Extracto
Antecedentes
desmocolina 3 (DSC3), un miembro de la superfamilia de genes cadherina, se asocia con la patogénesis de algunos tipos de cáncer, pero sigue siendo en gran parte desconocida de su papel en el cáncer de próstata (CaP).
Métodos
nivel de expresión génica en DSC3 disponibles microarrays conjunto de datos CaP fue examinada usando la base de datos Oncomine. la expresión del transcrito DSC3 en el panel de línea celular de próstata y una cohorte independiente de tejido (n = 52) se estimó mediante PCR cuantitativa (Q-PCR). el estado epigenético de DSC3 promotor del gen en el CaP fue investigado por la posibilidad de subir tres conjunto de datos (serie de datos ENCODE Infinium 450K y dos secuenciación metilación) en la UCSC genoma navegador. Mientras pirosecuenciación análisis mide la metilación de ADN promotora, se obtuvieron estimaciones de Q-PCR para DSC3 transcripción reexpresión después de 5-Aza-desoxicitidina (5-Aza) de tratamiento. Relevancia clínica de la expresión DSC3 se estudió mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Por último, la proliferación de células de vigilancia estudios funcionales, la migración y la invasión se realizaron en líneas celulares de próstata después de la caída DSC3 mediada por siRNA o después de 5-Aza inducida por la re-expresión. marcadores de EMT vimentina y E-cadherina expresión se midió mediante Western Blot. Los análisis
Resultados
Los datos de microarrays reveló una disminución significativa en la expresión del transcrito DSC3 en el CaP, en comparación con las muestras benignas. análisis Q-PCR de una cohorte independiente reveló DSC3 transcripción baja regulación, tanto en líneas celulares de CaP y tejidos tumorales, pero no en su contraparte benigna. El examen de los datos disponibles NGS y Infinium identificó un papel para la reducción de mRNA DSC3 regulación epigenética en el CaP. Pirosecuenciación confirmó el aumento de la metilación del promotor DSC3 en líneas celulares de cáncer y la restauración de la expresión del transcrito al tratamiento con 5-Aza corrobora aún más este mecanismo de silenciamiento epigenético. Es importante destacar que el análisis de Kaplan-Meier de una cohorte resultados mostraron una asociación entre la pérdida de la expresión DSC3 y el aumento significativo del riesgo de recurrencia bioquímica. Los estudios funcionales indican un papel de transición epitelio-mesénquima en DSC3 regulada la migración celular /invasión.
Conclusión
En conjunto, nuestros datos sugieren que la metilación del ADN contribuye a la baja regulación de DSC3 en el cáncer de próstata , y la pérdida de DSC3 predice un mal resultado clínico
Visto:. J Pan, Chen y, Mo C, D Wang, Chen J, Mao X, et al. (2014) Asociación de DSC3 mRNA de Down-regulación en cáncer de próstata con la hipermetilación del promotor y de mal pronóstico. PLoS ONE 9 (3): e92815. doi: 10.1371 /journal.pone.0092815
Editor: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Francia |
Recibido: 13 Noviembre 2013; Aceptado: February 26, 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (81272809); Proyecto de Ciencia y Tecnología de Planificación de Guangdong (2011B050400021) y Guangdong clave Laboratorio de Urología, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (2010A060801016). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el segundo cáncer más común entre los hombres en todo el mundo y más de 900.000 hombres son diagnosticados con cáncer de próstata cada año [1]. Aunque el PSA se utiliza clínicamente como una prueba de detección con una sensibilidad del 80%, su utilidad es limitada debido a su baja especificidad (20%), lo que puede conducir a biopsias innecesarias y sobretratamiento [2]. A pesar del gran esfuerzo en la búsqueda de biomarcadores, la gestión clínica del cáncer de próstata sigue siendo un reto, debido a un funcionamiento óptimo de las herramientas de diagnóstico y pronóstico existentes [3].
Los estudios que identifican y caracterizan los eventos moleculares aberrantes específicos de cáncer también revelan candidatos con utilidad potencial biomarcador [4]. la metilación del ADN diferencial es común en el cáncer de próstata que se traduce en la hipermetilación en el promotor de los genes supresores de tumores, la hipometilación en los promotores de oncogenes, y la hipometilación global líder a la inestabilidad genómica en etapas posteriores del cáncer de próstata [5], [6]. Algunos de los genes hypermethylated comúnmente reportados en el cáncer de próstata incluyen GSTP1, RASSF1A, y APC, que han ayudado en el diagnóstico de cáncer de próstata y el pronóstico [7]. El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea, el número de genes hypermethylated aumenta a medida que progresa el cáncer de próstata [8], [9]. Es importante destacar que los eventos moleculares en CaP, tales como fusiones de genes se ha demostrado recientemente para impartir patrones de metilación del ADN diferencial [5], [9]. Esto implica que la heterogeneidad de la enfermedad circuito modular puede ser mejor reflejado por firmas epigenéticos diferenciales. Por lo tanto, la caracterización de las regiones diferencialmente metilado (DMR) tiene una alta probabilidad para producir biomarcadores potenciales con el uso clínico para el cáncer de próstata.
Los miembros de la familia de los desmosomas cadherina, incluyendo desmocollins y desmogleínas, se encuentran principalmente en las células epiteliales donde que constituyen las proteínas de adhesión de la unión célula-célula desmosome y son necesarios para la adhesión celular y la formación de desmosoma [10], [11]. alteración de la función de las proteínas de los desmosomas está asociado con varias enfermedades [12]. Una de las funciones interesantes es su capacidad para inhibir la motilidad celular, un fenómeno de importancia en el cáncer [10]. Desmocolina 3 (DSC3), un miembro de la superfamilia de cadherina, contribuye a desmosome mediada por adhesión célula-célula [11]. Estudios recientes han observado pérdida de DSC3 en varios tipos de cáncer, tales como metástasis en los ganglios linfáticos de carcinoma oral de células escamosas, el cáncer de mama y el cáncer colorrectal, en donde los niveles disminuidos asociados con la progresión del cáncer fueron reguladas por la modificación epigenética [13], [14], [15]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la expresión y de regulación de los mecanismos de DSC3 en el cáncer de próstata.
En este estudio, se analizó la expresión y los patrones de metilación DSC3 en cáncer de próstata, y lo más importante explorado el papel funcional de DSC3 y su posible valor de predicción clínica.
Materiales y Métodos
líneas celulares y muestras de tejido
Todas las líneas celulares de próstata obtenidas de la American Type Culture Collection y las células primarias de próstata PrEC comprados de Lonza se cultivaron a 37 ° C en una incubadora de cultivo de células con CO2 al 5%. Las líneas celulares de cáncer de próstata se mantuvieron en DMEM (Invitrogen) (Du145) y RPMI (LNCaP, 22Rv1) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). La línea normal de células de próstata RWPE se mantuvo en medios KSF (Invitrogen) más 10 ng /ml EGF (Sigma) y extracto de pituitaria bovina (BPE) y las células de la próstata primarios PrEC se cultivó en medios PrEGM (Lonza). muestras de tejido de próstata incluyendo benigna de la próstata (n = 18), el cáncer de próstata (n = 34) se obtuvieron del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (Guangzhou, China). Las muestras de tejido fueron de flash-congelado en nitrógeno líquido en el momento de la recogida y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN. consentimiento escrito informado se obtuvo de todos los pacientes para permitir el uso de muestras y los datos clínicos para la investigación. Este estudio en seres humanos fue aprobado por el Consejo de Ética de la Universidad Sun Yat-Sen.
extracción de RNA y RT-PCR cuantitativa
El ARN total aislado utilizando Trizol (Invitrogen) se utilizó en ADNc síntesis (superíndice III, Invitrogen) en presencia de cebadores aleatorios (Invitrogen). Cuantitativo PCR en tiempo real (Q-PCR) se realizó utilizando la energía SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems) en un sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosystems 7900HT. Todos los cebadores de oligonucleótidos se obtuvieron de Invitrogen y se enumeran en la Tabla S1. amplificación GAPDH se utilizó como control interno. El nivel de expresión de ARNm se determinó como se ha descrito anteriormente, utilizando el 2
-ΔΔCT método [16].
conjunto de datos ENCODE y Methylplex NGS análisis de datos de secuenciación
La matriz de Infinium 450K del grano y Reducido de representación de datos de metilación del ADN la secuenciación de bisulfito de consorcio ENCODE disponible como pistas de usuario en la UCSC genoma navegador se utilizaron en este estudio [17]. Las pistas personalizadas datos de secuenciación NGS Methylplex de línea celular benigna PREC y CaP línea celular LNCaP, próstata normal, benigno adyacente, el CaP localizado, y tejidos con CaP metastásico de un estudio recientemente publicado por Kim et al. (Genome Res 2011) también fueron cargados como pistas en la UCSC genoma navegador y se visualiza [9]. Estos datos profundo-secuenciación a partir de un conjunto de datos publicados anteriormente se deposita en NCBI GEO bajo el número de acceso: GSE27619.The DSC3 región genómica "Chr18: 28,570,052-28,622,781" (Hg19) (que incluye tanto el promotor y la región codificante) fue inspeccionado por metilación del ADN diferencial .
aislamiento del ADN genómico, la conversión de bisulfito y pirosecuenciación
El ADN genómico se extrajo con QIAamp DNA Mini kit (Qiagen) fue bisulfito convierte usando EZ kit de metilación del ADN de oro (Zymo Research) y se utiliza como plantilla para reacciones de PCR. metilación DSC3 se estimó usando el ensayo de metilación PyroMark DSC3 (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ADN de bisulfito convertido, cebadores DSC3, y Hotstart Master Mix (Qiagen) se utilizaron en una reacción de PCR para amplificar DSC3 regiones genómicas de interés de la muestra. La amplificación se obtuvo de 45 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 50 ° C, y 40 seg a 72 ° C, después de una activación de la enzima inicial de 15 min a 95 ° C, y de elongación final de 7 min a 72 ° C. Los productos de PCR se capturaron en perlas de estreptavidina-Sepharose (GE Healthcare), desnaturalizado para producir filamentos individuales, se lavaron y se recocieron a cebador de secuenciación, y la secuencia se determinó usando el sistema de PyroMark Q24 (Qiagen). La metilación media de tres posiciones individuales se considera en esta prueba. Primer secuencias se muestran en la Tabla S1. los niveles de metilación de forma individual para cada sitio CpG y sus valores medios calculados se muestran en la Tabla S2.
5-Aza-desoxicitidina Tratamiento
células
LNCaP sembradas en placas de 6 pocillos se trataron el día siguiente con concentraciones indicadas de 5-Aza-desoxicitidina (Sigma) o un volumen equivalente de vehículo (DMSO) durante cinco días consecutivos. El medio de crecimiento que contenía 5-Aza-desoxicitidina o vehículo fue reemplazado cada 24 horas. Al final del período de tratamiento, se aisló el ARN total para evaluar la expresión del transcrito indicado por tiempo real RT-PCR.
análisis de transferencia Western
se aisló la proteína de los lisados celulares, y las concentraciones de proteína eran determinado por kit BCA. 20 g de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (GE Healthcare). La membrana se incubó durante media hora en tampón de bloqueo que contiene leche 5% seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios, que incluyen anticuerpo E-cadherina (1:1000,3195S, Cell Signaling); anticuerpo vimentina (1:1000,5741S, Señalización Celular) o anticuerpo GAPDH (1:2000,5174, Señalización Celular). Después de varios lavados con solución salina tamponada con Tris que contiene Tween-20 (TBS-T), la transferencia se incubó con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa. Las señales se visualizaron por mayor sistema de quimioluminiscencia según el protocolo del fabricante (GE Healthcare).
ARN de interferencia
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una cifra y se transfectaron con DSC3 siRNA (Dharmacon ) o no siRNA dirigidos a dos veces. Las transfecciones se realizaron con OptiMEM (Invitrogen) y oligofectamine (Invitrogen) de acuerdo con protocolos estándar. Veinticuatro horas después de la transfección, se tripsinizaron las células y se sembraron por triplicado a 8.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos. eficiencia desmontables se determina por Q-PCR.
proliferación celular /migración /invasión de ensayo
Ensayo de proliferación celular se llevó a cabo usando el kit WST-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech Laboratories). Para la migración /invasión, las células fueron transfectadas o tratadas. Después de 24 horas, las células fueron sembradas en 8 micras insertos (BD Falcon) recubiertas con Matrigel (para ensayos de invasión) o no recubierto (para ensayos de movilidad) en una placas de cultivo de 24 pocillos. El suero bovino fetal se añadió a la cámara inferior como un atrayente quimioterapia. Después de 72 horas, las células no invasoras se retiraron suavemente con la esponja de algodón. células invasoras en el lado inferior de la cámara se tiñeron con cristal violeta y se secaron al aire. invasión relativa se cuantificó mediante la solubilización del colorante cristal violeta y la medición de la absorbancia a 560 nm.
Expresión Oncomine y Análisis Resultado
DSC3 expresión de los estudios de microarrays publicado independientes se extraen de la base de datos Oncomine. Los conjuntos de datos se pueden obtener también a partir de NCBI de la Expresión Génica Omnibus (GEO) bajo los números de acceso, GSE35988 (Grasso et al,.); PMID: 19737960; (Arredouani et al,.) GSE3325 (Varambally et al,.); GSE3933 (Lapointe et al,.); y GSE21032 (Taylor et al.,). Para el análisis de Kaplan-Meier de la Taylor et al., (Cancer Cell 2010) conjunto de datos [18], la recurrencia bioquímica se define como una ng 0.2 /ml aumento de PSA o la recurrencia de la enfermedad después de la prostatectomía, tales como el desarrollo de cáncer metastásico, si información recurrencia bioquímica no estaba disponible. los valores de expresión DSC3 se clasificaron en grupos de alta y baja de acuerdo con el punto de corte mediano.
Análisis estadístico
Todo el análisis estadístico se realizó utilizando el programa de software GraphPad Prism. Para los datos cuantitativos, se informó de grupos como media ± SEM y se compararon mediante la prueba t de Student no pareado o de una vía ANOVA. Para el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, se utilizó la prueba de log-rank. La significación estadística se estableció en p. & lt; 0,05
Resultados
DSC3 expresión se suprime en el cáncer de próstata
Para explorar la expresión de DSC3 transcripción en el cáncer de próstata y tejidos benignos, nos se utiliza la herramienta Oncomine para analizar varios estudios de microarrays de expresión génica publicada. Nuestro análisis reveló una fuerte reducción de la expresión mRNA DSC3 en tejidos de cáncer de próstata en comparación con las muestras benignas. La figura 1A representa los niveles de transcripciones DSC3 a través de cuatro estudios independientes publicados microarrays [19], [20], [21], [22]. Para corroborar experimentalmente esta observación, se ensayó un panel de líneas celulares de próstata LNCaP incluyendo, DU145, 22Rv1, a saber, células benignas y RWPE PrEC, por Q-PCR. En un patrón consistente con los datos de microarrays las células benignas mostraron expresión transcripciones más altos en comparación con las líneas celulares de cáncer (Figura 1B). se observó patrón de expresión similar para GSTP1, un gen metilado bien conocido en el cáncer de próstata que se utilizó como control positivo (Figura 1C)
.
(A) Boxplots representación de la expresión de mRNA DSC3 en cuatro microarray cáncer de próstata independiente conjuntos de datos, B = benigna, T = tumor. El primer autor y la significación estadística se indican. (B) Análisis de Q-PCR de DSC3 y expresión GSTP1 (C) en un panel de líneas celulares de próstata; PrEC prostático células epiteliales normales, línea celular de próstata RWPE-benigna, LNCaP, Du145, 22Rv1 son líneas celulares de cáncer de próstata metastásico.
DSC3 baja regulación en el CaP está mediado por la metilación del promotor
un examen detallado de la organización genómica DSC3 usando el navegador UCSC genoma reveló la presencia de una isla CpG en la región reguladora del gen DSC3 "Chr18: 28,570,052-28,622,781" (Hg19) que rodea el sitio de inicio de la transcripción. El análisis de metilación del ADN en esta región en ENCODE metilo 450K grano Arrays reducido Representación bisulfito de secuenciación (RRB) conjuntos de datos [17] mostró que el promotor del gen DSC3 se hypermethylated en LNCaP en comparación con la línea celular benigna PrEC (Figura 2A). Además, el análisis de un conjunto de datos de la metilación del ADN del cáncer de próstata independiente de [9] generada por Methylplex Next Generation Sequencing (M-NGS) también reveló promotor DSC3 metilación en LNCaP y no en PrEC. Además estos datos también mostraron un aumento de la metilación en muestras de cáncer de próstata localizado y metastásicos y no en las muestras benignas de la próstata o normales (Figura 2B). Tanto los datos de la línea celular de ENCODE [17] y la línea celular /conjunto de datos de tejido del estudio M-NGS por Kim et al. [9], revelaron la metilación del ADN se encontraba en una región altamente superposición dentro del promotor DSC3. La resolución de pares de bases de estos conjuntos de datos, nos permitió precisión en casa en la región cromosómica específica por la metilación del ADN. Utilizando la información anterior que el próximo investigado experimentalmente en la región cromosómica en DSC3 promotor para el cambio de metilación por pirosecuenciación análisis en un panel de líneas celulares de próstata. El apoyo a la tendencia observada con los datos públicamente disponibles, el análisis reveló pirosecuenciación hipermetilación frecuente de promotor DSC3 en líneas celulares de cáncer (3/3) en comparación con líneas de células benignas (0/2) (10% de metilación como punto de corte) (Figura 3B). Con el fin de probar si DSC3 se epigenetically silenciado por metilación en cáncer de próstata, se trataron células LNCaP con un inhibidor de la metilación del ADN, 5-Aza-desoxicitidina (5-Aza). la expresión del transcrito analiza por Q-PCR de ambos DSC3 y GSTP1, este último se utiliza como control positivo mostró la inducción de estos dos mRNAs por tratamiento de drogas 5-Aza, y pirosecuenciación mostraron que una reducción en la metilación del ADN de la región promotora DSC3 a 5- aza tratamiento (Figura 3C & amp; D). Estos datos indican que la transcripción DSC3 similar a GSTP1, se silencia epigenetically debido a la hipermetilación del ADN en el cáncer de próstata. En conjunto, estas observaciones sugieren que el promotor del gen DSC3 está sujeta a la metilación frecuente en ambos tejidos de cáncer de próstata y líneas celulares. Nuestros experimentos en el modelo de línea celular también prestan apoyo a la idea de que la transcripción de genes DSC3 está regulada por la isla CpG hipermetilación en el cáncer de próstata.
(A) El panel superior muestra la representación UCSC genoma navegador de la organización genómica del gen DSC3 presente en el cromosoma humano 18 (28.570.052 a 28.622.781), donde los exones se indican con cajas sólidas e intrones por la línea azul. La isla CpG (CGI) asociado con el promotor del gen DSC3 es representado como barra horizontal sólido verde. estado de metilación del ADN de las regiones sombreadas en amarillo (+/- 3 kb del sitio de inicio de la transcripción) se presenta a continuación. ENCODE Infinium 450K grano de matrices y redujo la representación de conjuntos de datos de secuenciación de bisulfito (RRB) mostró que el promotor del gen DSC3 se hypermethylated en LNCaP en comparación con la línea celular benigna PrEC. Las posiciones del CG ensayadas por estos métodos se representan como barras verticales de color de acuerdo a su estado de metilación. RRBs ENCODE, rojo (100%), amarillo (50%), verde (0%) están metilados; ENCODE Infinium 450K, naranja = metilado (puntuación ≥600), azul brillante = no metilado (0 & lt; puntuación ≤200). LNCaP (1): las células LNCaP tratadas con andrógenos; LNCaP (2): Datos de LNCaP de la Universidad de Duke; LNCaP (3): los datos LNCaP de la Universidad de Washington. (B) Representación de los datos de secuenciación NGS MethylPlex (PrEC, LNCaP, próstata normal, con CaP localizado adyacente benigno y tejidos con CaP metastásico) para DSC3. metilados regiones observadas en los grupos de muestras correspondientes se representan como picos y los números en el eje y denotan las alturas de los picos
(A) Secuencia del promotor DSC3 (Chr18: 28.622.751 a 28.622.860). y la región analizada por pirosecuenciación se dan en azul (Chr18: 28622791 a 28622820) y las posiciones del CG monitoreados dentro se indican en rojo. CGI, isla CpG. plot (B) Bar representa la media de la metilación por ciento en las tres posiciones del CG en líneas celulares de próstata. Blue-ciento de no metilación; Orange-metilación por ciento; Bi-sulfito convierte gDNA universalmente metilado y ADN fetal se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. (C) DSC3 expresión según la evaluación de Q-PCR en las células LNCaP tratadas con 5-Aza-desoxicitidina (5-Aza), GSTP1 se incluyó como un control positivo. (D) diagrama de barras representa la media de la metilación por ciento en las tres posiciones del CG en LNCaP tratadas con 5-Aza.
DSC3 es el regulado en el CaP y predice los pobres resultados clínicos
Para explorar la expresión de DSC3 en tejidos de cáncer de próstata, se realizó Q-PCR en un panel de tejidos de la próstata, incluyendo benigna de próstata (n = 18), el cáncer de próstata (n = 34). DSC3 expresión se redujo notablemente en el cáncer de próstata (2,4 ± 1,2) en comparación con los tejidos benignos (21,8 ± 16,3) (Figuras 4A y amp; B). Aproximadamente el 25-40% de los pacientes tratados con prostatectomía radical para el cáncer de próstata clínicamente localizado experimentarán recurrencia de la enfermedad, en un principio se indica por un aumento en el nivel sérico de PSA (recurrencia bioquímica) [23]. Por lo tanto, el próximo tratado de determinar si el estado de inactivación DSC3 se asoció con recurrencia bioquímica después de la resección quirúrgica. Hacia este examinamos la Taylor et al. (Cáncer de células de 2010) la expresión génica de datos [18], lo que caracteriza los tumores de 140 pacientes que tienen información de periodicidad (con 36 repeticiones). Las muestras se separaron en grupos de alto y bajo DSC3 en función del valor medio de expresión DSC3. El análisis de Kaplan-Meier reveló que los pacientes del grupo bajo DSC3 tenían un riesgo significativamente mayor de recurrencia que los pacientes del grupo de alto DSC3 (razón de riesgo: 2,352; IC del 95%: 1,198-4,446, log rank p = 0,0125) (Figura 4C). Esto sugiere que la pérdida de transcripción DSC3 en el cáncer de próstata puede predecir mala evolución clínica. En conjunto, estos datos sugieren DSC3, un miembro de la superfamilia de cadherina podría estar jugando un papel importante en la progresión del cáncer de próstata que conduce a una mala evolución clínica.
(A) Q-PCR para la transcripción DSC3 en una cohorte de próstata benigna ( n = 18) y cáncer de próstata (n = 34) tejidos. (B) Un histograma resumen de los valores de expresión de DSC3 en muestras benignas de la próstata y tumores. análisis (C) de Kaplan-Meier mostró que los pacientes del grupo bajo DSC3 tenían un riesgo significativamente mayor de recurrencia que los pacientes del grupo de alto DSC3 (P = 0,0125).
Efectos de DSC3 en el potencial de la migración /invasión de células de la próstata
DSC3 es una de las proteínas de adhesión de la unión célula-célula desmosome y es necesario para la adhesión celular. Para estudiar el papel de DSC3 en la próstata, las células transfectadas RWPE benignos con el control o DSC3 siRNA y ensayos de proliferación, migración e invasión realizadas. caída transitoria de DSC3 en RWPE consecuencia un aumento de la migración celular y la invasión (Figura 5C), mientras que no se observó ningún efecto significativo sobre la proliferación celular (Figura 5B). Para entender el mecanismo de la migración y la invasión regulado DSC3, hemos probado la expresión de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), marcador de E-cadherina y vimentina en RWPE tratados con el control o DSC3 siRNA. Curiosamente, DSC3 caída en RWPE aumento de la expresión de vimentina, mientras que la inhibición de la expresión de E-cadherina (Figura 5D). Esto sugirió que DSC3 podría regular la línea celular potencial de migración /invasión de próstata mediante la inducción de la EMT. Para determinar el efecto de DSC3 re-expresión de la función de células de la próstata, la migración y potencial invasivo de control y 5-Aza tratados se evaluaron DU145 células. La inducción de la expresión DSC3 al tratamiento con 5-Aza de las células DU145 resultó en una reducción significativa del potencial de migración /invasión de estas células. El tratamiento posterior de estas células con siRNA DSC3, parcialmente restaurado el potencial de migración /invasión (Figura 5F). Estos resultados rinda pruebas convincentes de que la disminución de la migración de células de cáncer /invasión después del tratamiento con 5-Aza se debe principalmente a la inducción de la expresión DSC3.
(A) DSC3 desmontables de siRNA en la línea celular de próstata benigna RWPE como se detectó por Q-PCR. * indica los valores que son significativamente diferente que el grupo no objetivo (NT). siRNA#2 y#3 siRNA son dos individuales DSC3 siRNA. (B) Efecto de DSC3 caída en la proliferación de las células RWPE por WST-1. (C) Efecto de DSC3 caída sobre la migración y la invasión a través Transwell través de Matrigel en las células RWPE. Las células migradas y invadidas se tiñeron con cristal violeta, solubilizado y se cuantificó midiendo la absorbancia a 560 nm. * indica los valores que son significativamente diferentes que el grupo no objetivo (NT). (D) y E-cadherina expresión de vimentina evaluado mediante análisis de Western blot en células tratadas con RWPE no objetivo o siRNA DSC3 siRNA. (E) Q-PCR para DSC3 utilizando ARN total extraído de la línea celular CaP Du145 tratados con 5-Aza o DSC3 siRNA. (F) El potencial de la migración y la invasión de los no tratados y 5-Aza tratados Du145 se evaluaron mediante el ensayo Transwell o Matrigel. Migraron y células invadidas se tiñeron con cristal violeta, solubilizado y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 560 nm.
Discusión
desmocolina 3 (DSC3) se encontró que era con frecuencia el regulado en varios tipos de cáncer como el de mama, oral, colorrectal y cáncer de pulmón, y la inactivación de DSC3 en estos tipos de cáncer fue causado por la hipermetilación del promotor [13], [14], [15], [24]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de DSC3 en el cáncer de próstata. Con este lo primero que comparó la expresión DSC3 en cáncer de próstata a partir de los estudios publicados microarrays de expresión génica utilizando la herramienta Oncomine. Cuatro conjuntos de datos CaP independientes revelaron que DSC3 se redujo significativamente en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con las muestras benignas. Nuestro análisis también mostró regulación a la baja constante de DSC3 mRNA en líneas celulares de cáncer. A continuación, exploramos diferentes conjunto de datos públicamente disponible para el estado de metilación del promotor de gen DSC3 en el cáncer de próstata. Múltiples líneas de evidencia basadas en el análisis utilizando plataformas independientes como Infinium metilación 450K grano de matrices (ENCODE), la reducción de la representación de bisulfito de Secuenciación (ENCODE), que caracteriza células LNCaP y PrEC, junto con el estudio de secuenciación MethylPlex NGS que caracteriza LNCaP, PREC y el cáncer de próstata clínico especímenes apoyado metilación diferencial de promotor del gen de DSC3 en el cáncer de próstata. Se demostró además que DSC3 gen es silenciado epigenético en cáncer de próstata, ya que el tratamiento de células LNCaP con el agente de metilación de 5-Aza, la transcripción de expresión DSC3 inducida. por lo tanto nuestro presente estudio demuestra que la expresión DSC3 se pierde con frecuencia en el cáncer de próstata debido a la hipermetilación del promotor similar a informes anteriores en otros tumores sólidos [15], [24]. Es importante destacar que la expresión DSC3 en muestras clínicas de cáncer de próstata fue capaz de predecir pobres resultados clínicos cuando se analizaron para la recurrencia bioquímica.
Un estudio funcional a cabo hasta ahora ha identificado DSC3 como un potencial gen supresor de tumores, la transfección estable de un vector de expresión DSC3 en cáncer de pulmón líneas celulares mostraron que la expresión ectópica de DSC3 inhibió la proliferación celular, el crecimiento independiente de anclaje, la migración, así como la invasión [24]. Curiosamente se observó un aumento en la migración celular y la invasión de células de la próstata RWPE cuando derribaron gen DSC3 utilizando dos siRNAs específicos independientes y no en el control no siRNA objetivo. El silenciamiento mediado por siRNA de DSC3 no mostró ningún efecto sobre la proliferación celular. Además, desmontables de DSC3 mientras que induce la expresión de la proteína vimentina, disminución de los niveles de E-cadherina, probablemente, lo que sugiere un EMT fenotipo similar a cuando se regula hacia abajo-gen DSC3. Si bien los mecanismos reguladores que controlan la expresión DSC3 no se entienden completamente, DSC3 es un gen de respuesta TP53 y la adición de tipo salvaje TP53 se encontró que era suficiente para inducir la expresión de DSC3 en el cáncer de mama [15], [25]. Por lo tanto pérdida de la función TP53 a través de la mutación somática, que se observa con frecuencia en el cáncer de próstata avanzado, puede dar lugar a la hipermetilación de sus genes diana. Una relación similar se observó con la expresión ERG y estado de metilación de su gen diana a saber TDRD1 en el cáncer de próstata [26], [27]. Sin embargo, se necesitan más estudios para explorar los mecanismos que regulan DSC3 en el cáncer de próstata.
Para aclarar la expresión de DSC3 en la cohorte de tejido de cáncer de próstata a partir de una población china, se realizó Q-PCR en tejidos de la próstata. expresión DSC3 fue significativamente y fuertemente disminuida en cáncer de próstata en comparación con los tejidos benignos. Dada su inactivación en líneas celulares y tejidos con CaP, queremos evaluar si la expresión DSC3 se asocia con un mal resultado clínico. En nuestro análisis hemos observado una correlación entre la baja regulación de DSC3 y significativamente mayor riesgo de recurrencia bioquímica. Aberrante de metilación del ADN de los promotores de genes es característico de las células del cáncer, y varios genes están epigenetically alterada de una manera específica del cáncer [28]. En pacientes con cáncer de próstata, las correlaciones entre la hipermetilación del promotor del gen específico y la puntuación de Gleason, el estadio patológico o la recurrencia del tumor es bien conocido [29]. GSTP1 promotor del gen de metilación es ampliamente caracteriza por varios grupos independientes y se encontró que tienen valor diagnóstico como marcador biológico de tejido o fluido corporal del paciente de cáncer de próstata con la ayuda en la detección no invasiva [30]. La hipermetilación de DSC3 se había informado anteriormente como un marcador para predecir el resultado clínico en cáncer colorrectal y de pulmón [15], [24]. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre grandes cohortes de tejido de cáncer de próstata, así como los fluidos corporales para evaluar más DSC3 como un biomarcador de metilación. Este tipo de investigación exhaustiva establecer la asociación entre las características clínicas de cáncer de próstata promotor DSC3 metilación y.
Conclusión
En resumen, DSC3 es el regulado en el cáncer de próstata por hipermetilación del ADN. Este es el primer estudio, para informar de un análisis detallado de DSC3 mRNA expresión y el gen promotor de la metilación en cáncer de próstata. El análisis de la expresión de DSC3 podría ser útil para predecir los resultados clínicos en pacientes con cáncer de próstata. son necesarios para ampliar estas observaciones e investigar específicamente el potencial diagnóstico /terapéutico de DSC3 en cáncer de próstata Los estudios futuros.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Resumen de las secuencias de los cebadores
doi:. 10.1371 /journal.pone.0092815.s001 gratis (XLSX)
Tabla S2.
Resumen de pirosecuenciación de tres posiciones del CG en líneas celulares de próstata
doi:. 10.1371 /journal.pone.0092815.s002 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Nos haría gustaría Proyecto ENCODE gracias al Dr. Mohan Saravana Dhanasekaran (Universidad de Michigan) para proporcionar los archivos de datos de secuenciación NGS MethylPlex meneo y discusión, Stephanie Huang para la lectura crítica, y.