Extracto
A pesar de todos los biomarcadores basados en la sangre que se utilizan para controlar a los pacientes con cáncer de próstata, cáncer de próstata sigue siendo la segunda causa común de mortalidad por cáncer en hombres en los Estados Unidos. Esto se debe en gran medida a la falta de comprensión de las vías moleculares que son responsables de las formas agresivas de cáncer de próstata, el cáncer de próstata resistente a la castración y el cáncer de próstata metastásico. vías de señalización celular activadas por el
ErbB2
oncogén o la
RAS
oncogén se encuentran con frecuencia que ser alterado en el cáncer de próstata metastásico. Para evaluar y definir el papel de la vía /RAS ErbB2 en la metástasis del cáncer de próstata, hemos evaluado el impacto de
ErbB2 CD - o
RAS
-overexpression sobre el potencial metastásico de células de cáncer de próstata de cuatro líneas derivadas de tumores con diferentes sensibilidades de andrógenos. Para ello, transfectadas la DU145 humano, LNCaP y células de cáncer de próstata PC3 y las Myc-Cap células de cáncer de próstata murino con la forma activada de
ErbB2
o
H-RAS
y evaluamos sus potenciales metastásicos por tres ensayos complementarios, un ensayo de cicatrización de la herida, un ensayo transwell la motilidad, y un ensayo de invasión transwell. Hemos demostrado que mientras que la sobreexpresión de
erbB2
aumenta el potencial metastásico de las células de cáncer de próstata andrógeno-insensible (es decir, PC3 y DU145), no afectó a los potenciales metastásicas de las células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos (es decir, LNCaP y myc-PAC). Por el contrario, la sobreexpresión de
H-RAS solamente
aumentó la motilidad celular de las células Myc-Cap, que sobreexpresan el ser humano
c-MYC
oncogén. Nuestros datos sugieren que erbB2 colabora con andrógenos de señalización para promover la metástasis del cáncer de próstata, y que a pesar de RAS es uno de los efectores corriente abajo críticos de erbB2, no phenocopy erbB2 por su impacto en los potenciales metastásicas de líneas de células de cáncer de próstata.
Visto: Tome-García J, Li D, Ghazaryan S, L Shu, Wu L (2014) erbB2 Aumenta metastásico Potenciales específicamente en las células andrógeno-insensible cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10.1371 /journal.pone.0099525
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 11 Abril, 2014; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 17 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Tomé-García et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. están disponibles en el documento de todos los datos
Financiación:. fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina de Rutgers de Nueva Jersey. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer no cutáneo más común y la segunda causa de mortalidad por cáncer en los hombres en los Estados Unidos [1]. A pesar del aumento de cribado para la detección precoz y el seguimiento, la mortalidad específica por cáncer de próstata se ha mantenido en el mismo nivel [2]. Esto es probablemente debido tanto a la incapacidad de distinguir el diagnóstico entre los, cánceres de próstata no invasivos indolentes localizados y los cánceres localizados muy agresivos con alto potencial metastásico, y la mala comprensión de las bases celulares y moleculares de los cánceres de próstata metastásico [3].
Uno de los genes más estudiados en tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de próstata, es el
erbB2
o
HER2
o
NEU
oncogén. ErbB2 es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que consta de cuatro miembros (EGFR, ErbB2, ErbB3 y ERBB4) que actúan como receptores de tirosina quinasa [4] - [7]. Ellos son considerados como potentes mediadores del crecimiento celular y el desarrollo del cáncer [8] - [10]. En el cáncer de mama, la amplificación o sobreexpresión de
ErbB2
es un evento común que aparece en el 15-30% de todas las muestras [11], y
ErbB2
amplificación génica y /o sobreexpresión se han asociado con un pobre resultado clínico [12], [13]. En consonancia con un papel importante en la metástasis de ErbB2 cáncer de mama, la sobreexpresión de una forma constitutivamente activa de
ErbB2 gratis (es decir,
Neut
) [14] en los ratones es suficiente para desencadenar tumores de mama metastásico [15 ]. resultados inconsistentes Sin embargo, el papel potencial de ErbB2 en el desarrollo del cáncer de próstata metastásico no está claro en parte porque varios intentos para evaluar la frecuencia de
ErbB2
amplificación /sobreexpresión en muestras de cáncer de próstata humano cedido [16] - [25]. Curiosamente,
ErbB2
sobreexpresión se ha relacionado con cánceres de próstata metastásico resistente a andrógenos [26], lo que sugiere un posible papel de ErbB2 en la adquisición de los potenciales metastásicos de células de cáncer de próstata.
La sobreexpresión de
ERBB2
resultados en la inducción de varias vías de señalización, como la fosfoinositida-3-quinasa /proteína quinasa B (/AKT PI3K) y la vía y la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) [27]. Tanto la PI3K /Akt y de la vía MAPK regulan la proliferación celular y la supervivencia celular, y se han implicado en la metástasis del cáncer [28] - [30]. El director efector aguas abajo de ErbB2 que regula estas dos vías de la quinasa es la oncogénico
RAS
, aunque erbB2 también es capaz de activar PI3K /AKT independiente de la
RAS
activación [31]. Es importante destacar que la PI3K /AKT y MAPK son las únicas vías RAS-efectoras comúnmente mutado en los cánceres humanos [32].
RAS
oncogenes codifican tres asas monoméricas, H-ras, N-RAS, y K-RAS, que se activan cuando se une a GTP. Mientras que la inhibición de la
RAS
en células de cáncer de próstata PC3 independientes de andrógenos y células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos conducido a la detención del crecimiento y la apoptosis [33], la activación constitutiva de la vía Ras /MAPK en células de cáncer de próstata LnCaP promovido hipersensibilidad de andrógenos [34]. Además, el análisis inmunohistoquímico de muestras de cáncer de próstata sensible a las hormonas y refractarios a las hormonas mostró que el aumento de expresión de
N-RAS
se asoció con los cánceres de próstata refractarios a las hormonas, y se correlacionó con el tiempo más corto para la recidiva tumoral y redujo la supervivencia específica de la enfermedad [35]. En un modelo de ratón xenógrafo, la activación de dos vías efectoras RAS,
Raf /ERK
y
RalGEF
, en la línea celular de cáncer de próstata DU145 moderadamente metastática promueve la metástasis en el cerebro y la médula, respectivamente [ ,,,0],36]. Estos datos sugieren un posible papel de la RAS en la promoción de la metástasis en el cáncer de próstata humanos.
Para definir aún más la posible función de la vía /RAS ErbB2 en la promoción de la metástasis del cáncer de próstata, que han examinado los efectos de la sobreexpresión de
erbB2
o
RAS
en las propiedades metastásicas de tres líneas celulares de cáncer de próstata humano y una línea celular de cáncer de próstata murino con varios niveles de sensibilidad a andrógenos y diferentes potenciales metastásicos. Para ello, primero se transfectaron tres líneas de uso común de la próstata humana de células cancerosas (DU145, LNCaP y PC3) y una línea celular de cáncer de próstata murino (Myc-PAC) con la forma activada de
ErbB2
o
H-RAS
. A continuación, evaluaron los potenciales metastásicas de las células genéticamente modificadas por tres ensayos complementarios diferentes, un ensayo de cicatrización de la herida, un ensayo transwell motilidad, y un ensayo de invasión. Se encontró que mientras que la sobreexpresión de
ErbB2
aumentó potenciales metastásicos específicamente para las células del cáncer de próstata andrógeno-insensible humanos, la sobreexpresión de
RAS
no tienen efectos similares sobre los potenciales metastásicos, pero el aumento de la motilidad celular específica de
células c-MYC-overexpressing
murino Myc-Cap.
Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
Myc-Cap es un no metastásico, andrógenos -sensible línea celular murina cáncer de próstata que se establece a partir de los tumores de próstata primarios aislados del
Pb-Hi-Myc
ratones [37]. LnCaP [38], DU145 [39], y PC3 [40] son tres líneas celulares de cáncer de próstata metastásico humanos con diferentes sensibilidades de andrógenos y diferentes propiedades metastásicas (Tabla 1). LNCaP y PC3 líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640, y se cultivaron las células Myc-Cap en DMEM. Ambos medios se suplementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS). células DU145 se mantuvieron en DMEM: medio F12 de Ham (01:01) suplementado con suero de ternero recién nacido al 10%. Se utilizaron células anfotrópica Phoenix para la transfección retroviral y se mantuvieron en DMEM suplementado con 12,5% de FBS. células fibroblastos de piel humana senescentes BJ fueron generados por la senescencia replicativa [41] y se utilizaron como control positivo para el ensayo de actividad de β-galactosidasa. Ellos se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FBS. Todas las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2.
retroviral transfección
vectores retrovirales sobreexpresión
pBabe-puromicina-H- Ras
y
pBabe-puromicina-erbB2
, que sobreexpresan una forma mutada del ser humano
H-RAS
gen (
H-RAS
G12V
) y una forma activada humana constitutiva de
erbB2
gen (
Neut
), respectivamente, fueron regalos de Dr. Gustavo Leona. virus de alta titulación fueron producidos por fosfato de calcio transfección transitoria de construcciones retrovirales anfotrópicas en células de empaquetamiento Phoenix descritos como anteriormente [42]. Estamos infectados células de cáncer de próstata con retrovirus frescos utilizando métodos estándar, en presencia de polibreno (4 mg /ml). Las células infectadas se sometieron a selección con puromicina (2,5 mg /ml) durante cinco días. Las células resistentes a la puromicina se cultivaron en DMEM fresco sin puromicina durante un día antes de ser cosechada, ya sea para preparar lisados celulares para el análisis de Western Blot, o re-plateado para los experimentos. Todos los datos presentados fueron recogidos mediante el uso de células de al menos dos transfecciones independientes retrovirales que arrojaron niveles similares de
ErbB2
y
RAS
sobreexpresión.
Western Blot
Los lisados celulares con cantidades iguales de proteínas (30 g) se separaron en 8% SDS-PAGE, a excepción de ERK y Perk, para los que los lisados celulares se separaron en 10% SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron después electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa 0,45 M (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), que fue bloqueado a continuación a 4 ° C durante 1 hora con 5% de leche sin grasa seca en TBST (Tris 50 mM, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% de Tween 20 (w /v)). Las transferencias se incubaron con diluciones apropiadas de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C en TBST que contiene 3% de leche en polvo sin grasa. Los anticuerpos primarios utilizados para análisis de transferencia Western incluyen anticuerpos policlonales para H-RAS (sc-520), E2F1 (sc-193), E2F2 (sc-633), ERK1 /2 (sc-135 900), y p-ERK1 /2 ( sc-81492) de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX); actina (A2066) de Sigma (St. Louis, MO); ErbB2 (MS-730-PI) de Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA); AKT (4691S), p-AKT (4060S), p38 (9212S), y p-p38 (9211S) de Señalización Celular (Beverly, MA). Después de lavar 10 min por tres veces en TBST, las transferencias se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios de Perkin Elmer (Boston, MA) o bien en contra de conejo (NEF 812001EA) o contra ratón (NEF 822001EA) con una dilución de 1:3000 en TBST con 3% de leche. Después de tres lavados con TBST durante 10 minutos cada uno, las manchas de transferencia se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con ECL de Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL), y se expusieron a una película de rayos X para autorradiografía. Los anticuerpos contra la actina se utilizaron como controles de carga. La cuantificación de los niveles de proteína en base a las intensidades de banda en transferencias de Western se llevó a cabo con el software Image J (NIH, MD, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Herida Healing ensayo
La capacidad de migración de las células se evaluó mediante el uso de una herida ensayo de curación como se describe previamente, con ligeras modificaciones [43]. Las células se sembraron en placas de 35 mm y se dejaron crecer hasta alcanzar el 100% de confluencia. Las células confluentes se mantuvieron en las mismas condiciones de cultivo durante 48 horas para inducir la detención densidad y para minimizar la proliferación celular. placas confluentes se rascaron hasta tres veces con una punta de pipeta de 200 l, la creación de izquierda, centro, derecha y los arañazos /heridas que se cruzaron con dos líneas horizontales previamente dibujadas como puntos de referencia para las cuantificaciones. Después de que el rascado, las placas se lavaron una vez con medio para eliminar las células flotantes, y se sustituyeron con medio fresco. Las células se dejaron migrar a través de las heridas y fotos fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo usando un microscopio de contraste de fase hasta que la herida estaba completamente cerrado. Los puntos de tiempo en el que se tomaron las imágenes dependían de la capacidad migratoria de las diferentes líneas celulares estudiadas. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos una vez para validar los datos iniciales.
Motilidad de ensayo (Boyden Cámara Assay)
La motilidad de las células también se evaluó mediante el cultivo de células inserta desde BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), y siguiendo el protocolo establecido previamente con modificaciones menores [44]. Las células que se mantuvieron previamente en un medio de inanición con 0,2% de FBS durante 24 horas para minimizar la proliferación celular, se resuspendieron a una concentración de 2 × 10
5 células /ml en medio que contiene 0,2% de FBS. 1 × 10
5 células o 500 l de las suspensiones de células se sembraron en cada inserto, que fue previamente recubierto con 3 g /ml de solución de colágeno de cola de rata a partir de BD (Bedford, MA) durante la noche a temperatura ambiente. La cámara inferior contenía medio con 10% de FBS como un quimioatrayente. Las células se les permite pasar a través de la membrana porosa y se recogieron a diferentes puntos de tiempo que se determinaron empíricamente en base a la capacidad migratoria de cada línea celular. Las células no migratorias se retiraron a continuación de la superficie de las membranas utilizando hisopos de algodón. Las células que pasan a través de los poros de la membrana fueron fijadas y teñidas usando los núcleos Diff-Quick y kit de tinción de citoplasma (Dade Behring, Newark, DE). células migratorias teñidas se contaron bajo un microscopio. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos una vez para validar los datos iniciales.
Invasion Ensayo
La invasividad de las células se midió utilizando insertos de cultivo de células de BD Falcon (Franklin Lakes, NJ) siguiendo un protocolo previamente descrito con modificaciones menores [45]. Como en el ensayo de motilidad basado en transwell se ha descrito anteriormente, las células se mantuvieron en un medio de inanición con 0,2% de FBS durante 24 horas antes de la siembra para minimizar la proliferación celular. Los insertos se revistieron con 50 g /ml de solución de colágeno de cola de rata a partir de BD (Bedford, MA) durante 5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, los insertos se lavaron tres veces con medio libre de suero y se dejaron secar a 37 ° C durante la noche. Una vez seco, las membranas fueron cubiertas con 100 l de solución de colágeno a una concentración final de 1,3 mg /ml (para todas las células) o con 100 l de Matrigel (Cat.#356231) de BD (Bedford, MA) a una concentración final de se permitió a 300 g /ml (para sólo las células Myc-Cap), y para solidificar a 37 ° C. Las células se resuspendieron a una concentración de 2 x 10
5 células /ml en medio que contiene 0,2% de FBS. 1 × 10
5 células o 500 l de las suspensiones de células se sembraron en cada inserto. El procedimiento restante se realizó como se ha descrito anteriormente en la sección de ensayo de la motilidad. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos una vez para validar los datos iniciales.
Evaluación de la asociada a la senescencia Actividad β-galactosidasa
La actividad β-galactosidasa endógena de las células de cáncer de próstata era evaluado por tinción con X-gal como se describe anteriormente [46]. Las células sembradas en placas de 35 mm por triplicado se fijaron durante tres minutos a temperatura ambiente en 1X PBS que contenía formaldehído al 2%, y 0,2% de glutaraldehído. Después de dos lavados consecutivos con 1X PBS, se incubaron las células durante 16 horas a 37 ° C con una solución de tinción (2 ml por placa) que consiste de X-gal a una concentración final de 1 mg /ml en dimetilformamida, ácido cítrico 40 mM /tampón de fosfato de sodio pH 5,7 (0,1 M de ácido cítrico /fosfato de sodio 0,2 M), 5 mM de ferrocianuro potásico, 5 mM de ferricianuro de potasio, cloruro de sodio 150 mM, y cloruro de magnesio 2 mM. Fotos fueron tomadas con un microscopio de contraste de fase. Las células positivas y negativas fueron contados a partir de al menos tres campos diferentes.
Cell Rate evaluación del crecimiento del
células de cáncer de próstata se sembraron en placas de 6 pocillos por triplicado. La densidad de la siembra inicial se determinó empíricamente que nos permita contar al menos cuatro puntos de tiempo antes de que las células alcanzaron 100% de confluencia. Así, las células fueron sembradas como sigue: 70000 células de PC3, 35000 células para LnCaP, 120000 células para DU145, y 70000 células para Myc-CaP. Doce horas después de la siembra, las células se contaron usando un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA) que se normalizaron como el número de células de siembra correspondiente y para ser utilizado como el primer punto de tiempo. Las células fueron contados cada 12 h para PC3 y las líneas celulares de Myc-Cap o cada 24 h para las líneas celulares DU145 y LNCaP. Las tasas de crecimiento fueron estimados mediante el cálculo y la comparación de la pendiente lineal para cada curva de crecimiento.
Análisis estadístico
Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se determinó mediante la
t-test
Estudiante con un umbral de significación de
P Hotel & lt; 0,05. En todas las figuras, significaciones estadísticas se indican como
*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0.001.
Resultados
La sobreexpresión de
erbB2
y
RAS
oncogenes en el cáncer de próstata líneas celulares de la infección retroviral
Para sobreexpresan
erbB2
y
RAS
oncogenes en líneas celulares de cáncer de próstata, se transfectaron células de cáncer de próstata con
pBabe-Puromycin-
(
PBP-
) retrovirus basados sobreexpresan una forma activada de
erbB2 gratis (
PBP-erbB2
) o una forma mutada de
H-RAS gratis (
PBP-RAS
). Como se muestra en la Figura 1, el análisis de transferencia de Western indicó que la transfección de células con
PBP-RAS
retrovirus llevó a moderada hasta-reglamentos de
RAS
que van desde 1,5 veces (para LnCaP) a 4,7 veces (por PC3), y que la transfección de células con
PBP-erbB2
retrovirus llevó a moderada up-reglamentos de
erbB2
que van desde 2,5 veces (para DU145) a 4,0 veces (para Myc CaP) Curiosamente, a pesar de
RAS
sobreexpresión no cambió los niveles de proteína de erbB2,
erbB2
sobreexpresión elevados niveles de proteína de RAS (2,9 veces) específicamente en las células Myc-Cap (Figura 1), que sobreexpresa el humano
c-MYC
oncogen [37].
erbB2 y los niveles de proteína RAS fueron evaluados por transferencias de Western utilizando anticuerpos contra H-RAS o erbB2 para los lisados celulares totales preparados a partir de cáncer de próstata Las células transfectadas con cualquiera de los retrovirus de control (
PBP
), o retrovirus que sobreexpresan
PBP CD -
H-RAS gratis (
RAS
) o
PBP -ERBB2 gratis (
erbB2
). Blots con anticuerpos contra la actina sirvió como control de carga. Los números en blanco representan los cambios veces en ErbB2 o los niveles de proteína RAS en
ErbB2 CD - o
RAS
-overexpressing células en relación a los de sus correspondientes
PBP
control de las células después de la actina normalización.
la sobreexpresión de
erbB2
conduce a aumentos moderados en el crecimiento celular en LNCaP, DU145 y PC3 células
Teniendo en cuenta que la activación de la
erbB2
/
RAS
ha ruta en células de cáncer de próstata de señalización pueden afectar sus tasas de crecimiento, lo que podría influir en el análisis para evaluar su potencial metastásico, se llevó a cabo un ensayo de curva de crecimiento utilizando células asíncronas. Como se muestra en la Figura 2,
ErbB2
sobreexpresión dado lugar a aumentos moderados en las tasas de crecimiento para todas las tres líneas celulares de cáncer de próstata humano: un promedio de aumento del 43% para las células LNCaP, aumento del 33% para las células DU145, y aumento del 25% para células PC3. Sin embargo, la sobreexpresión de
ErbB2
no afecta a la tasa de crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata murino, Myc-PAC. Por el contrario,
RAS
sobreexpresión no tuvieron efectos significativos en las tasas de crecimiento de cualquiera de las cuatro líneas celulares (Figura 2).
tasas de crecimiento celular fueron evaluados por conteo celular cada 12 horas o 24 horas para diversas células de cáncer de próstata que fueron transfectadas con el retrovirus de control (
PBP
), o retrovirus que sobreexpresan o bien
PBP-H-RAS gratis (
RAS
) o
PBP-erbB2 gratis (
erbB2
).
La sobreexpresión de
RAS
Reduce Migración celular tarifas de LNCaP y DU145 Líneas celulares
los efectos de
erbB2
y
RAS
sobreexpresión de los potenciales metastásicos de LnCaP, DU145, PC3, y las líneas celulares de cáncer de próstata Myc-Cap fueron evaluados por primera vez por la realización de un ensayo de curación de la herida. Para superar los efectos potenciales de una mayor proliferación celular en
ErbB2-overexpressing
células (Figura 2) en el ensayo de cicatrización de la herida, se produjo un paro densidad celular mediante el mantenimiento de placas confluentes de 48 horas antes de hacer rasguños /heridas. Como se muestra en la figura 3, la sobreexpresión de
erbB2
y
RAS
mostró diversos efectos sobre las tres líneas celulares de cáncer de próstata humanos. En concreto, mientras que la sobreexpresión de
ErbB2
no tuvo un impacto significativo sobre las tasas de migración de todas las tres líneas celulares de cáncer de próstata humano, la sobreexpresión de
RAS
disminuyó significativamente las tasas de migración de células LNCaP y DU145 líneas. En comparación con las líneas celulares de cáncer de próstata humano, la línea celular de cáncer de próstata murino Myc-CaP parecía tener las tasas de migración más bajas, como lo demuestra el hecho de que no han logrado cerrar por completo la herida antes de haber comenzado a crecer de nuevo en torno al punto de tiempo de 32 horas (datos no mostrados), sin tener en cuenta el estado de
erbB2 CD - o
RAS
-overexpression (Figura 3). Sin embargo,
ErbB2
-. O
RAS
overexpressing Myc-Cap células tenían un aumento moderado pero estadísticamente no significativa en las tasas de migración en comparación con las células control (Figura 3) guía
las tasas de migración celular se estimaron por una herida de ensayo para la curación de las células del cáncer de próstata que fueron transfectadas con cualquiera de los retrovirus de control (
PBP
), o retrovirus que sobreexpresan
PBP CD -
H-RAS
(
RAS
) o
PBP-erbB2 gratis (
erbB2
). paneles de la izquierda mostraron porcentajes de heridas permanecido en diferentes puntos temporales. Se estimaron los porcentajes de heridas basado en el promedio de 12 mediciones en cada plato que refleja las mediciones de cuatro secciones uniformemente distribuidas en cada una de las tres heridas /rasguños en cada placa. Los datos se presentan como media ± SD de tres repeticiones. paneles de la derecha muestran imágenes representativas tomadas en diferentes puntos de tiempo. Todas las imágenes fueron tomadas en la misma escala con una barra de escala de 200 micras que se muestra en la primera imagen.
ErbB2
sobreexpresión célula aumenta motilidades del DU145 andrógeno-insensible y células PC3 y
RAS
sobreexpresión Aumenta la motilidad celular de las células Myc-Cap
Para complementar los datos presentados anteriormente cicatrización de la herida, también se evaluó el efecto de la sobreexpresión de
erbB2
y
RAS
en la motilidad de las células de las líneas celulares de cáncer de próstata en un ensayo de la motilidad celular basada en transwell utilizando insertos de membrana porosa en cultivos polarizados. Mientras que la curación de heridas ensayo mide la motilidad celular lateral como resultado de la interrupción de las interacciones célula-célula [47], cámaras de Boyden transwell ensayo mide la migración-quimio atractivo, que a diferencia del ensayo de cicatrización de la herida, es independiente de roturas en las uniones célula-célula [48]. Por lo tanto, estos dos ensayos son complementarias y se utilizan a menudo en paralelo para obtener información biológicos en diferentes tipos de migración celular. Para minimizar el impacto de las tasas de crecimiento de células diferenciales de
ErbB2
sobreexpresión en el ensayo de la motilidad, que inducido por la detención del ciclo celular mediante el mantenimiento de las células bajo condiciones de privación de suero durante 24 horas antes de realizar el ensayo de la motilidad. Como se muestra en la Figura 4, la sobreexpresión de
erbB2
aumentó significativamente motilidades celulares de las dos metastásico más, líneas celulares andrógeno-insensible, células DU145 y células PC3, con un aumento del 30% y un aumento de 6 veces, respectivamente . Por el contrario,
erbB2
sobreexpresión redujo significativamente la motilidad de las dos líneas celulares, humilde o no metastásicos sensibles a los andrógenos de cáncer de próstata, LNCaP y Myc-CaP. Además, mientras que
RAS
sobreexpresión redujo significativamente la motilidad de las células LNCaP y PC3 células, se incrementaron sustancialmente la movilidad de las células Myc-PAC, que sobreexpresan el
c-MYC
oncogén.
motilidades celulares se evaluaron mediante un ensayo transwell basada en la motilidad de las células del cáncer de próstata que fueron transfectadas con cualquiera de los retrovirus de control (
PBP
), o retrovirus que sobreexpresan
PBP CD -
H-RAS gratis (
RAS
) o
PBP-erbB2 gratis (
erbB2
). Cada gráfico de barras que muestra el número relativo de células que han pasado por los insertos transwell /membranas, que se tiñeron y se contaron bajo un microscopio para al menos 10 campos por inserción. Los datos se presentan como media ± SD de tres repeticiones. Imágenes representativas tomadas en un momento dado se muestran debajo de cada gráfico de barras. Todas las imágenes fueron tomadas en la misma escala con una barra de escala de 200 micras que se muestra en la primera imagen.
ErbB2
sobreexpresión Promueve la invasión de células DU145 en el andrógeno-insensible y células PC3
Los potenciales metastásicos de
erbB2
- o
RAS
-overexpression en varias líneas celulares de cáncer de próstata se evaluaron adicionalmente mediante la evaluación de su capacidad invasiva relativa mediante un ensayo de invasión basada en el uso de transwell insertos de células revestidas con una matriz de colágeno. Este ensayo de invasión permite que las células pasan a través de una matriz de colágeno 100 mu M de grosor de un medio bajo en suero que contiene a un entorno de suero enriquecido. Como se muestra en la Figura 5, la invasividad de las células DU145 andrógenos insensible y células PC3 se aumentó sustancialmente en presencia de
erbB2
sobreexpresión, pero no en la presencia de
RAS
sobreexpresión. Estos datos son consistentes con los datos del ensayo de la motilidad basado en transwell que muestran que la sobreexpresión de
erbB2
en las células DU145 y células PC3 llevado a un aumento de la motilidad celular (Figura 4). Consistente con sus celdas ni células LNCaP bajo o no hay potenciales metastásicos, ni Myc-CaP parecía ser capaz de penetrar en la matriz de colágeno incluso después de 96 horas de incubación (datos no mostrados). Es importante destacar que la sobreexpresión de
ErbB2
o
RAS
era insuficiente para permitir cualquiera de las células Myc-Cap o células LNCaP a pasar a través de la matriz de colágeno (datos no mostrados).
Cell invasividad se evaluó mediante un ensayo de invasión basado en transwell para las células de cáncer de próstata que fueron transfectadas con cualquiera de los retrovirus de control (
PBP
), o retrovirus que sobreexpresan
PBP
-
H-RAS
(
RAS
) o
PBP-erbB2 gratis (
erbB2
). Cada gráfico de barras que muestra el número de células que han pasado por la matriz de colágeno o bien 72 horas (para células PC3) o 96 horas (para células DU145) después de la siembra. inserciones Transwell se tiñeron y se contaron las células invasoras para la totalidad de los insertos. Los datos se presentan como media ± SD de tres repeticiones. Imágenes representativas se muestran debajo de cada gráfico de barras. Todas las imágenes fueron tomadas en la misma escala con una barra de escala de 200 micras que se muestra en la primera imagen.
Dado que la sobreexpresión de
RAS
aumentaron la motilidad celular específicamente en los Myc-CaP las células (Figura 4), se realizó un ensayo de invasión basada en células transwell de Myc-Cap utilizando Matrigel para reemplazar el colágeno. En comparación con la matriz de colágeno, la matriz de Matrigel es una membrana basal reconstituida preparada a partir de un sarcoma de ratón que imita mejor el entorno extracelular de un cáncer. Como en el caso de la matriz de colágeno, no celular se observó a pasar a través de la matriz de Matrigel ya sea en las células de control o en los
RAS
células-overexpressing (datos no mostrados).
niveles moderados de
RAS
sobreexpresión no promueve la senescencia celular en células de cáncer de próstata
estudios previos han demostrado que la expresión oncogénica prolongado de
RAS Hoteles en células de fibroblastos primarios humanos de los roedores y
in vitro [49] o altos niveles de sobreexpresión de
RAS oncognic
en las células epiteliales mamarias
in vivo
[50] dio lugar a un aumento de la senescencia celular. Desde
RAS
-overexpressing células LNCaP y DU145 células mostraron capacidades reducidas para cerrar una herida provocada (Figura 3), y puesto que
RAS
-overexpressing células LNCaP y PC3 células mostraron una disminución de motilidad de las células en el ensayo de movilidad transwell (Figura 4), hemos tratado de determinar si la disminución de la movilidad en estas
RAS
-overexpressing células humanas de cáncer de próstata pueden ser explicados por un aumento potencial de la senescencia celular en las células. Con este fin, hemos utilizado
in vitro
X-gal tinción para evaluar las actividades de β-galactosidasa asociados con la senescencia, un marcador biológico utilizado comúnmente para la senescencia celular [51]. Como se muestra en la Figura 6A y la Figura 6B, niveles moderados de
RAS
sobreexpresión en nuestro medio experimental (Figura 1) no aumentó significativamente la senescencia celular en LNCaP, PC3, DU145 y células, como se evidencia por el hecho de que
RAS
-overexpressing células mostraron porcentajes similares de células X-gal-positivas como sus correspondientes em> PBP
células de control
RAS
sobreexpresión (es decir, 13,6 veces; Figura 6C, "
Hi-Ras"
) mostraron un incremento significativo en el porcentaje de X-gal células positivas que cualquiera de las células PC3 infectadas con el vector control (Figura 6C, "
PBP"
) o las células PC3 con una expresión moderada de
RAS
(es decir, 4,2 veces; Figura 6C "
RAS"
) (Figura 6A y 6B). El aumento del porcentaje de células PC3 positivos X-gal con un mayor nivel de
RAS
sobreexpresión es coherente tanto con su morfología similar a la senescencia (es decir, grande y plana) (Figura 6A) y con un informe anterior de que los niveles altos de
Ras
sobreexpresión llevado a una mayor senescencia celular [50]. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la incapacidad de RAS para promover la motilidad celular o invasividad en líneas celulares de cáncer de próstata humano no es debido a la senescencia celular prematura.
actividades β-galactosidasa asociada a la senescencia (A) fueron evaluados por X-gal tinción de líneas celulares de cáncer de próstata humano transfectadas con cualquiera de los retrovirus de control (
PBP
) o retrovirus que sobreexpresan
PBP-H-RAS gratis (
RAS
). células PC3 que expresan un nivel extremadamente alto de
RAS gratis (
Hi-RAS) se incluyeron para las comparaciones. Se utilizaron células fibroblastos de piel humana senescentes BJ como control positivo para la tinción X-gal. Imágenes representativas se muestran con células X-gal-positivas representativas de ser marcados con flechas rojas. Inserciones en cada imagen mostraron magnifican, las células X-gal-positivas representativas. (B) cuantificaciones de los datos recogidos de panel (A). Los datos se presentan como media ± SD de tres repeticiones.