Extracto
AZD6244 (ARRY-142886) es un inhibidor de MEK1 /2 y puede inhibir la proliferación celular o inducir la apoptosis en una célula de tipo de forma dependiente. El mecanismo molecular preciso de la apoptosis inducida por AZD6244 no está claro. Para investigar los mecanismos de apoptosis inducida AZD6244 en el cáncer de pulmón humano, se determinó que los cambios moleculares de dos subgrupos de líneas celulares de cáncer de pulmón humano que son sensibles o resistentes al tratamiento AZD6244. Se encontró que el AZD6244 suscitado un gran aumento de las proteínas Bim y un menor aumento de las proteínas PUMA y Noxa, y la muerte celular inducida en líneas celulares de cáncer de pulmón sensibles, pero no tuvo ningún efecto sobre otras proteínas Bcl-2 relacionados en las líneas celulares. Desmontables de Bim de siRNA se incrementó en gran medida la IC
50 y la reducción de la apoptosis de las células tratadas AZD6244. También se encontró que los niveles endógenos de p-Thr32-FOXO3a y p-Ser253-FOXO3a fueron más bajos en las células AZD6244 sensible que en las células AZD6244 resistente. En las células sensibles, AZD6244 FOXO3a inducida por la translocación nuclear necesaria para la activación Bim. Por otra parte, el silenciamiento de FOXO3a de siRNA abrogó la apoptosis celular inducida por AZD6244. Además, encontramos que la transfección de constitutivamente activa AKT hasta reguladas p-Thr32-FOXO3a y p-Ser253-FOXO3a expresión y expresión inhibida Bim AZD6244 inducida en las células sensibles. Estos resultados muestran que Bim juega un papel importante en la apoptosis inducida por AZD6244 en células de cáncer de pulmón y de que la vía PI3K /AKT /FOXO3a participa en la regulación Bim y la susceptibilidad de las células de cáncer de pulmón a AZD6244. Estos resultados tienen implicaciones en el desarrollo de estrategias para superar la resistencia a los inhibidores de MEK
Visto:. Meng J, Fang B, Liao Y, chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) La apoptosis Inducción por MEK Inhibición de Las células del cáncer de pulmón humanos está mediada por Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10.1371 /journal.pone.0013026
Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2010; Aceptado: August 31, 2010; Publicado: 27 de septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Cancer Institute Especializada de Investigación de Excelencia (SPORE) subvención CA-70907 (J. Minna y J. Roth), R01 subvención CA-092 487 (B. colmillo), y el Centro de cáncer programa de subsidios para CA-16672. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Este trabajo también fue apoyado por una Beca de investigación patrocinados de AstraZeneca Farmacia que no tienen un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue apoyado por una Beca de investigación patrocinados de AstraZeneca Farmacia. El donante AstraZeneca tenía un papel, ya sea en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La activación del Ras /Raf /MEK /MAP quinasa se ha implicado en incontrolada la proliferación celular y el crecimiento tumoral. AZD6244 (ARRY-142886), un novedoso y selectivo inhibidor no competitivo de la ATP-MAP quinasa quinasa 1/2 (MEK1 /2), ha mostrado actividad en concentraciones nanomolares contra aislado enzima MEK y numerosas líneas celulares de cáncer [1] . Los estudios in vitro mostraron que AZD6244 niveles de p-ERK el regulado de manera eficiente. AZD6244 ha mostrado actividad en varios modelos de xenoinjerto de tumor de cáncer humano [2] - [4]. En los ensayos clínicos, los pacientes de varios tipos de tumores han mostrado respuestas a la monoterapia con inhibidores de MEK, los tumores de otros pacientes, en particular los no pequeñas de cáncer de pulmón de células, son intrínsecamente resistentes a la inhibición de MEK. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos subyacentes responsables de la resistencia a la inhibición de MEK en el caso de que sea importante modalidad terapéutica en este tipo de cáncer muy común.
Nuestro estudio anterior [5] mostró que el inhibidor de MEK AZD6244 inhibe potentemente la proliferación a concentraciones nanomolares en Calu-6, H2347, H3122 y líneas celulares de cáncer de pulmón, pero tuvo poco efecto en H196, Calu-3, H522, o líneas celulares HCC2450. Además, se encontró que después de la detención del ciclo celular sub-G1, el 20-40% de las células sensibles a AZD6244 se sometió a la apoptosis, se observó ninguna apoptosis en células AZD6244 resistente. Anteriormente puso de manifiesto que la expresión de p-AKT es baja en líneas celulares de cáncer de pulmón AZD6244 sensible pero de alta en las células resistentes, lo que sugiere que el p-AKT es un mediador de la resistencia al tratamiento con AZD6244. En este trabajo investigamos mediadores abajo en la apoptosis inducida por AZD6244 en células de cáncer de pulmón humano.
La apoptosis podría ser regulada a través extrínseca (receptor de muerte) o intrínsecos vías (mitocondrial) de muerte celular. intrínseca de apoptosis está mediada por las proteínas de la familia Bcl-2, que consiste en tres subfamilias: los miembros pro-supervivencia, como Bcl-2 o MCL-1, el pro-apoptótica subgrupo Bax /Bak, y el pro-apoptótica Bcl-2 homología de 3 solamente (BH3-only) proteínas. estímulos apoptóticos desencadenan la activación de determinadas proteínas BH3-only, que luego se acoplan a los miembros de la familia pro-supervivencia Bcl-2 y liberar a los efectores, Bax y Bak, para provocar mitocondrial permeabilización de la membrana externa, desencadenando la cascada de caspasas y culminando en la muerte celular. Bim, modulador de p53 hasta reguladas de la apoptosis (PUMA) y NOXA se han reportado recientemente a desempeñar un papel importante en la quimioterapia y selectiva la apoptosis inducida por la terapia en el cáncer de mama [6], leucemia [7], el mieloma [8] y NSCLC [ ,,,0],9]
células.
La transcripción del factor FOXO miembros promueven o inactivan múltiples genes diana implicados en la supresión tumoral, tales como
Bim
,
FasL
, y
TRAIL
genes para inducir la apoptosis [10], [11],
p27kip1
,
ciclina D15 Opiniones de regulación del ciclo celular [12], y
GADD45a
para la reparación de daños en el ADN [13]. FOXO3a es uno de la familia FOXO más importante de factores de transcripción que tienen una amplia gama de funciones celulares. FOXO3a son fosforilados e inactivado por AKT a través de la fosforilación en Thr32, Ser253, Ser315 y que se traduce en la exportación nuclear y la inhibición de su actividad de transcripción [14], [15]. FOXO3a también se ha demostrado ser regulada por la oncoproteína ERK [16] a los tres sitios de fosforilación de ERK, Ser 294, Ser 344 y Ser 425. Como con AKT, la fosforilación de estos residuos de serina con ERK aumentó FOXO3a distribución citoplasmática y la exportación nuclear.
Debido a que el equilibrio entre las proteínas anti-apoptóticas y pro-apoptóticos es crítica a la apoptosis inducida por fármacos, se evaluaron los cambios en las proteínas de la familia Bcl-2 en líneas celulares sensibles y resistentes cáncer de pulmón AZD6244 y encontró que el inhibidor de MEK AZD6244 hasta regula los pro-apoptóticos BH3-sólo las proteínas Bim, PUMA y noxa, un proceso asociado a la muerte celular subsiguiente. También se encontró que el silenciamiento o bien FOXO3a, un regulador transcripcional de Bim, o Bim con pequeños ARN de interferencia (siRNA) la apoptosis en gran medida inhibido. Además, la expresión de AKT constitutivamente activa (caAKT) en células sensibles inhibe AZD6244 inducida por Bim sobre-expresión y la condujo a la resistencia AZD6244. Por el contrario, la transfección estable de AKT dominante negativo en células resistentes mejorado AZD6244 inducida por Bim sobre-exrpession.
Materiales y Métodos
Materiales
AZD6244, proporcionada por AstraZeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, Reino Unido), se disolvió a 25 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó a -80 ° C. Anticuerpo contra Bim se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA). Los anticuerpos contra p-ERK, FOXO3a, p-FOXO3a (Thr32), p-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, NOXA y PUMA, y el kit de ensayo de quinasa AKT fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Los anticuerpos contra Bak, Bcl-xl y la caspasa-9 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Prediseñado FOXO3a siRNA fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA), y Bim y siRNA de control eran de Qiagene (Valencia, CA). El humano de longitud completa BimEL cDNA, que se clonó en el vector de expresión pCMV6-XL4, se adquirió de OriGene Technologies (Rockville, MD). Proteasa cóctel inhibidor, anticuerpo β-actina, y sulforhodamina B (SRB) fueron de Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). materiales de ensayo de proteínas y SYBR Green Supermix se adquirieron de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), y geneticina era de Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA). Lipofactamin 2000 y el reactivo Trizol se compraron de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), y revertir los reactivos de transcripción eran de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). DeadEnd TUNEL System ™ Flurometic se adquirió de Promega (Madison, WI).
Cultivo de células
Las líneas celulares H2347, H3122, H196, HCC2450, y H522 fueron proporcionados por los Dres. A. Gazdar y J. Minna, Centro Hamon Terapéutica de Oncología de Investigación de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón se mantuvieron en medio de Eagle modificado de alta glucosa de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 mg /ml de ampicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina; las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5%
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo SRB CO
2 y 95% de aire., y cada ensayo se llevó a cabo por cuadruplicado. células de cáncer de pulmón se sembraron a aproximadamente 3.000 por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en DMEM suplementado con 10% FBS. Las células se trataron luego con AZD6244 a las concentraciones indicadas, que eran equivalentes a las concentraciones en suero alcanzados en pacientes después de la administración oral. Las células tratadas con DMSO se utilizaron como controles. Las células se fijaron 96 horas después del tratamiento mediante la adición de 50 l de ácido tricloroacético al 10% a 4 ° C durante 1 hora. a continuación se tiñeron con 70 l de SRB al 0,4% durante 60 minutos y se lavaron con ácido acético al 1%; Se añadieron 200; l de Tris base (pH, 10,5 10 mmol /L). Las lecturas de absorbancia a 570 nm se determinaron usando un analizador de microplacas. La tasa de supervivencia relativa (%) se calculó por la ecuación OD
T /OD
C × 100% (con OD
T representa la absorbancia de los grupos de tratamiento, y OD
C de la absorbancia del control grupos). las concentraciones inhibidoras medias (IC
50 valores) se determinaron mediante el uso de CurveExpert 1.3 software y se representan en las curvas de dosis-respuesta. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se prepararon por lavado de las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y someterlos a la lisis con tampón de muestra Laemmli complementado con cóctel inhibidor de la proteasa. Después de que los lisados se sometieron a ultrasonidos durante 15 segundos, las concentraciones de proteína se cuantificaron mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. proteínas equivalentes se cargaron, separados por 10% o electroforesis en gel de 12% de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE), y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 80 V durante 2 horas. Las membranas se bloquearon durante 1 hora con 5% de leche sin grasa seca en tampón Tris que contiene 0.1% de Tween (TBST) y se sondaron con anticuerpo primario diluido a 4 ° C durante la noche. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en tampón TBST y se sondaron con anticuerpos secundarios marcados con colorante de infrarrojos; las bandas inmunorreactivas se visualizaron con el uso de la Odyssey® Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Ciclo celular y apoptosis ensayo
Las células se recogieron por tripsinización, se lavaron dos veces en frío PBS, se fijaron con helado de 70% de metanol, y se incubó a 4 ° C durante la noche. Después, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 25 mg /ml de yoduro de propidio que contiene 30 mg /ml de ribonucleasa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se analizaron en un EPICS Profile II flujo FACSCalibur (Coulter Corp., Hialeah, FL) con el programa multiciclo Phoenix Flow Sistemas (sistemas de flujo de Phoenix, San Diego, CA). Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Medición de la apoptosis por TUNEL (terminal desoxinucleotidiltransferasa mediada por nick de fin de etiquetado) ensayo de
El ensayo de TUNEL se realizó siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante de una comercialmente disponible kit (DeadEnd ™ fluorométrico TUNEL System) de Promega. Las células apoptóticas exhiben una fuerte fluorescencia verde nuclear que podría ser detectado utilizando un filtro de fluoresceína estándar. Todas las células se tiñeron con DAPI exhiben una fuerte fluorescencia nuclear azul. Se observaron las diapositivas bajo microscopía de fluorescencia con células apoptóticas relativas determinadas por el recuento de células TUNEL positivas en cinco campos al azar (en 100 × magnificación) para cada muestra.
-PCR en tiempo real
El ARN total se aisló utilizando reactivo Trizol y transcripción inversa en ADNc. Como se ha descrito anteriormente, se utilizaron cebadores Bim [6] en nuestro estudio. reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (PCR) se llevó a cabo en 25 l de mezcla, con 12,5 l de 2 × SYBR Green Supermix, 1 mM de cada uno hacia adelante y cebador inverso, y de 4 a 12 ng de plantilla, usando la detección en tiempo real PCR CFX96 sistema (Bio-Rad). PCR se realizó durante una desnaturalización inicial de 10 minutos a 95 ° C seguido de 39 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, 30 segundos a 58 ° C, y 30 segundos a 72 ° C. Todas las muestras se analizaron por triplicado, y se usó gliceraldehído humano 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control endógeno. Expresión relativa se calculó utilizando el método 2-δδCt.
siRNA y Bim cDNA transfección
Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta 70% de confluencia y se transfectaron con 200 nmol /L del control siRNA inespecífico, Bim-siRNA dirigido, o FOXO3a-siRNA dirigido mediante el uso de Lipofectamine ™ 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron tratadas con DMSO (control) o AZD6244 en dosis indicadas y los puntos de tiempo. a continuación, se recogieron las células y se procesaron para la inmunotransferencia o yoduro de propidio tinción para el análisis del ciclo celular.
Para Bim cDNA transfección, las células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos hasta 70% de confluencia y se transfectaron con el vector de control o BimEL vector de expresión, a una concentración de 4 mg en 250 l de medio, utilizando Lipofectamine 2000. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron por inmunotransferencia o fijado con formaldehído al 4% para el ensayo de TUNEL.
actividad quinasa AKT ensayo
celulares se lavaron dos veces con PBS, se sometieron a lisis en tampón de lisis celular, y se sonicó durante 15 segundos. Los extractos se centrifugaron para eliminar los restos celulares, y las concentraciones de proteína de los sobrenadantes se determinaron mediante el uso de reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad. Una muestra de lisado celular de 200 l se incubó con 20 l de anticuerpo anti-AKT inmovilizado a 4 ° C durante la noche con balanceo suave. Los inmunoprecipitados resultantes se lavaron tres veces con tampón de lisis y dos veces con tampón quinasa AKT. Quinasa ensayos se llevaron a cabo durante 30 minutos a 30 ° C con agitación continua en tampón de quinasa que contiene 200 ATP mu M y 1 g de proteína de fusión GSK-3. Los productos de reacción se resolvieron por 10% SDS-PGAE, seguido de transferencia Western con un anticuerpo anti-fosfo-GSK-3α /β de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el ensayo de quinasa AKT no radiactivo. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
inmunofluorescencia tinción
Las células fueron cultivadas en CultureSlides (BD Biosciences, CA). El medio se aspiró, y las células se lavaron tres veces con PBS y después se fijaron con paraformaldehído recién preparado 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de otra etapa de lavado con PBS, se permeabilizaron las células durante 20 minutos a temperatura ambiente mediante el uso de tampón de PBS que contenía 0,2% de Triton X-100 y citrato de sodio 0,1%. A continuación, las células se incubaron en PBS que contenía leche en polvo desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora. incubación del anticuerpo primario se realizó con anti-FOXO3a (1:100 diluciones) a 4 ° C durante la noche. Después de otra etapa de lavado con PBS, las células se incubaron con el anticuerpo secundario, anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS más 5% de leche descremada en polvo. Los portaobjetos se tiñeron a continuación con una solución antifade Prolong (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) durante 5 minutos a temperatura ambiente seguido por lavado tres veces en PBS. Las imágenes se adquirieron por microscopía de fluorescencia con un microscopio de escaneo láser invertido Zeiss. núcleos individuales se describen mediante el uso de fluorescencia DAPI, y la fluorescencia nuclear de Cy3 se cuantificó mediante el uso de software de análisis de imágenes Zeiss KS400 (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Alemania). Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar y se calcula como los valores medios con intervalos de confianza del 95%. La comparación estadística entre los grupos experimentales se llevó a cabo por dos vías ANOVA mediante el uso de software de Microsoft Excel. Los valores de
P
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
AZD6244 aumenta la expresión de Bim en líneas celulares de cáncer de pulmón
Nuestro estudio anterior [5 ] mostró que la proliferación inhibida AZD6244 en Calu-6, H2347, H3122 y líneas celulares de cáncer de pulmón, pero tuvo poco efecto en H196, Calu-3, H522, o líneas celulares HCC2450. Además, se encontró que después de la detención del ciclo sub-G
1 célula, 20-40% de las células sensibles a AZD6244 se sometió a la apoptosis, pero se observó que no apoptosis en células de AZD6244 resistente. En este estudio, hemos utilizado estas mismas líneas celulares para determinar mejor los mecanismos de la apoptosis inducida por AZD6244
La ruta apoptótica mitocondrial se sabe que juega un papel crítico en la tirosina cinasa apoptosis inducida por inhibidores de [6] -. [ ,,,0],9]. Para evaluar la que los miembros de la familia Bcl-2 se ven afectados gravemente por tratamiento AZD6244, determinamos sus niveles de proteína en las tres líneas celulares de cáncer de pulmón sensibles después del tratamiento con 3 M AZD6244, la concentración alcanzada en el suero de los pacientes que recibieron AZD6244 oral. Calu-6 tiene un mutante KRAS y BRAF de tipo salvaje, mientras que en el mutante H2347 H3122 ANR y [17] tiene tanto de tipo salvaje KRAS y BRAF. Western blot mostró que el tratamiento con AZD6244 aumentos inducidos rápida y sostenida en los niveles de BimEL y, en menor medida, de BIML y Bims, en todas las líneas celulares sensibles (fig. 1A). Además, el tratamiento con concentraciones sub-micromolar (0,03, 0,1, 0,3, 1 y 3 M) de AZD6244 durante 24 horas inducidas marcado aumento en los niveles de Bim (Fig. 1C). Estos hallazgos indicaron que AZD6244 inducida sus efectos sobre la expresión Bim de una manera de la concentración y dependiente del tiempo. Sin embargo, en estas células, los niveles de otros miembros de la familia Bcl-2 (Bax, Bak y Bcl-XL) no cambió notablemente en cualquier concentración de AZD6244 o en cualquier punto de tiempo (Fig. 1A). Por el contrario, AZD6244 no indujo cambios obvios en la expresión Bim en líneas celulares resistentes (Fig. 1B). Las líneas celulares resistentes son todos de tipo salvaje BRAF y KRAS. También se detectó supresión de la expresión de p-ERK con AZD6244 en células tanto sensibles y resistentes (Fig. 1A y 1B). También se investigó la expresión de proteínas BH3-only PUMA y NOXA después del tratamiento con AZD6244 3 M. PUMA y Noxa expresiones se incrementaron tras el tratamiento AZD6244, sin embargo, los niveles de aumento fueron mucho menos que la observada con Bim (Fig. 1A). Dado que la regulación al alza de Bim es mucho más dramático que PUMA y NOXA en las células tratadas con AZD6244, nos hemos centrado en el papel de Bim en estudios posteriores.
transferencias Western de miembros de la familia Bcl-2 después del tratamiento con AZD6244. (A) las líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Calu-6, H2347, H3122 y) fueron tratados con 3 M AZD6244 para 4, 8, 24, 48 y 72 horas. (B) las líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Calu-3, H196, H522, y HCC2450) fueron tratados con 3 M AZD6244 para 4, 24, y 72 horas. (C) Calu-6, H2347, las células H196 y H522 se trataron con 0,03, 0,1, 0,3, 1 y 3 M de AZD6244 durante 24 horas. Los datos representan uno de tres experimentos independientes con resultados similares.
AZD6244 inducida por la sobreexpresión Bim es causada tanto por el aumento de la transcripción y el aumento de la estabilidad de proteínas
Para investigar los mecanismos de Bim AZD6244 inducida expresión, se analizaron los niveles de ARNm Bim después del tratamiento con AZD6244. células sensibles y resistentes fueron tratados con 3 M AZD6244 durante 4 y 24 horas, y las células se recogieron para el análisis de PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de GAPDH se utilizaron como controles internos. El resultado mostró que, después de la normalización de los controles internos, el tratamiento con AZD6244 condujo a un aumento sustancial de los niveles de mRNA de Bim de una manera dependiente del tiempo en las células Calu-6, H2347, H3122 y sensibles. AZD6244, a una concentración de 3 M, aumentó Bim mRNA entre 2.2- a 2,5 veces después de 4 horas, y 2.9- a 3,8 veces después de 24 horas de incubación en estas tres líneas celulares (Fig. 2A). Existen diferencias significativas en la expresión de ARNm Bim entre los grupos de tratamiento y de control o entre las 4 horas y 24 horas grupos de tratamiento (
P Hotel & lt; 0,05 entre todos comparación por pares). Por el contrario, AZD6244 no podía inducir la expresión de mRNA Bim en las cuatro líneas celulares resistentes H196, HCC2450, Calu-3 y H522.
(A) RNA total se aisló en paralelo. La expresión de
Bim
se midió por PCR en tiempo real, y se normalizaron al nivel de
GAPDH
. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
Columnas
, media;
Bar &, Dakota del Sur. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con las células no tratadas. (B) Calu-6, H2347, H3122 y las células H196 se trataron con 30 mM MG132 para 2, se llevó a cabo 4, 6, y 8 horas y el análisis de transferencia Western con la expresión Bim. (C) Calu-6, H2347, H3122 y las células H196 se trataron con DMSO, 3 AZD6244 mu M, o 30 M MG132 durante 6 horas, y luego con 25 g /ml de cicloheximida para bloquear la síntesis de proteínas. Se realizó análisis de transferencia Western con la expresión Bim. Los datos representan uno de tres experimentos independientes con resultados similares.
Debido a la activación de ERK1 /2 vía de señalización fosforila Bim y promueve la degradación del proteasoma dependiente de Bim [18], hemos probado si la proteína Bim se estabiliza por AZD6244 tratamiento. Para este propósito, primero tratada (H196) las células sensibles (Calu-6, H2347 y H3122) y resistentes con MG132 inhibidor de proteosoma a 30 M durante 2, 4, 6 y 8 horas, las células cosechadas y se detectó expresión Bim por Western blot ( la Fig. 2B). los niveles de proteína Bim aumentaron 2 horas después de la exposición a MG132 y siguieron aumentando a 6-8 horas. A continuación, trataron estas células con DMSO, 3 M AZD6244, o 30 M MG132 durante 4 horas y después se añadió 25 g /ml de cicloheximida para bloquear la síntesis de proteínas en las células. Las células se recogieron a continuación con el tiempo y la expresión Bim se detectó por análisis de transferencia Western (Fig. 2C). Se encontró que la proteína era Bim degrada rápidamente en las células tratadas con DMSO en todas las cuatro líneas celulares sometidas a prueba. Por el contrario, en las células tratadas con AZD6244 o MG132, los niveles de proteína Bim se estabilizaron incluso después de 6 horas de tratamiento con cicloheximida, lo que indica que la degradación de la proteína Bim fue bloqueado por el tratamiento con AZD6244. En conjunto, nuestros resultados indican que la expresión BimEL aumento inducida por el tratamiento AZD6244 podría ser causado por dos mecanismos: un aumento de
Bim
transcripción de genes y una inhibición de la degradación de la proteína Bim. Como AZD6244 puede inhibir Bim la degradación de proteínas en ambas líneas celulares sensibles y resistentes, el aumento de
Bim
la transcripción de genes puede ser más importante en la inducción de apoptosis inducida por AZD6244.
Bim se requiere para AZD6244- indujo apoptosis en células de cáncer de pulmón
para examinar el papel de Bim en la apoptosis de células inducida por AZD6244, hemos generado siRNA construcciones específicas para Bim en líneas de células Calu-6 y H3122. Como se muestra en la Fig. 3A, siRNA desmontables de Bim inhibe sustancialmente la expresión de Bim después del tratamiento con 3 M AZD6244 durante 48 horas. se inhibió la escisión de PARP y la caspasa-9 de escisión /activación.
células (A) Calu-6 y H3122 se transfectaron con Bim-específico o control de siRNA y luego tratados con 3 M AZD6244 durante 48 horas. Expresión de Bim, PARP y la caspasa-9 se analizaron por transferencia Western. (B) Las células se cultivaron en medio que contenía diversas concentraciones de AZD6244 durante 96 horas. La viabilidad celular se determinó por sulforrodamina B, y la viabilidad celular relativa se representó gráficamente como se describe en la sección Materiales y Métodos. Los valores representan la media ± SD de tres ensayos por triplicado independientes. (C) células paralelas se fijaron con etanol y se tiñeron con yoduro de propidio; contenido de ADN se analizó por citometría de flujo. Los números representan porcentajes de
1 células en fase G sub-apoptóticas. Los datos representan uno de los tres experimentos independientes con resultados similares.
Columnas
, media;
Bar &, Dakota del Sur. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con las células de control transfectadas siRNA. (D) células paralelas también se fijaron durante TUNEL y tinción DAPI. núcleos de las células apoptóticas en la tinción de TUNEL se marcaron con FITC y se visualizaron bajo microscopía de fluorescencia. Las células apoptóticas relativas se determinaron contando TUNEL células positivas en cinco campos aleatorios (a 100 aumentos) para cada muestra.
Columnas
, media;
Bar &, Dakota del Sur. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con las células de control transfectadas siRNA. Las fotografías representativas de Calu-6 se muestran en el panel superior y el porcentaje de células apoptóticas tanto de Calu-6 y H3122 se mostró en el panel inferior. (E) Calu-6 células fueron transfectadas con el vector de expresión BimEL y vector de control durante 48 horas. La expresión de Bim fue analizado por Blot Las células apoptóticas y occidentales fueron detectados con ensayo de TUNEL.
También probamos el efecto antiproliferativo de AZD6244 en el control y las células transfectadas con siRNA Bim mediante ensayo con SRB y determinamos IC
50 valores. Se encontró que el IC
50 a AZD6244 aumentó 0,7 a 76,3 micras de Calu-6 células y 1,4 a 89,3 micras de H3122 células (Fig. 3B). El control y las células transfectadas con siRNA Bim se trataron con 3 M AZD6244 durante 72 horas, y las células se recogieron para el análisis del ciclo celular. Los resultados mostraron que después del tratamiento con AZD6244, el porcentaje de apoptosis (sub-G
1) las células se redujo de 38,6% a 8,4% en las células Calu-6 transfectadas con siRNA Bim y desde 29,8% a 7,5% en Bim siRNA transfectadas con células H3122 (Fig. 3C). El ensayo de TUNEL también indicó Bim siRNA transfección inhibe la apoptosis inducida por AZD6244, del 56,6% al 12,1% en Calu-6 y del 65,3% al 18,5% en las células H3122, respectivamente (Fig. 3D).
Además, la prueba si el aumento de expresión Bim es suficiente para inducir apoptosis. Un plásmido de codificación de longitud completa BimEL se transfectó transitoriamente a Calu-6 y la apoptosis de las células transfectadas se determinó mediante ensayo TUNEL. Se encontró que casi todas las células transfectadas con el vector de control son TUNEL-negativos después de 48 horas, mientras que las células transfectadas vector de expresión BimEL observó una elevación significativa de la apoptosis TUNEL-positivas (Fig. 3E).
El papel de FOXO3a en AZD6244 expresión inducida por Bim
se ha informado de que la activación de factores de transcripción FOXO induce la expresión de ARNm Bim y promueve la apoptosis de las células de una manera dependiente de Bim [19], [20]. factores de transcripción FOXO son fosforilados por AKT en tres sitios altamente conservadas, Thr32, Ser253, Ser315 y, lo que conduce a la retención citoplásmica y el deterioro de la actividad transcripcional nuclear FOXO. ERK también se ha demostrado que fosforilan FOXO3a y aumentar su exportación nuclear. En nuestro estudio anterior [5], se encontró que la expresión de p-AKT fue mucho mayor en las células resistentes que en las células sensibles. Como era de esperar, los niveles endógenos de p-Thr32-FOXO3a y p-Ser253-FOXO3a fueron más altos en las células resistentes que en células sensibles (Fig. 4A). No se observaron diferencias consistentes entre los dos grupos para FOXO3a total.
(A) expresión endógena de p-Thr32-FOXO3a, p-Ser253-FOXO3a, y se detectó FOXO3a completa en 8 líneas celulares. (B) se detectó la localización subcelular de FOXO3a en Calu-6 y H522 células con tinción de inmunofluorescencia después del tratamiento AZD6244. (C) Calu-6 células fueron ya sea o transfectada con un ARN de interferencia pequeño-FOXO3a específico (siRNA) transfectadas mock y luego se trató con 3 M AZD6244 durante 4 horas. Expresión de FOXO3a, Bim, PARP y la caspasa-9 se analizaron por transferencia Western. (D) En paralelo, Calu-6 células se fijaron con etanol y se tiñeron con yoduro de propidio; contenido de ADN se analizó por citometría de flujo. Los números representan porcentajes de
1 células en fase G sub-apoptóticas. Los datos representan uno de los tres experimentos independientes con resultados similares.
Columnas
, media;
Bar &, Dakota del Sur. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con las células de control transfectadas siRNA. Se llevaron a cabo (E) ensayos TUNEL tal como se describe en la Fig. 3D. Se muestran las fotografías representativas de Calu-6.
La activación transcripcional de FOXO3a está muy influenciada por su localización subcelular en un proceso estrechamente regulado por AKT y ERK. Se investigó si el tratamiento con AZD6244 causó FOXO3a a trasladarse al núcleo donde se activa. La tinción de inmunofluorescencia mostró que en las células sensibles Calu-6, el tratamiento con 3 M AZD6244 inducida considerable localización subcelular de FOXO3a desde el citoplasma al núcleo. Sin embargo, en las células H522 resistentes, no hemos detectado cambios obvios en la localización subcelular de FOXO3a después del tratamiento AZD6244. Por otra parte, hemos observado que en células no tratadas Calu-6, FOXO3a residía tanto en el citoplasma y el núcleo; en las células H522 no tratados, la mayoría de la FOXO3a residían en el citoplasma, y la tinción nuclear fue relativamente insignificante (Fig. 4B). Estos resultados son consistentes con los detectados en la transferencia Western de la expresión de p-FOXO3a (Fig. 4A).
Para examinar el papel de FOXO3a en Bim AZD6244 inducida, se evaluó el efecto de las construcciones de siRNA específicos para FOXO3a en células Calu-6 y H3122. Como se muestra en la Fig. 4C, siRNA desmontables de FOXO3a inhibió la expresión de FOXO3a, lo que resultó en una fuerte supresión de Bim inducida por AZD6244, la escisión de PARP y la caspasa-9 de escisión /activación después del tratamiento durante 24 horas. Análisis de la apoptosis después de FOXO3a siRNA transfección en células sensibles después del tratamiento AZD6244 mostró el porcentaje de sub-G
1 células apoptóticas disminuyó de 32,5% a 10,9% después del tratamiento con AZD6244 durante 72 horas (Fig. 4D). El ensayo TUNEL también mostró que FOXO3a siRNA transfección, inhibió la apoptosis inducida por AZD6244 desde 56,7% a 18,4% en Calu-6 (
P
. & Lt; 0,05, Fig 4E). Nuestros resultados sugieren que la activación es necesaria para la expresión FOXO3a Bim AZD6244 inducida.
caAKT transfección hasta regula la expresión de p-FOXO3a e inhibido AZD6244 la apoptosis inducida por
Nuestro estudio anterior mostró que la alta Como se muestra en la Fig. 4B.