36 células individuales. Sobre la base de los valores de Ct primas, dos genes de respuesta hipoxia
MT3
(
p
& lt; 0,001, n = 33, 35 en los grupos de control y de hipoxia, respectivamente) y
PTGES
(
p Hotel & lt; 10
-4, n = 27, 36) había aumentado significativamente los niveles de expresión en las células CP-A (figura 5, 6.). Curiosamente, en las células hipóxicas CP-C solamente
PTGES
mostraron una regulación significativa (
p Hotel & lt; 0,001, n = 36, 36), mientras que los otros dos,
VEGF
y
MT3
, no lo hizo (Fig. 5, 6). Diferencial
VEGF
la expresión génica en condiciones de hipoxia no se observó en ninguno CP-A o CP-C a nivel de una sola célula. A diferencia de los genes mitocondriales estudiados, no se observa el mayor número de diferencias estadísticamente significativas en los parámetros de asimetría y la curtosis de las distribuciones individuales de expresión génica de células (Fig. 4A-D) entre normoxia y células hipóxicas de ambos tipos. La distribución de la
PTGES
gen exhibieron aumentos estadísticamente significativos en ambos valores de asimetría y la curtosis en hipóxica vs células normoxia CP-C. Las formas de distribución de los niveles de expresión de los otros tres genes de no mostraron alteraciones estadísticamente significativas en la respuesta a la hipoxia. En las células CP-A sólo el
MT3
gen mostró un marcado aumento de curtosis en respuesta a la hipoxia. Todos los otros genes no mostraron cambios significativos en los parámetros de distribución de la expresión de una sola célula
El gráfico muestra el recuadro siguientes valores estadísticos:. Abrir cuadrados - medias, línea continua - la mediana, las líneas superior e inferior de la caja - el 75 y el 25 barbas percentiles, respectivamente, superior e inferior - la 95ª y percentiles 5º, respectivamente, x -. los valores máximo y mínimo
Discusión
el hallazgo de niveles significativamente elevados de ADNmt en CP -C comparación con las células CP-a (Fig. 1, Tabla 1) es importante ya que tiene el potencial relevancia funcional. Curiosamente, el aumento o disminución cantidades de ADNmt se han reportado en diferentes tipos de células de tumores sólidos humanos. Por ejemplo, los niveles de ADNmt reducido se han encontrado en las células de carcinoma de próstata y asociados con fenotipo invasivo [50], una regulación a la baja de la biogénesis mitocondrial se correlacionó con cáncer invasivo de mama [51] y la progresión del cáncer de ovario [52]. Por el contrario, se han notificado cantidades elevadas de ADNmt en la próstata [53], [54], cáncer de cabeza y cuello, gliomas pancreáticas [55], y ha encontrado que se correlaciona positivamente con el estadio clínico-patológica en el cáncer colorrectal [56], Shapovalov et al . han mostrado un aumento de los niveles de ADNmt y la disminución de las tasas de respiración en las células de osteosarcoma agresivos en comparación con los osteoblastos o células de osteosarcoma benignos [57]. Además, el aumento de los niveles de ADNmt se han asociado con el riesgo de desarrollar cáncer de mama [58] mientras que los incrementos en el ADNmt número de copias se han reportado en la progresión de normal a pre-malignas a la progresión maligna en el endometrio [59], la carcinogénesis de los cánceres de cabeza y cuello [60] y en la progresión del carcinoma de células escamosas de esófago [61]. Mientras que el papel funcional de aumento de los niveles de ADNmt en pre-maligna a la progresión maligna que queda por esclarecer, se sugirió la regulación positiva de la biogénesis mitocondrial para servir como un mecanismo de compensación para la alteración de la función mitocondrial debido al daño del ADN mitocondrial en las lesiones pre-malignas [60], [61]. Así, es posible que las células epiteliales del esófago displásicas regular al alza la biogénesis mitocondrial para aumentar la disponibilidad general de molde para la transcripción, que a su vez debe aumentar la cantidad neta de ARNm mitocondrial y los correspondientes niveles de proteína para mantener la función mitocondrial. Observamos que sólo el análisis a nivel de una sola célula reveló que los niveles de ADNmt entre PP-A y células CP-C son significativamente diferentes, mientras que el análisis de nivel mayor no mostró diferencias significativas (Fig. S3). Los valores más altos observados asimetría y apuntamiento de la distribución de contenido de ADNmt en las células CP-A son indicativos de un mayor grado de desviación de la distribución normal CP-A en comparación con las células CP-C. Mientras relevancia funcional de este hallazgo que queda por esclarecer, el resultado en sí es interesante, ya que indica diferencias a nivel de población entre las dos etapas de pre-maligna. Es posible que debido a la presión selectiva conferida por la bilis y el reflujo ácido en el esófago, uno o varios subclones en la población más heterogénea de metaplásico se seleccionan las células (CP-A) para lo que resulta en un menor heterogéneo, más cerca de perfil normal de distribución del contenido de ADNmt en las displásicos, etapa (células CP-C) más avanzados de BE. Los estudios que se centran en heteroplasmia de ADN mitocondrial a nivel de células individuales tendrían que ser llevado a cabo para proporcionar una visión más detallada de este hallazgo. Sin embargo, el hallazgo de niveles de ADNmt elevadas en displásico ser células indica que la progresión BE pre-maligno es similar a otros tipos de progresión (CECA y cáncer de cabeza y cuello) y que puede ser utilizado como un biomarcador para la detección temprana de la displasia en diferente tipos de tejidos.
El potencial de membrana mitocondrial (MMP) mediciones revelaron valores relativos claramente superiores en normoxia CP-C (1,86 ± 0,41) en comparación con el CP-a (0,80 ± 0,17) células (Fig. 1, Tabla 2 ). Cuando se normaliza contra el ADNmt número de copias, los valores de MMP relativos medios son aproximadamente 37% más alto en CP-C que en las células CP-A. Este resultado muestra que en promedio por molécula de ADNmt las células displásicas mantener los valores de MMP más altas que las células de metaplasia.