Extracto
Aplicaciones
Para dilucidar el papel de impacto biológico y clínico de la hipermetilación aberrante (PH) en el cáncer de ovario (CO).
Diseño Experimental
PH de
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1, FKBP4
y
VGF
fueron evaluados por metilación específica de PCR cuantitativa (QMSP) en un conjunto de entrenamiento. Se seleccionaron dos genes (
VGF
y
PGP9.5
) para su posterior análisis QMSP en una validación independiente más grande (IV), creado con los datos clínicos disponibles. relevancia biológica de
también se evaluó VGF
gen.
Resultados
PH frecuencia de
PGP9.5
y
VGF
eran 85 % (316/372) y el 43% (158/366), respectivamente, en el conjunto de muestras IV PH mientras que no se observó en los controles. En 372 casos de OC con seguimiento disponibles,
PGP9.5
y
VGF
PH se correlacionaron con una mejor supervivencia de los pacientes [cocientes de riesgo (HR) para la supervivencia global (SG) fueron de 0,59 (95% Los intervalos de confianza (IC) = ,42-0,84, p = 0,004) y 0,73 (95% CI = 0,55-0,97, p = 0,028), respectivamente, y para la enfermedad de supervivencia específica (DSS) fueron de 0,57 (IC del 95% 0,39 a 0,82, p = 0,003) y 0,72 (IC del 95% 0,54-0,96, p = 0,027). En el análisis multivariado,
VGF
pH permaneció un factor pronóstico independiente para el sistema operativo (HR 0,61, IC del 95% ,43-,86, p & lt; 0,005) y DSS (HR 0,58, IC del 95%: 0,41 a 0,83, p & lt; 0,003 ). Por otra parte,
PGP9.5
PH se correlacionó significativamente con el grado más bajo, tumores en fase inicial, y con la ausencia de enfermedad residual. La expresión forzada de
VGF Hoteles en líneas celulares OC inhibe el crecimiento celular.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que
VGF
y
PGP9.5
PH son posibles biomarcadores para el carcinoma de ovario. Se requieren confirmación cohortes con seguimiento longitudinal en futuros estudios para definir el impacto clínico de
VGF
y
PGP9.5
PH antes de la aplicación clínica
Visto:. Brait M , Maldonado L, M Noordhuis, Begum S, M Loyo, Poeta ML, et al. (2013) Asociación de la metilación del promotor de
VGF
y
PGP9.5
ovárico con la progresión del cáncer. PLoS ONE 8 (9): e70878. doi: 10.1371 /journal.pone.0070878
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 18 Enero, 2013; Aceptado: 24 Junio 2013; Publicado: 27 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Brait et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el premio de desarrollo de la carrera con el Dr. Hoque del Programa Especializado de Investigación de Excelencia P50 CA098252 subvención (PI: TC Wu). El Dr. Hoque y el Dr. Begum están soportados por una concesión joven científico clínico del asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica. El Dr. Marchionni está apoyada por los Institutos Nacionales de Salud-Instituto Nacional del Cáncer P30CA006973 subvención. M. G. Noordhuis es un beneficiario de becas de los studiefonds holandés Cancer Society y Jo Kolk. Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis, interpretación de los resultados, la preparación del manuscrito, o la decisión de enviar el manuscrito para su publicación
Conflicto de intereses:. Tenemos la siguiendo intereses. En virtud de un acuerdo de licencia entre OncoMethylome Ciencias, SA (ahora MDxHealth) y la Universidad Johns Hopkins, D. S. tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad en las ventas de productos de diagnóstico que se describen en este artículo. D. S. posee OncoMethylome Ciencias, SA de valores, (ahora MDxHealth) que está sujeto a ciertas restricciones en virtud de la política universitaria. D. S. es un consultor pagado a OncoMethylome Ciencias, SA (ahora MDxHealth) y es un miembro pagado del Consejo Asesor Científico de la compañía. A. van der Zee era un consultor pagado a MDxHealth (Anteriormente OncoMethylome Ciencias SA). Autor del Ministerio de Salud es un miembro de PLOS ONE Consejo Editorial. Hay una solicitud de patente que incluye algunos de los datos que se publicarán aquí en este artículo: WO201 /099489, EP2401408A2 - cáncer ovárico metiloma. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de ovario (CO) es el segundo cáncer ginecológico más frecuente y la principal causa de muerte entre las cánceres ginecológicos en todo el mundo [1]. 22.240 nuevos casos fueron estimados para 2013 en los Estados Unidos, dando lugar a 14.030 muertes por este tipo de cáncer [2]. La edad media de los pacientes con OC es de 60 años, y el riesgo promedio de por vida para el desarrollo de OC en las mujeres es de 1 en 70 [3]. El setenta por ciento de los pacientes con OC enfermedad en estadio avanzado (estadio III o IV) en el momento del diagnóstico, con una tasa de supervivencia a 5 años del 15 al 20% a pesar del tratamiento agresivo [4], en comparación con los pacientes en fase inicial con una supervivencia tasa superior a 90% [3]. OC ha sido tratado generalmente con quimioterapia basada en platino ya menudo reaparece debido a la resistencia de platino adquirida. La respuesta clínica inicial a los fármacos basados en platino es un determinante importante de la evolución de los pacientes con OC. Los pacientes con tumores in vitro que demuestran la extrema resistencia a los medicamentos para el platino se encontró que eran en un aumento significativo del riesgo de progresión y muerte cuando son tratados con regímenes basados en platino estándar [5]. Por lo tanto, de gran importancia es el de identificar marcadores predictivos útiles que indican la sensibilidad de platino. Estos pueden permitir una mejor selección del tratamiento para la línea 1
st del tratamiento, posiblemente permitiendo un mejor resultado para los pacientes resistentes a platino. Determinación de marcadores apropiados para anticipar respuesta a quimioterapéutico estándar o agentes biológicos nuevas permitirá tasas de control y de curado mejorados para OC, así como la selección de la terapia adyuvante o la identificación de pacientes adecuados para los ensayos clínicos específicos. Por otra parte, la capacidad de predecir los resultados de OC después de la resección quirúrgica es crítica para los médicos, ya que afectaría el uso de quimioterapia y radiación terapias adyuvantes. Un indicador pronóstico independiente de la supervivencia OC lo tanto, sería de gran valor para los médicos y los pacientes en la selección de las opciones de tratamiento.
Se sabe que genéticos (cambios en la secuencia de ADN, tales como deleciones, amplificaciones y mutaciones) y los cambios epigenéticos (definidos como cambios heredables en la expresión génica que se producen sin cambios en la secuencia de ADN) contribuyen al desarrollo y la progresión de las células tumorales [6]. Los eventos epigenéticos más comunes incluyen la metilación del ADN y la acetilación de histonas [7], siendo la metilación del ADN, posiblemente, el aspecto más ampliamente estudiada de la epigenética con respecto a la carcinogénesis, y el enfoque clave de las intervenciones farmacológicas en ensayos clínicos. Se refiere a la adición de un grupo metilo en la posición 5-carbono del anillo de citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), pero sólo en las citosinas que preceden a una guanosina en la secuencia de ADN, conocida como CpG dinucleotide [8]. Hay regiones ricas en CpG conocidas como islas CpG que por lo general abarcan la región extremo 5 '(promotor, la región no traducida y el exón 1) de muchos genes con actividad supresora de tumores y normalmente no metiladas en las células normales [9]. El genoma humano en estas células normales no está metilado uniformemente, que contiene segmentos no metilados intercaladas con regiones metiladas [10], mientras que los patrones de las células de cáncer de metilación se alteran, de someterse a la hipometilación global de ADN [11], así como la hipermetilación de ciertos islas CpG [8] . Aberrante hipermetilación isla CpG (en particular en promotor de genes supresores de tumores '), así como la histona plomo modificación transcripcional inactivación y el silenciamiento de genes, que es un fenómeno común en las células cancerosas humanas y es probable que uno de los primeros eventos en la carcinogénesis [7]. En particular, la hipermetilación del promotor (PH) es un mecanismo frecuente de la inactivación de genes supresores de tumores (TSG) [7], [8] y el pH de ciertos genes relacionados con el cáncer se encontró que se asocia con la respuesta terapéutica y el desenlace de la enfermedad [12 ], [13].
En el presente estudio, se analizaron PH de 13 genes
(PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
VGF, FKBP4): perfil por cuantitativos fluorogénico en tiempo real PCR específica de metilación (QMSP) en un conjunto de entrenamiento y finalmente probó dos genes (
VGF
y
PGP9.5
) en un conjunto de validación independiente para evaluar si existe alguna asociación de PH de estos dos genes con los factores clínicos, incluyendo resultado global del paciente. Por otra parte, se estudió el papel funcional de VGF como una molécula anti-tumorigénico en líneas celulares derivadas de OC.
Materiales y Métodos
cohorte del estudio
Conjunto de Entrenamiento.
con el fin de componer el primer conjunto de muestras se obtuvieron muestras de tejido tumoral de ovario de nuestro archivo de tejidos, obtenidos de 33 pacientes con OC epitelial que se sometieron a cirugía terapéutica en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. También se obtuvieron muestras de 24 pacientes con OC que se sometieron a cirugía en la Universidad Campus Bio-Medico, Roma, Italia. Para ser incluido en la cohorte, un paciente elegible tenía que tener un diagnóstico confirmado de OC y una cantidad suficiente de material tumoral archivado para la extracción de ADN. Las muestras fueron conservadas en parafina, y un conjunto de diapositivas (10 micras de espesor) se tomaron de cada bloque. La información demográfica y clínica se obtuvo del registro de tumores computarizado en el Sistema de Salud de la Universidad Johns Hopkins o del registro en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad Campus Bio-Medico de Roma, Italia. Los tumores se clasifican de acuerdo con el sistema de estadificación FIGO [14]. A partir de los pacientes de Johns Hopkins (33), 16 pacientes presentaron enfermedad temprana etapa (15 etapa I y etapa 1 II) y 17 con enfermedad avanzada (14 etapa III y 3 etapa IV). Todas las muestras fueron carcinomas ováricos epiteliales con una histología seroso papilar. De los 24 pacientes procedentes de Italia, 10 tenían la enfermedad en estadio temprano (estadio I con 6, y 4 a la fase II), 13 tenían enfermedad avanzada (12 con estadio III y 1 con estadio IV) y 1 tenía fase desconocida. Dieciocho pacientes presentaban carcinomas epiteliales de ovario seroso (, endometrioide, mucinoso, escamosas, indiferenciado), uno con tumor de células germinales, cuatro presentaron tumores secundarios (metástasis), y 1 paciente tenía histología desconocida. El tejido epitelial de ovario normal se obtiene a partir de 13 pacientes que se sometieron a cirugía profiláctica para cualquier condición benigna en el Hospital San José Tec de Monterrey en México. Un resumen detallado del conjunto de entrenamiento de los pacientes está disponible en la Tabla 1 (A).
Validación Independiente (IV) Set.
Se analizó un conjunto de validación independiente de los más prometedores genes. Este conjunto independiente consistió en 372 tumores ováricos, tumores borderline 17 y 18 cistoadenomas ováricos (todas conservadas como muestras frescas congeladas). Estos pacientes fueron sometidos a cirugía en el Centro Médico de la Universidad de Groningen, Groningen (UMCG), Países Bajos. La información demográfica y clínica se obtuvo a partir del registro en el Departamento de Oncología Ginecológica, UMCG, Países Bajos. Un resumen detallado de los parámetros demográficos y clínico-patológicas de estas muestras se muestra en la Tabla 1 (B).
La aprobación para la investigación en seres humanos se obtuvo de la Universidad Johns Hopkins juntas de revisión institucional. Este estudio se clasificó para la exención en virtud de la política del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. para la protección de los seres humanos [45 CFR 46.101 (b)]. directrices del IRB fueron seguidos en cada una de las instituciones implicadas. Todos los materiales humanos usados en el estudio del Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad Campus Bio-Medico de Roma, Italia, se recogieron de acuerdo con las directrices del Comité Ético Local del Campus Bio-Medico de Roma. Las directrices del Comité de Ética Local, que son en su defecto conforme a la Autoridad de Protección de Datos italiana, determina que las muestras recogidas de forma retrospectiva desde el Departamento de Patología (fijado en formol e incluido en parafina de tejidos) no necesita tener ninguna aprobación y son exentos de obtener el consentimiento informado por escrito. De acuerdo con las normas de la Autoridad de Protección de Datos italiana (http://www.garanteprivacy.it/web/guest/home_en~~number=plural web doc n 1884019), instituciones italianas están en mora autorizados a utilizar las muestras y los datos clínicos correspondientes incluidos en el estudio. Todas las muestras recogidas en el Hospital San José Tec de Monterrey, Monterrey, México se recogieron siguiendo las reglas del comité ético. De acuerdo con las directrices de la ley mexicana para la Investigación en Salud (Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud, el artículo 23
er, 2
nd título, 1
Capítulo XXI: estudios retrospectivos son considerados como los estudios no riesgo y por lo tanto no requieren un consentimiento informado por escrito de los participantes o la aprobación del Comité ético. las muestras de México eran de muestras archivadas (, tejido incluido en parafina y fijado en formalina) y fueron recuperados de archivo de la patología de los hospitales . para los pacientes obtenidos de la UMCG en los Países Bajos, los pacientes dieron su consentimiento informado para la recogida y almacenamiento de muestras de tejido en un banco de tejidos para la investigación futura. Todos los datos relevantes de los pacientes se recuperaron y se transfieren a un anónimo, protegido con contraseña, la base de datos. la . la identidad de los pacientes estaba protegido por, códigos únicos de pacientes específicos del estudio y su verdadera identidad era conocido sólo a dos administradores de datos dedicadas de acuerdo con las regulaciones holandesas, estas precauciones significaba no era necesaria la aprobación de la junta de revisión institucional más (http: //www.federa .org /). Todos los datos de los pacientes fueron des-identificados por los investigadores en los 4 instituciones.
gen de selección
En el presente estudio, se seleccionaron un total de 13 genes para analizar su estado de metilación (usando QMSP ) por un enfoque de genes candidatos. Los genes fueron seleccionados en base a su metilación específica del cáncer en OC y /o cualquier otro tipo de cáncer de sólidos. Los genes seleccionados fueron:
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1, VGF
y
FKBP4
. Un resumen detallado de la información acerca de estos genes está disponible en el cuadro S1 S1 en el archivo.
Sobre la base de las alteraciones de los genes mencionados en el cáncer (que se analizan más en la sección de discusión), se analizaron todos estos 13 genes en una entrenamiento conjunto de muestras seleccionadas y dos genes (
VGF
y
PGP9.5
) para su posterior análisis de un gran conjunto independiente bien anotado de las muestras. Los criterios de selección de los genes que se analizarán en el conjunto de validación independiente fueron: a) la frecuencia de metilación en muestras de tumores en el conjunto de entrenamiento; b) la frecuencia de metilación en las muestras normales; C) de la novedad del gen para OC; D) Conocido funciones de cada gen mediante búsqueda bibliográfica /PubMed.
extracción de ADN
Después de-paciente identificación inicial, se revisaron todas las diapositivas OC histológicas originales para volver a confirmar el diagnóstico por un patólogo de alto nivel. Un bloque representativo fue recuperada para la extracción de ADN. Se tomaron diapositivas histológicas del tejido incluido en parafina y fijado en formalina. Las láminas fueron microdissected para obtener & gt; 70% de células neoplásicas. El epitelio ovárico normal microdissected fue aislado a partir de tejido de ovario resecado durante la cirugía, confirmando después la ausencia de cualquier maligno y /o proceso de pre-malignas en el tejido. Se extrajo el ADN utilizando el protocolo de extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol, como se describe anteriormente [15]. Para las muestras UMCG, se aisló el ADN mediante la extracción de la sal-cloroformo y precipitación con isopropanol estándar. El ADN precipitado se resuspendió en tampón Tris-EDTA (Tris 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). El ADN genómico se amplificó en una PCR multiplex de acuerdo con el protocolo BIOMED-2, para comprobar la calidad del ADN [16].
sodio tratamiento con bisulfito
ADN extraído de tumores primarios y epitelio ovárico normal era sometido a tratamiento con bisulfito de sodio, que convierte los residuos de citosina no metiladas en uracilo residuos, como se describe anteriormente [17]. Para ello, el kit EpiTect bisulfito (Cat No. 59104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) fue utilizado según las instrucciones del fabricante. Para las muestras UMCG, tratamiento con bisulfito se realizó con el kit de la metilación del ADN EZ según el protocolo del fabricante (cimógeno, BaseClear, Leiden, Países Bajos). Después del tratamiento, el ADN se almacenó a -80 ° C hasta su uso.
análisis de metilación
tratado con bisulfito se utilizó ADN como molde para la fluorescencia basada en PCR en tiempo real, como se describe anteriormente [ ,,,0],17]. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo por triplicado en un volumen final de 20 l que contenían 3 l de DNA-bisulfito modificado; 600 nM concentraciones de cebadores directo e inverso; 200 nM sonda; 0,6 U de polimerasa Taq Platinum (Invitrogen, Frederick, MD); 200 M concentraciones de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP; y MgCl 6,7 mM
2. Los cebadores y sondas fueron diseñados para amplificar específicamente los promotores de los 13 genes de interés y el promotor de un gen de referencia,
ACTB
; secuencias de cebadores y sondas y temperaturas de recocido se proporcionan en la Tabla S1 S2 en Archivo. Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando el siguiente perfil: 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en placas de 384 pocillos en un detector de secuencia 7900HT (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Beverly, MA) y se analizaron mediante un sistema detector de secuencia (SDS 2.4; Applied Biosystems). Cada placa incluyó muestras de ADN de pacientes, positivos (
in vitro
metilados en ADN de leucocitos) y negativo (ADN de leucocitos normales o de ADN a partir de una línea celular no metilado conocido) controles, y múltiples controles con agua. ADN de leucocitos de un individuo sano fue metilado
in vitro
con exceso de metiltransferasa SssI (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) para generar ADN completamente metilado, y diluciones en serie (90 a 0,009 ng) de este ADN se utilizado para construir una curva de calibración para cada placa. Todas las muestras fueron dentro del rango del ensayo de sensibilidad y reproducibilidad basado en la amplificación del estándar de referencia interno (ciclo umbral [TC] Valor
Red de ACTB 40). El nivel relativo de ADN metilado de cada gen en cada muestra se determinó como una relación del gen amplificado por PCR específica de metilación a
ACTB
(gen de referencia) y luego se multiplica por 1000 para la tabulación más fácil (valor promedio de los triplicados de gen de interés dividido por el [valor promedio de triplicados de
ACTB
] × 1000). Las muestras se clasificaron como no metilado o metilado basado en la sensibilidad del ensayo.
En
VGF
, también se llevó a cabo análisis de la secuencia de bisulfito para confirmar el estado de metilación en las líneas celulares derivadas de cáncer de ovario (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP 2008 y 2008 C13) y de las líneas celulares normales del epitelio superficial del ovario (OSE) (OSE2A, OSE2B y OSE7). Bisulfito de ADN tratado se amplificó por la región 5 'que incluye al menos una parte de la isla CpG dentro de 1 kb del sitio de inicio de la transcripción propuesta (TSS), contemplando la misma zona que los cebadores y sondas QMSP. Los cebadores fueron diseñados para no contener sitios CpG, y teniendo en cuenta la secuencia de bisulfito tratados, con el fin de amplificar la región, independientemente de su estado de metilación, que nos permite observar sin un sesgo de reacción. La secuencia de los cebadores fueron: delantero 5'-TTTGTTTTTGTTAGGGGGTTGTT-3 'y 5'-Reverse AACACCAATAAAAACTAATACTA-3'. Los productos de PCR se purificaron en gel usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Cada muestra de ADN amplificado se secuenció por el analizador de ADN Applied Biosystems 3700 utilizando adelante o atrás cebadores y Dye Terminator BD (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tres reacciones independientes se llevaron a cabo para confirmar los datos observados.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con IBM SPSS Statistics 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Para cada gen de un umbral de metilación (cut-off) por encima del valor más alto en el grupo de control se utilizan para lograr el 100% de especificidad en el conjunto de entrenamiento y los mismos valores de corte se aplicaron para
VGF
y
Hoteles en PGP9.5 conjunto de validación independiente, el análisis también se lleva a cabo utilizando un punto de corte en el 75
percentil de los valores de metilación. Las diferencias en la proporción de metilación entre las normales y cánceres se evaluaron mediante la prueba exacta de Fisher. Por otra parte, los valores de hipermetilación de cada gen también se compararon entre el cáncer y la normalidad mediante la prueba de Mann-Whitney. Las correlaciones de los niveles de metilación de genes se evaluó con coeficientes de correlación de Spearman. La asociación entre la hipermetilación y las características clínico-patológicas se evaluó mediante regresión logística, chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher, según corresponda. La supervivencia global (OS) se define como el tiempo desde el diagnóstico hasta la muerte por cualquier causa o la última visita de seguimiento con vida. la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) se define como el período desde el diagnóstico hasta la muerte como consecuencia de OC. Las diferencias en el sistema operativo y DSS de acuerdo con las características clínico-patológicos y la metilación de los genes se analizaron mediante análisis de regresión de Cox. Todas las variables significativas con un
valor de p Hotel & lt; 0,05 en el análisis univariado fueron incluidos en el análisis multivariante.
valor P
s de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todo el
Los valores de P ¿Cuáles son las dos caras.
Tratamiento
5-aza-2'- desoxicitidina de las células y la transcripción reversa-PCR en tiempo real y PCR con transcripción inversa
sembramos (densidad: 1 × 10
6) seis líneas de ovario de células cancerosas (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP 2008 y 2008 C13) líneas en su respectivo medio de cultivo y las mantuvo durante 24 h antes de tratarlos con 5 mM 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC; Sigma) durante 5 a 7 días. Renovamos medio que contiene 5-aza-DC cada 24 h durante el tratamiento. Manejamos el control de las células (modelo de tratamiento) de la misma manera, sin la adición de 5-aza-DC. También tratamos 5-aza-dC en combinación con tricostatina A (TSA, Sigma, St. Louis, MO), un inhibidor de la histona deacecetylase, y TSA solo. Las soluciones madre de 5-aza-dC se disolvieron en tampón fosfato salino PBS (pH 7,5). Preparamos ARN total usando Qiazol (Qiagen Inc. Valencia, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
cDNA fue sintetizado utilizando Superíndice III (Invitrogen, Vida Technologies, Carlsbad, CA), con una cantidad inicial de 1 ug de ARN, siguiendo su protocolo estándar. RT-PCR se realizó como se describe anteriormente [18]. Un microlitro de cada cDNA se utilizó para el tiempo real RT-PCR utilizando cebadores específicos y sonda TaqMan para el gen de interés. Las amplificaciones se llevaron a cabo en placas de 384 pocillos en un sistema de detección de secuencia 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión de los genes en relación con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se calculó basándose en el ciclo umbral (Ct) como 2
-Δ (Ct), donde? C
t = C
t, GENE- C
t, GAPDH y Δ (? C
t) =? C
t, aZA-? C
t, M (M, tratamiento de simulacro; aza, 5-aza-dC tratamiento) [19] .
Colonia ensayo de enfoque
Se comparó el perfil de metilación y la expresión de
VGF
en 3 líneas de células del epitelio superficial del ovario (OSE) normales (OSE2A, OSE2B y OSE7) y 3 pares de líneas celulares isogénicas OC (A2780 y A2780CP, 2008 y 2008C13, y IGROV y IGROV CP) diferentes en lo que respecta a la sensibilidad cisplatino. A continuación realizó ensayo de formación de foco para VGF usando dos líneas celulares (2008 y 2008C13) que eran metilado y no expresan
VGF.
líneas celulares OC 2008 y 2008C13 fueron sembradas en placas de 10 cm y transfectadas con vector de expresión de VGF (pCMV6-AC-VGF-GFP) y vector vacío (pCMV6-AC-GFP) (Origene, Rockville, MD). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se dividieron en varios platos. Desde el día siguiente, las células se cultivaron durante 2 semanas en medio que contiene 400 mg /ml y 30 mg /ml de G418 (Cellgro, Manassas, VA) para 2008 y 2008C13 respectivamente. Después de 2 semanas las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con ácido acético 25% y 75% de metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Se contaron las colonias y el número de colonias por placa se promediaron a partir de tres experimentos independientes (colonias & gt; 2 mm de diámetro se consideraron como positivas). Para confirmar la expresión de VGF, las células se recogieron 48 horas después se realizó la transfección y el análisis de transferencia Western, utilizando anticuerpo VGF (Santa Cruz, CA), normalizado por los niveles de beta-actina (anticuerpo de Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).
resultados
en general, la frecuencia de metilación en muestras de anticonceptivos orales y muestras de ovario normal (conjunto de entrenamiento) guía
Trece genes (
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
MGMT, VGF
y
FKBP4
) se determinó el pH utilizando QMSP en dos conjunto diferente de muestras. Las frecuencias de metilación observados de cada gen para el conjunto de entrenamiento se resumen en la Tabla 2A. En pocas palabras, en el conjunto de entrenamiento (total), los genes metilados con mayor frecuencia fueron:
PGP9.5
,
HIC1
,
ESR1 y VGF
. La frecuencia observada de metilación en esta serie fue del 19% (11/57) de
ESR1
, el 67% (38/57) de
HIC1
, el 28% (16/57) de
PGP9.5
y el 37% (21/57) de
VGF
. Cada uno de los últimos 4 genes fueron significativamente más metilado en OC de lo normal (p = & lt; 0,05 para cada gen). La combinación de los 4 genes analizados en el conjunto de entrenamiento, se observa la metilación en al menos 1 de los 4 genes en el 81% (46/57) de las muestras de anticonceptivos orales, con una especificidad del 100%.
este conjunto de muestras de tumores se analizaron para el propósito de pre-selección de genes solamente. Para maximizar la especificidad, se determinó un valor empírico de corte por encima del valor más alto en el grupo de control para cada gen. El valor de corte de cada gen se muestra en la Tabla 2A.
Asociación entre los cambios de metilación del ADN y los factores clínico-patológicos en el conjunto de entrenamiento
Se comparó el estado de metilación de los dos genes (
PGP9.5
y
VGF
) en 57 muestras del CO del conjunto de entrenamiento para demográficos y clinicopathological parámetros como la edad, el estadio, el tipo histológico, grado, el tabaquismo y la historia del consumo de alcohol de los pacientes, por logística análisis de regresión.
VGF
metilación fue más frecuentemente presentes en las etapas anteriores (Fase I y II) de OC en comparación con la etapa tardía (etapa III y IV) de los tumores [14/26 (54%) frente a 6/30 (20 %) metilado] (odds ratio, OR = 0,21, 95C.I. [,07-,7],
p
valor = 0,011). Las correlaciones con todos los otros parámetros clínico no fueron significativas con la metilación de cualquiera de los otros genes (Tabla 3A).
frecuencia de metilación de
VGF
y
PGP9.5
en la validación independiente (IV) y el conjunto de muestras de correlación clínico-patológica
sobre la base de la disponibilidad de muestras y la novedad de los genes para las frecuencias de OC y de metilación en el conjunto de entrenamiento, se seleccionaron 2 genes (
VGF
y
PGP9.5
) para poner a prueba en una cohorte independiente de muestras consistentes en 372 carcinomas, tumores borderline 18 y 17 cistoadenomas. Tanto
VGF
y
PGP9.5
metilación mostró un patrón específico de cáncer, con el 43% y el 85%, respectivamente, en la frecuencia de los tumores, mientras que el 0% en las normales, como se ha indicado anteriormente (Tabla 2B) ( Figura 1). Curiosamente se observó una elevada frecuencia de metilación de ambos genes en los tumores borderline y cistoadenoma (Tabla 2B) (Figura 1).
El cálculo de la
PGP9.5
o
VGF
gen a
relaciones
beta-actina se basan en los valores de intensidad de emisión de fluorescencia para ambos genes obtenidos por análisis en tiempo real PCR específica de metilación cuantitativa. Las relaciones obtenidas fueron multiplicados por 1.000 para la tabulación más fácil. Los valores de cero se indican en la parte inferior de la gráfica, que muestra la cantidad de las muestras, ya que no se pueden representar correctamente en una escala logarítmica. (A)
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valores de metilación en muestras normales (0/13, 0%), cistoadenomas (12/17, 71%), los tumores borderline (18/18, 100%) y los tumores ováricos ( 316/372, 85%). (B) La metilación de
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a través de los tipos histológicos (O.R = 0,24, 95% C.I. [0.14-0.40],
p
. & Lt; 0,001). (C)
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metilación se correlacionó significativamente con el grado más bajo (O.R = 0,24, 95% C. I. [0,14-0,40],
p = 0,012
). (D)
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metilación fue significativamente correlacionado con la ausencia de enfermedad residual (inferior a 2 cm) (OR = 0,41, IC del 95% [0,24-0,68],
p = 0,001
) . (E)
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metilación se correlacionó significativamente con la fase temprana de los tumores (OR = 0,26, IC del 95% [0,16 a 0,45]
p
. & Lt; 0,001 (E)
VGF
valores de metilación y frecuencias en muestras normales (0/13, 0%), cistoadenomas (5/16, 31%), los tumores borderline (6/18, 33%) y los tumores ováricos (158/366, 43 %).
En el conjunto de validación independiente, utilizando el análisis de regresión logística univariante, se comparó el estado de metilación de
VGF
y
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al demográficos y clinicopathological parámetros como la edad, el estadio, el tipo histológico, grado y presencia de enfermedad residual después de la cirugía.
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metilación (utilizando el punto de corte por encima del percentil 75 de la relación de metilación) se correlacionó significativamente con el grado más bajo y etapa temprana de los tumores (OR = 0,52, IC del 95% [0,31 hasta 0,86],
p = 0,012
) y (OR = 0,27, IC del 95% [0,16 hasta 0,45],
p
& lt; 0,001), respectivamente, así como con ausencia de enfermedad residual (OR = 0,41, IC del 95% [0,24-0,68],
p
= 0,001) y el tipo histológico (no seroso) (OR = CI 0,24, 95% [0,14-0,40],
p Hotel & lt; 0,001) (Tabla 3B) (Figura 1). Un resumen de metilación de
VGF
y
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con correlación clínico en el conjunto de validación independiente se muestran en la Tabla 3B.
Todos los 372 casos de carcinoma de ovario de la conjunto de validación independiente estaban disponibles para el análisis de seguimiento. Utilizamos riesgo proporcional de Cox modelo para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) de estos 372 pacientes asociados con PH de
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y
VGF
. La mediana de seguimiento de estos pacientes eran de 30 meses, que van desde 1 a 234 meses. En consonancia con la observación anterior, mediante un análisis de regresión de Cox univariante, encontramos correlación de supervivencia de los pobres con la etapa posterior (III /IV) del tumor (Hazard Ratio (HR) CI 8,22, 95% [4,91 a 13,76], p & lt; 0,001), y la presencia de enfermedad residual (HR 4,73, IC del 95% [3,47-6,44], p & lt; 0,001) (Tabla 4).