Extracto
Los receptores citotóxicos naturales (NCR) son un conjunto único de activación de las proteínas expresadas principalmente en la superficie de las células asesinas naturales (NK). Los NCR, que incluyen tres miembros; NKp46, NKp44 y NKp30, están implicados críticamente en la citotoxicidad de NK contra diferentes objetivos, incluyendo una amplia gama de células tumorales derivadas de diversos orígenes. A pesar de que los ligandos de tumor de la NCR no se han identificado aún, la manera selectiva por el cual estos receptores diana células tumorales puede proporcionar una excelente base para el desarrollo de nuevas terapias anti-tumorales. Para probar el posible uso de los NCR como agentes anti-tumorales, se generaron proteínas de fusión solubles NCR-Ig en el que la región constante de IgG1 humana se fusionó a la porción extracelular del receptor. Se demuestra, utilizando dos líneas celulares diferentes humanas de cáncer de próstata, que el tratamiento con NKp30-Ig, inhibe drásticamente el crecimiento del tumor
in vivo
. Los macrófagos activados, se mostró a mediar una respuesta de ADCC contra las líneas celulares de próstata recubierto NKp30-Ig. Por último, las proteínas de fusión de Ig también se demostraron para discriminar entre la hiperplasia benigna de la próstata y el cáncer de próstata. Esto puede proporcionar una modalidad diagnóstica de reciente aparición en la difícil tarea de diferenciar entre estas condiciones patológicas muy comunes
Visto:. Arnón TI, Markel G, Bar-Ilan A, Hanna J, E Fima, Benchetrit F, et al . (2008) Aprovechamiento de las células asesinas NK soluble receptores para la Generación de terapia inmunológica del cáncer Novel. PLoS ONE 3 (5): E2150. doi: 10.1371 /journal.pone.0002150
Editor: Fu-Sheng Wang, Instituto de Enfermedades Infecciosas de Beijing, China
Recibido: 12 de febrero de 2008; Aceptado: April 1, 2008; Publicado: 14 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Arnón et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción se cree que
mecanismos inmunitarios para proporcionar una protección esencial contra el. desarrollo de enfermedades de cáncer. Los estudios de pacientes humanos y modelos de ratones han demostrado que las deficiencias de los componentes inmunológicos clave conducen a una mayor susceptibilidad al desarrollo de cáncer [1] - [3]. Las células asesinas naturales (NK) son un subconjunto importante de los linfocitos citotóxicos que pertenecen a la respuesta inmune innata y se caracterizan mejor por su capacidad de matar de forma espontánea células infectadas por virus y tumorales [4]. La eficiencia con la cual las células NK destruyen una amplia gama de líneas celulares sugiere un papel importante en la inmunovigilancia. De hecho, la acumulación de datos clínicos y experimentales demuestran la importancia de la actividad NK en la eliminación del cáncer de
in vivo
; en ratones, el agotamiento de células NK resultado en un aumento significativo del susceptibilidad a cáncer inducido químicamente [1], mientras que en los pacientes de leucemia reduce la citotoxicidad de NK fue mostrado correlación estricta con una mejora de la progresión de la enfermedad [5].
La la activación de las células NK se regula por un conjunto de receptores de la superficie que o bien inducen o inhiben la respuesta citotóxica [4], [6]. El principal mecanismo que controla la inhibición de NK se basa en el reconocimiento de moléculas MHC de clase I de receptores inhibidores NK, tales como los receptores asesinas-Ig (KIR) y el complejo /NKG2A CD94. Este mecanismo asegura que las células NK son inhibidas continuamente de matar a las células sanas que expresan niveles normales de proteínas de MHC de clase I [7]. Sin embargo, mientras que la expresión de MHC de clase I es esencial con el fin de inhibir la citotoxicidad de NK, regulación a la baja no es suficiente para inducir una respuesta, como también se requieren las señales de activación específicos. Estas señales son entregados por un conjunto de receptores que reconocen lisis clase no MHC ligandos I, expresados en las células diana [8]. Por lo tanto, las células NK no sólo son capaces de detectar la ausencia de MHC de clase I proteínas, pero también están equipados con receptores de la superficie que permiten la detección específica de sus objetivos
.
La principal NK receptores implicados en el reconocimiento y la matanza de activación tumores incluyen el homodímero de NKG2D y los tres receptores citotóxicos naturales (NCR) NKp46, NKp44 y NKp30 [8]. La contribución relativa de cada uno de estos receptores a la citotoxicidad de NK contra los tumores difiere, lo que indica la existencia de diversos ligandos de lisis específica [9]. De hecho, varios de estrés inducible proteínas celulares se han identificado como ligandos para el receptor NKG2D:. El MHC de clase I encadeno antígenos relacionados (MICA y MICB) y las proteínas de unión a UL16 (ULBP1-4) [10]
En contraste con la NKG2D, los ligandos celulares de las NCR Actualmente se desconocen y los únicos ligandos NCR identificados hasta el momento son proteínas de origen viral [11] - [14]. Sin embargo, la evidencia sustancial indica que existen ligandos celulares para los NCR y que su expresión es crítica para la capacidad de las células NK para destruir los tumores [9], [15] - [17]. Estos resultados están apoyados por estudios clínicos que muestran varios casos de LMA una correlación entre los niveles bajos de ligandos de NCR en pacientes con LMA y un mal pronóstico de la enfermedad [18]. Además, recientemente hemos demostrado que la deleción de un único gen NCR, el homólogo NKp46 ratón (NCR1), reduce significativamente la capacidad de las células NK para desactivar las células tumorales
in vivo
[19].
en la última década, los estudios de la inmunoterapia del cáncer se han centrado en gran medida en el intento de explotar la naturaleza altamente específica de la respuesta inmune adaptativa para el desarrollo de nuevos tratamientos. Este enfoque dio lugar a la generación de varios anticuerpos humanizados dirigidos contra antígenos tumorales específicos. El éxito clínico impresionante de la terapia basada en anticuerpos abrió la puerta de una intensa búsqueda de marcadores tumorales altamente específicos adicionales y desde 1995 varios anticuerpos han sido aprobados para uso clínico, mientras que más están actualmente siendo evaluado en ensayos de oncología [20], [21] .
para ampliar este método, varios instrumentos se han utilizado en un intento de identificar nuevos antígenos tumorales que serían adecuados para una gama más amplia de tipos de cáncer y seguir manteniendo reconocimiento selectivo. Los NCR representan un ejemplo único para las proteínas que han adquirido una amplia especificidad de este tipo y están altamente adaptados para reconocer las células cancerosas. Para traducir este potencial en una herramienta terapéutica, se han generado proteínas de fusión de inmunoglobulina (Ig) que contienen la porción extracelular del receptor fusionado a la región constante de la IgG1 humana. Por lo tanto, similar al enfoque de la terapia tumoral basada en anticuerpos, la hipótesis de las proteínas de fusión NCR-Ig se pueden utilizar como «misiles dirigidos; la porción extracelular proporciona especificidad tumor mientras que la región constante de la IgG1 humana (Fc) permite el reclutamiento de los componentes inmunes, que mejoran la eliminación del tumor específico. Aquí mostramos el uso potencial de este tipo de tratamiento utilizando modelos cánceres de próstata humanos.
Materiales y Métodos
Las células
Se utilizó la línea celular de cáncer de próstata humano DU145 y la próstata humana cáncer de la línea celular PC3 /
Luc
, que se preparó como se describe antes [14]. En pocas palabras, PC3.38, un clon de la línea celular de adenocarcinoma de próstata humano, derivado del PC3 (ATCC, CRL-1435), estaba infectado con el recombinante rLNC /
Luc
retrovirus (que expresa el gen de la luciferasa aguas abajo de promotor CMV) y seleccionados por G418 (400 mg /ml) que genera PC3 /
Luc
clon. La expresión estable de la luciferasa en cultivo celular se confirmó usando rutinariamente la cámara CCCD.
Las proteínas de fusión y análisis de citometría de flujo
La producción de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig y CD99- Ig fue descrito antes [13]. Controlar la proteína IgG1 humana (hIgG1 kappa, PHP010) se adquirió de Serotec (Oxford, Reino Unido).
La inmunohistoquímica
tejidos prostáticos, tanto hiperplásicos y malignos, se fijaron en formalina tamponada. El calentamiento por microondas de las secciones de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina en tampón de citrato se realizó para recuperar antígenos. Las secciones fueron teñidas por la diferente NCR-Igs o control-Ig (8 g /ml, concentración final), seguido de cabra biotinilado anti-humano-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Para la detección, el método del complejo avidina-biotina peroxidasa se empleó con el kit Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La tinción se clasificó como el porcentaje de células positivas (prostáticas hiperplásicas o malignas) de un total de 100 células. También se evaluó la intensidad de la tinción como 0 = no, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = fuerte. Las secciones teñidas se analizaron por dos patólogos. resultados inmunohistoquímicos fueron considerados como positivo cuando el porcentaje de células prostáticas positivamente teñidas superó 50% y la intensidad fue mayor que 1.
implantación del tumor y el tratamiento
Para el modelo DU145 que s.c. inyectado ratones desnudos macho con la línea de tumor de próstata humano DU145 (4 × 10
6). Dos semanas después de la inyección, cuando los tumores se hicieron visibles, los ratones fueron tratados con NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, el control de IgG1 humana o PBS. Los tratamientos se administraron 5 veces (días 2, 7, 15, 25 y 34) y se incluyen una mayor dosis inicial de las proteínas (20 mg /kg) seguido de dosis más bajas (10 mg /kg). Se evaluó la progresión del tumor cada tres días midiendo el diámetro de los tumores
.
Para el PC3 /
Luc
modelo, ratones desnudos macho (4-8 semanas de edad) fueron inyectados con 15 × 10
6 PC3 /em>
células en el sc espacio del flanco izquierdo de cada ratón. Tres semanas después de la implantación del tumor, los ratones fueron inyectados i.p. con 4 g /kg de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, controlar IgG1 humana o PBS cada dos días durante un período de 3-4 semanas.
formación de imágenes del tumor PC3 /
Luc
xenoinjertos
Todos los ratones fueron monitorizados para la expresión tumor antes y al final de los procedimientos de tratamiento. Sólo los ratones que dentro de los 21 días de la inyección expresan un tamaño detectable de tumor, como se evaluó por la cámara CCCD, fueron elegidos para manipulaciones adicionales. Antes de formación de imágenes, los ratones fueron anestesiados con 4% de hidrato de cloral (Fluka-Sigma, Israel). Cinco minutos antes de la imagen, los ratones fueron inyectados i.p. con 126 mg /kg de peso corporal de una solución acuosa de escarabajo lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Los ratones fueron colocados en una cámara hermética a la luz de un sistema de cámaras CCCD (Roper Científico, Princeton Instrumento, Trenton NJ) y se fotografiaron por primera vez con una luz controlada complementado con el fin de tomar la imagen de referencia corporal en escala de grises. Los fotones emitidos desde el ratón se detectaron a continuación, en completa oscuridad, recogido e integrado por un período de 2 min. Una imagen de pseudo color representa la intensidad de luz (azul como el menos intenso y rojo como la más intensa). Las medidas son una integración de la suma total de las señales detectadas, sustraída por el fondo integrado luz emitida por una superficie igual en el mismo ratón.
El análisis farmacocinético
in vivo
CB17.SCID ratones hembra fueron inyectados ip con una dosis única (5 mg /kg de peso corporal) de NKp46D2-Ig o NKp30-Ig. Los niveles de proteínas de fusión en el suero se determinaron en diferentes puntos de tiempo, incluyendo 0 (pre-dosis) 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 y 336 horas después de la dosis-administración. En cada punto de tiempo, 3 ratones fueron sacrificados muestras de sangre se recogieron en tubos de separación, que se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la centrifugación (para permitir la coagulación). Después de 30 minutos, los tubos se centrifugaron inmediatamente se recogió (10 minutos a 10.000 rpm a temperatura ambiente) y el suero. Los niveles de proteínas de fusión de Ig-NKp30 o NKp46D2-Ig en el suero se analizaron mediante un ensayo ELISA estándar.
Apoptosis ensayo
PC3 /em>
o DU145 células (50.000 /ml) se incubaron con 5, 10 o 50 g /ml de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig o PBS durante 2 horas en hielo. anticuerpo -linking Cross (contra IgG1 humana) fue que añadió a concentraciones finales que igual a 1/10 de la cantidad de proteína de fusión añadido previamente (0,5, 1 o 5 mg /ml). Las células se incubaron que a 37 ° C durante 48 horas y el porcentaje de células apoptóticas se determinó usando un análisis estándar Anexina V /PI.
ensayos de matanza mediada por macrófagos
A medida que las células efectoras Utilizamos macrófagos peritoneales procedentes de ratones nude CD1 5 días después de la inyección tioglicolato. macrófagos recuperados se que se activa durante 2 h con LPS (1 mg /ml). Marcado radiactivamente PC3 /
Luc
o DU145 células (1 * 10
4 /pocillo en placas de 96 pocillos plana) se incubaron con los macrófagos activados con LPS en las proporciones indicadas E:T. La lisis específica se determinó después de 48 horas.
Resultados
Reconocimiento de cáncer de próstata humano maligno primario por NKp30 y NKp46
NKp46 y NKp30 se expresan constrictively en la superficie de descansar como así como las células NK activadas y son predominantemente implicado en el asesinato de varias líneas de células tumorales
in vitro
. Sin embargo, dado que los ligandos de estos receptores celulares aún se desconocen, se sabe poco sobre su patrón de expresión y distribución en diferentes contextos patológicos.
El cáncer de próstata es el tumor sólido más frecuentemente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos y la la segunda causa de muerte por cáncer en los países occidentales [22]. Desafortunadamente, no existen terapias eficaces disponibles en la actualidad para la etapa fatal refractario a las hormonas de la enfermedad. Para probar si los tumores de próstata humanos son reconocidos por el NCR teñidas PC3 /
Luc Opiniones y líneas celulares DU145 con proteínas NKp30 y NKp46 fusionados a la IgG1 humana. Hemos demostrado previamente que el sitio de unión de NKp46 a diversos tumores se encuentra en la membrana de dominio proximal y la región de vapor del receptor (D2) y que la expresión de D2 fusionado a IgG humana (NKp46D2-Ig) permite un mejor reconocimiento de la diana las células [13]. Como se muestra en la figura 1a y b, tanto PC3 /
Luc
y DU145 células se tiñeron específicamente por NKp30-Ig y NKp46D2-Ig, pero no por el control de CD99-Ig (histogramas grises), lo que indica la expresión de ligandos para estos dos receptores activadores NK en líneas celulares de tumor de próstata.
(a, b) NKp30-Ig y NKp46D2-Ig se unen específicamente a líneas celulares de próstata humanos. PC3 /
Luc
(a) y DU145 (b) líneas celulares se tiñeron con NKp30-Ig, NKp46D2-Ig o controlar CD99-Ig, seguido de anticuerpo IgG1 anti-humano de ratón conjugado con PE. histogramas grises representan la tinción de fondo de la proteína de fusión CD99-Ig de control y los histogramas vacíos negros representan la tinción por cualquiera de NKp30-Ig o NKp46D2-Ig, como se indica en la parte superior de cada histograma. Esta cifra representa un experimento de tres realizados. (C) Tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma de próstata humano primario y la hiperplasia benigna de próstata (HBP) por NKp30-Ig y NKp46D2-Ig. Los cortes de fijado en formol y el adenocarcinoma de próstata humano embebido en parafina (panel superior) y la HPB (panel inferior) fueron recuperados por antígeno-tratamiento-microondas citrato. Las diapositivas fueron teñidas con NKp30-Ig, control negativo CD99-Ig o NKp46D2-Ig, seguido de complejo de HRP biotinilada-cabra-anti-humano-Fc y avidina-biotina. Sustrato para HRP era AEC (de color rojo) y las diapositivas fueron teñidas con hematoxilina contador. La figura muestra una tinción representativa con un aumento de X400. Flecha en NKp30-Ig tinción de adenocarcinoma (panel superior izquierdo) puntos a un representante de la tinción de membrana. intensidad de la tinción de los mejores paneles de la derecha izquierda y superior se considera como 2 (ver Métodos). (D) Expresión de ligandos NKp30 y NKp46 es abundante en los tumores malignos de próstata. Los cortes de diferentes pacientes que sufren de benigna (
n
= 8) o maligno (
n
= 9) los tumores de próstata se prepararon y se tiñeron como anteriormente. La tinción se realizó por triplicado. El análisis de intensidad de la tinción (0-3) y el porcentaje de células tumorales teñidas fue realizado por dos patólogos. La tinción positiva se definió cuando la intensidad de la tinción fue superior a 1 y abarca al menos el 50% de las células, como se describe en "materiales y métodos".
Para atenuar nuestras observaciones, hemos analizado la expresión de ligandos de NKp30 y NKp46 en adenocarcinoma de próstata primario y la hiperplasia prostática benigna (BPH) derivadas de pacientes humanos. cánceres prostáticos en parafina fijados con formol se tiñeron con NKp30-Ig, NKp46D2-Ig o las proteínas de fusión de control (tales como CD99-Ig). La figura 1c muestra ejemplos representativos de los tejidos teñidos y la figura 1d se resumen los resultados obtenidos a partir de 9 adenocarcinoma y 8 tejidos de cáncer de próstata benignas. Como se muestra, 7/9 y 5/9 adenocarcinomas de próstata se tiñeron positivamente por NKp30-Ig y NKp46D2-Ig, respectivamente, lo que indica la existencia de ligandos para NKp30 y NKp46 en las células malignas. La expresión de estos antígenos abarcaba 50-95% de las células tumorales con diferentes grados de intensidad y mostró tanto la distribución intracelular y membranal (Figura 1c, flecha en los puntos del panel superior izquierda de la tinción de membrana). Por el contrario, todas las secciones de la HBP probados fueron teñidas negativamente por NKp30-Ig o NKp46D2-Ig, como en la mayoría de los casos menos de 10% de las células se tiñeron y la intensidad fue abajo 1. Es importante destacar que, ni los adenocarcinomas ni las secciones de BPH se tiñeron por el control de la proteína de fusión Ig CD99-Ig (y otras proteínas de control, los datos no mostrados). Estos resultados demuestran que de manera similar a las líneas celulares de cáncer de próstata crecer en cultivo, los tumores primarios derivados expresan selectivamente ligandos para los receptores de lisis NK NKp30 y NKp46D2. Además, la expresión de estos ligandos desconocidos se induce solamente en etapas posteriores de la enfermedad en la que adenocarcinoma ya ha evolucionado.
NKp30-Ig inhibe el crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata DU145
in vivo
proteínas de fusión de Ig se han utilizado previamente como agentes terapéuticos eficaces en la práctica clínica [23]. Aquí se demuestra que tanto NKp30-Ig y NKp46D2-Ig se unen específicamente tejidos humanos procedentes de pacientes con cáncer de próstata, lo que indica la presencia de específico (aunque desconocido) ligandos (Figura 1B y C).
Para determinar si NKp30 y NKp46D2 fusionado a IgG1 humana podría mediar una respuesta eficaz contra el tumor
in vivo
, inyectamos ratones desnudos con la línea de tumor de próstata humano DU145. Dos semanas después de la inyección, cuando los tumores se hicieron visibles, (definido como día 1 en la Figura 2) los ratones se trataron con NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, controlar PBS IgG1 humana o (leyenda nota a la figura 2 para el curso de tratamiento y la evaluación del crecimiento) . En ambos grupos de control que recibieron la IgG1 humana (
n
= 10) o PBS (
n
= 10), los animales mostraron un rápido crecimiento de los tumores (figura 2). Del mismo modo, la NKp46D2-Ig ratones tratados (
n
= 9) mostraron un aumento gradual en el tamaño de los tumores, lo que indica ningún efecto terapéutico. En contraste, el tratamiento con NKp30-Ig (
n
= 10) dio lugar a una notable supresión del desarrollo de tumores; a partir de la segunda administración de NKp30-Ig (el día 7), el tamaño de los tumores se mantuvo constante durante tres semanas y sólo se detectó una progresión moderada en los días siguientes (figura 2). Por otra parte, en 5 de los 10 ratones que fueron inyectados con NKp30-Ig, los tumores desaparecieron después de la segunda inyección (día 7) y no vuelven a aparecer, incluso hasta dos meses después de la última inyección.
ratones desnudos macho inyectado con la línea de tumor de próstata humano DU145 (4 × 10
6), fueron tratados con NKp30-Ig (
n
= 10), NKp46D2-Ig (
n
= 9) , controlar la IgG1 humana (
n
= 10), o PBS (
n
= 10). Día 1 se define a las dos semanas después de la inyección, cuando los tumores se hicieron visibles. Los tratamientos se administraron 5 veces (días 1, 7, 15, 25 y 34, marcados por flechas) e incluyeron una dosis más grande inicial de las proteínas (20 mg /kg) seguido de dosis más bajas (10 mg /kg). La progresión tumoral se evaluó cada tres días midiendo el diámetro de los tumores. Los gráficos muestran el diámetro medio (mm) de los tumores en cada grupo medidos en días 1-45.
El tratamiento con NKp30-Ig reduce PC3 /
Luc
el crecimiento del tumor em
in vivo
el estudio de un proceso biológico complejo como el crecimiento del tumor y tratamiento incide en
in vivo
requiere un modelo que es a la vez lo suficientemente sensible y preciso para detectar la evolución, incluso sutiles. Recientemente, una nueva tecnología de imágenes basado bioluminiscencia que permite la detección no invasiva de las células tumorales
in vivo
se informó de [14], [24]. Esta estrategia se basa en el injerto de los cánceres humanos que expresan de forma estable un gen informador, como
luciferasa gratis (
Luc
), en ratones. La expresión de luciferasa permite
in vivo monitoreo
del tamaño y la distribución de los tumores relativa y puede por lo tanto también detectar el desarrollo metastásico. Además, este sistema es muy sensible y fiable en la detección de tumores pequeños que son difíciles o incluso imposibles de detectar en otros métodos, tales como las mediciones de tamaño tumoral directa o análisis FACS de los extractos tumorales [24]. Por esta razón, se utilizó la línea celular PC3 cáncer de próstata humano marcado por la expresión estable del gen de la luciferasa (PC3 /
luc
) que se aplicó anteriormente en otros similares
in vivo y modelos [14 ].
Para controlar el efecto de las proteínas de fusión de Ig-NKp30 y NKp46D2-Ig en la progresión de PC3 /
luc
línea celular de cáncer de próstata
in vivo
, nos los ratones inyectados con desnudo masculino
luc
células /PC3. Tres semanas después de la inyección (designado como "punto de inicio"), el crecimiento del tumor fue evaluada por la cámara CCCD y aquellos ratones que expresan los tumores que eran lo suficientemente grandes como para transmitir una intensidad de señal integrada de 100 recuentos de fotones y superiores, se eligieron para su posterior tratamiento con NKp30 -ig (
n
= 16), NKp46D2-Ig (
n
= 9) o con PBS como control (
n
= 8). El tratamiento incluye una inyección i.p. inyección de PBS o 4 mg /kg de peso corporal de la proteína de fusión pertinente, dado cada dos días durante un mes. Al final del período de tratamiento (designado como "punto final '), el tamaño del tumor se evaluó de nuevo en la cámara CCCD.
Como se muestra en la figura 3a y se resumen en la figura 4b, el tratamiento de ratones con NKp30-Ig tenía un efecto dramático en el crecimiento del tumor. Mientras que se observó en el grupo control (figura 3c y 4), rápido aumento en el tamaño del tumor en casi todos los animales (87,5%), NKp30-Ig para-tratamiento dio lugar a una reducción sustancial en la progresión del tumor; en 50% de los ratones tratados con NKp30-Ig del tumor se redujo drásticamente hasta 20% o más abajo de su tamaño original (considerado como "tratamiento eficiente '), 25% mostró efecto parcial mientras que el 25% no respondió y desarrollaron tumores progresivos. Por otra parte, en aquellos ratones en los que se obtuvo un tratamiento eficaz, no se observó una recaída incluso el 3 mes después de la última administración NKp30-Ig. Es importante destacar que, NKp30-Ig efecto terapéutico no era dependiente de su tamaño original del tumor, como la capacidad de respuesta o falta de respuesta no se correlacionaron con la señal inicial detectada del tumor, como se mide en el "punto de inicio" (indicado en números por encima de cada columna) .
ratones desnudos machos fueron inyectados con PC3 /
luc
células tumorales (15 × 10
6) en los flancos izquierdo SC. Tres semanas después de la implantación del tumor, los ratones se inyectaron (ip) cada segundo día durante un período de un mes con 4 mg /kg de NKp30-Ig (
n
= 16) (a), NKp46D2-Ig (
n
= 9) (b) o PBS (
n =
(c) 8). La progresión tumoral se monitorizó midiendo la emisión de luz de cada ratón individual en la iniciación ( "punto de inicio ') y al final (' punto final ') del período de tratamiento. Ejes Y representan los relativos (en porcentaje) los cambios en el tamaño del tumor después del tratamiento, tal como se calcula a partir de la emisión de luz integrada medido en cada punto de tiempo (los números se ha indicado anteriormente columnas). La contracción del tumor en un 20% o por debajo de su tamaño original fue referido como "tratamiento eficaz '. Esta cifra es un resumen de dos experimentos e incluye todos los ratones que se probaron. Tratamiento
NKp30-Ig suprimió significativamente el crecimiento de ambos DU145 y PC3 /
Luc
, pero con una efecto más prominente en PC3 /em>
Luc
. En contraste con NKp30-Ig y de acuerdo con los resultados presentados anteriormente (figura 2), el tratamiento NKp46D2-Ig sólo tuvo un efecto marginal (figura 3b y 4); 66,6% de los ratones tratados con NKp46D2-Ig mostró un crecimiento progresivo del tumor, mientras que 22,2% y 11,1% se curaron parcialmente o efectivamente tratados, respectivamente.
(a) Visualización de la progresión y la distribución
in vivo tumor
. La figura muestra una visualización de la imagen de un animal representativo de cada tratamiento. La escala a la derecha de cada figura se detalla el mapa de color del conteo de fotones. La emisión de luz integrado ( "I") se indica en la izquierda de cada foto. (B) Resumen del efecto del tratamiento. Tabla describe el efecto global de tratamientos, como se muestra en detalles en la figura 3.
La figura 4a muestra una ilustración de un ratón representante de cada grupo de tratamiento. En la mayoría de los casos no se observaron metástasis. Las mediciones tumorales descritas anteriormente (figura 3) representan la totalidad de la masa tumoral detectada en cada animal.
Estos resultados demuestran claramente el potencial terapéutico de la proteína de fusión NKp30-Ig para el tratamiento de cáncer de próstata humano
in vivo
.
Farmacocinética de NKp30-Ig y NKp46D2-Ig
en conjunto, nuestros resultados indican que NKp30-Ig, pero no NKp46D2-Ig, pueden suprimir el crecimiento tumoral
in vivo
. Este efecto selectivo fue sorprendente ya que ambos NKp30-Ig y NKp46D2-Ig de manera similar se unen a PC3 /
Luc
, DU145 (Figura 1 A y B) y muestras humanas de cáncer de próstata
in vitro gratis (figura 1c ). Por lo tanto, las diferencias entre el potencial terapéutico de NKp46D2-Ig y NKp30-Ig deben ser el resultado de otras características de las proteínas que influyen en la eficacia del tratamiento.
Uno de los factores más importantes en la terapia del cáncer es el t
medio del agente terapéutico. Con el fin de mediar un efecto antitumoral significativa las proteínas de fusión deben ser capaces de alcanzar el suero y permanecer estable durante varias horas
.
Para estimar la estabilidad relativa de la fusión de proteínas
in vivo
, los ratones se les dio una dosis única (5 mg /kg de peso corporal) de cualquiera de NKp30-Ig o NKp46D2-Ig y se controlará para los niveles de proteínas específicas en el suero cada pocas horas durante 14 días. El nivel máximo de proteínas medidos en el suero fue similar para ambos NKp46D2-Ig y NKp30-Ig (Figura 5A y B). Sin embargo, no se observaron diferencias claras en la cinética y la estabilidad de las dos proteínas de fusión; altos niveles de NKp46D2-Ig se identificaron en el suero después de 1 hora de la inyección, aunque disminuido rápidamente en la sangre y dentro de 2 horas se degradó casi 50% de la proteína. Por otra parte, después de 24 horas, sólo pequeñas trazas de NKp46D2-Ig se encontraron (figura 5b). Por el contrario, se detectaron niveles más altos de NKp30-Ig en el suero ya 30 minutos después de la inyección y se mantuvieron durante casi 2 días, disminuyendo solamente después de 120 horas (Figura 1a). Estas observaciones demuestran la estabilidad relativa de NKp30-Ig
in vivo
y pueden explicar, al menos parcialmente, el fracaso de NKp46D2-Ig para producir un efecto terapéutico.
i.p. se inyectaron ratones con una dosis (5 mg /kg) de NKp30-Ig (a) o NKp46D2-Ig (b). Se recogieron muestra de suero (a 0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 y 312 horas después de la inyección) y los niveles de NKp30-Ig o NKp46D2-Ig se determinó en un ensayo ELISA estándar. La figura muestra la cantidad promedio de proteínas de fusión detectados en el suero de tres ratones, medida en cada punto de tiempo. Las barras de error representan la media ± DE de triplicados.
NKp30-Ig potencia la citotoxicidad mediada por macrófagos-contra las células tumorales
in vitro
Se han propuesto varios mecanismos para la capacidad de los anticuerpos tumorales para mediar su efecto
in vivo
. Una forma posible en la cual dichos anticuerpos pueden inhibir el crecimiento del tumor es mediante la unión a receptores que están implicados en la regulación del ciclo celular [25] de la superficie. Por lo tanto, primero, si la prueba de unión de NKp30-Ig a sus ligandos desconocidos tumorales puede inducir apoptosis directa o detención del crecimiento de las células tumorales en cultivo. PC3 /
luc
y las células DU145 se incubaron con concentraciones crecientes de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig o controlar proteína de fusión Ig durante 48 horas en presencia de un anticuerpo de reticulación. Después del tratamiento, el porcentaje de células apoptóticas fue determinado por Anexina V y yoduro de propidio tinción (PI). La incubación de cualquiera de PC3 /
luc
o células DU145 con las diversas proteínas de fusión no tuvo efecto sobre las tasas de apoptosis (Figura 6a y b) como la apoptosis espontánea media de PC3 /
luc
y DU145 células (alrededor del 25% y 8%, respectivamente) fueron similares y no se vio afectada por ninguno de los tratamientos. Además, no se observó la detención del ciclo celular, tal como se evaluó por ensayos de incorporación de timidina (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares después de la incubación durante 24 h o 72 h (datos no mostrados).
(a, b) la apoptosis NKp30-Ig no induce en las células tumorales. PC3 /
luc
(a) o DU145 (b) las células se incubaron con concentraciones crecientes de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, Ig controlar o PBS en presencia de un anticuerpo de reticulación. Después de 48 horas, el porcentaje de células apoptóticas fue determinado por Anexina V y tinción PI. La figura muestra una de cada tres experimentos realizados. (C, d) NKp30-Ig puede mediar la opsonización tumor por los macrófagos. Marcado radiactivamente /
Luc gratis (c) o PC3 células DU145 (d) se incubaron con los macrófagos activados con LPS en las proporciones indicadas E:T. La lisis específica se determinó después de 48 horas. Las barras de error representan la media ± S.D. de triplicados. La figura representa una de cada tres experimentos realizados. (E) La infiltración de macrófagos en el tejido tumoral. tumores de próstata humanos (DU145) obtenidas en ratones desnudos fueron fijadas en 10% formalina tamponada. secciones incluidas en parafina se tiñeron en hematoxilina y eosina. Las flechas indican los macrófagos tumorales associated- (X380). Esta cifra representa probados uno de cada 5 secciones.
Dado que las células tumorales no demostraron ninguna sensibilidad intrínseca a NKp30-Ig
in vitro
, próximo a prueba la capacidad de NKp30- Ig para inducir muerte efector mediado por las células tumorales. Los macrófagos se han implicado previamente como actores importantes en el control del tumor dependiente de anticuerpos
in vivo
[26], [27]. Para evaluar la capacidad de NKp30-Ig para mejorar la lisis de las células tumorales macrófagos mediada, los ratones fueron inyectados primero (i.p.) con tioglicolato con el fin de causar una inflamación no patógena local y reclutar un gran número de macrófagos en la cavidad peritoneal. Cinco días después, los ratones se sacrificaron y se aislaron los macrófagos.