Extracto
p53 y la señalización de calcio son interdependientes y se sabe que muestran efectos sinérgicos y antagónicos, tanto el uno del otro en el entorno celular. Sin embargo, no existe un mecanismo molecular o vía celular se conoce que muestra la regulación directa entre estas importantes moléculas de señalización celular. Aquí hemos demostrado que en células de cáncer tratados con fármaco antineoplásico GAQ
3, p53, hay un aumento en los niveles de calcio intracelulares por la regulación transcripcional de un nuevo canal de calcio TRPC6 gen. p53 se une directamente a un elemento de respuesta 22 pb en el promotor del gen TRPC6 y aumentar su ARNm y la expresión de proteínas. Sobre-expresión de los resultados TRPC6 en la muerte y la activación de genes de apoptosis de apoptosis dependiente de calcio en una variedad de células cancerosas. Este trabajo de investigación muestra que p53 y su actividad transcripcional es crítico en la regulación de la señalización de calcio y un aumento en el nivel de calcio intracelular podría ser una de las estrategias anti-cáncer para inducir la apoptosis en células de cáncer
Visto:. Madan E, R Gogna, Keppler B, Pati T (2013) p53 Aumenta intracelular liberación de calcio por la regulación transcripcional de los Canales de calcio TRPC6 en GAQ
Cancer Cells 3-tratada. PLoS ONE 8 (8): e71016. doi: 10.1371 /journal.pone.0071016
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: 30 de junio de 2013; Publicado: 16 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Madan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Cáncer de Suiza Liga, Josheph Steiner concesión de las subvenciones y el Consejo indio de Investigación mecical (ICMR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El galio y sus derivados orgánicos han demostrado una alta consistencia y eficacia como fármacos contra el cáncer [1] - [5]. Hemos establecido recientemente un nuevo derivado orgánico de galio "GAQ
3" [tris (8-quinolinolato) de galio (III)] (KP46) como un fármaco anti-cáncer eficaz en las células de cáncer con WT-p53 o Mt-p53 proteína [6]. Hemos observado que GAQ
3 induce la señalización del calcio en las células cancerosas mediante el aumento de los niveles de calcio intracelular. Aumento en Ca celular
2 + activa la proteína p53 y aumenta los niveles de p53 celular. GAQ la liberación de calcio intracelular
3 inducida fue significativamente mayor en las células cancerosas con p53 de tipo salvaje que en las células de cáncer con p53 mutante o con deleción del gen p53 [6]. Curiosamente, se observó que el aumento de intracelular de Ca
2 + liberación fue dependiente de p53 y la inhibición de la actividad transcripcional de p53 usando pifithrin-α abolieron la intracelular de Ca 2 + liberación
. Esta observación sugiere que p53 podría regular transcripcionalmente intracelular de Ca
2 + liberación y Ca
2 + señalización en las células cancerosas GAQ
3-tratados. p53 y calcio son conocidos por funcionar en sinergia, pero sin relación directa se ha establecido entre la activación de p53 y la regulación dependiente de p53 de señalización de calcio a nivel celular, bioquímica o molecular. En ciertos informes Ca
2 + inducida por señales como Ca
2 + activados por vías RAF /MEK /ERK mediada por apoptosis independiente de p53 [7]. También se predijo que p53 trabaja en estrecha relación con la señalización de calcio celular, puesto que la liberación de calcio intracelular juega un papel importante en la inducción de Bcl-2, ROS y ruta mitocondrial de la apoptosis [8]. Sin embargo, no se conoce ningún mecanismo molecular o vía de la regulación de p53 medited de la liberación de calcio intracelular.
En este estudio hemos demostrado que la señalización del calcio celular y la liberación de calcio intracelular están bajo el control transcripcional de la proteína p53. p53 regula transcripcionalmente una novela TRPC6 los canales de calcio mediante la unión directamente a un 22 pares de bases p53-RE presentes 400 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio transcripcional 1 (TSS) en el promotor TRPC6. Hemos observado que GAQ
3 induce apoptosis a través de la regulación positiva dependiente de p53 del gen TRPC6 en las células de cáncer con p53 Wt. Sobre-expresión de los resultados TRPC6 en apoptosis significativa en las células cancerosas. Además expresión TRPC6 inicia una regulación dependiente de calcio de la expresión de genes implicados en la apoptosis.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
MCF-7, U2OS, HCT, A se obtuvieron -431, PC3 y las células H1299 del Centro Nacional para la Ciencia de la célula, de Pune (India) y se mantuvieron en medio DMEM. Las células se cultivaron como monocapas en medio DMEM suplementado con 10% (v /v) de suero inactivado por calor fetal bovino y antibióticos, y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 Todos las transfecciones se llevaron a cabo usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Por el momento curso de análisis 5 placas de Petri para cada punto de tiempo se utilizan.
Los plásmidos y reactivos
promotor de larga duración p53-TRPC6, p53 TRPC6 promotor mínimo y el promotor mínimo mutante p53 se TRPC6 clonado en pGL3 vector de luciferasa. p53 si-ARN se utilizó también como se ha descrito anteriormente por [9] - [11].
Ensayo de Ca
2 + movilización
Ca
2 + se midió usando el Ca
2 + éster permeable a las células sensibles tinte fluorescente fluoruro 3 acetoximetilo. Donde se indique, se añadió éster de acetoximetilo BAPTA (10 M) al medio de cultivo de células en placas de cultivo de tejido de plástico de 10 cm para una exposición de 1-h antes del procedimiento de carga con éster de acetoximetilo Fluo-3. El medio se retiró de las placas de cultivo tisular y se reemplazó con éster de acetoximetilo 4 M Fluo-3 diluido en tampón de Krebs-Ringer (KRB) (10 mM de D-glucosa, NaCl 120 mM, KCl 4,5 mM, Na2HPO4 mM 0,7, NaH2PO4 1,5 mM , y MgCl2 0,5 mM (pH 7,4 a 37 ° C)) (Sigma) durante 20 min. Las placas se lavaron una vez con 5 ml de KRB para eliminar el tinte residual. Las células se cosecharon por tripsinización, se lavaron en 5 ml de Ca
2 + libre de PBS a 37 ° C, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de Ca
2 + libre de PBS a 37 ° C, y determina inmediatamente Fluo-3 intensidad de fluorescencia por citometría de flujo.
por favor, consulte el archivo de S1 para una descripción completa de los materiales y métodos.
Resultados
GAQ
3 induce la expresión de genes en células de cáncer TRPC6 con p53 de tipo salvaje
Hemos observado que anteriormente GAQ
3 induce la liberación de calcio intracelular alta selectivamente en las células cancerosas con la proteína p53 de tipo salvaje [6]. El silenciamiento de gen p53 usando SiRNA p53 y la inhibición de la actividad transcripcional de p53 usando pifithrin-α tanto abolió la GAQ subida inducida por 3
en la liberación de calcio intracelular [6]. Estos datos sugirieron que el aumento intracelular de los niveles de calcio en las células del cáncer estaba regulado por p53 y era dependiente de la actividad transcripcional de p53. Sin embargo, el mecanismo implicado en la regulación de este fenómeno observado es desconocida [6]. Desde GAQ
3 inducida por aumento significativo en la absorción de calcio, usando qPCR se analizó la expresión de un gran número de los canales de calcio conocidas en GAQ tratados con 3
células MCF-7. Hemos observado significativamente alta expresión del gen TRPC6 en GAQ células tratadas-3
. Dado que la expresión de los canales de calcio TRPC6 era alta, nos preguntamos si TRPC6 podría estar implicado en el aumento de los niveles de calcio celular en las células cancerosas
3 tratados con GAQ. Se observó la expresión de TRPC6 mRNA y proteína en GAQ
3 tratada-MCF-7, H1299 y células PC3 (Figura 1 A). El análisis muestra que qPCR TRPC6 mRNA fue significativamente mayor en GAQ
3 tratados con células MCF-7 (p53 Wt) células (Figura 1A). El aumento en el nivel de ARNm de p53 no se observó en H1299 (null p53) y PC3 (p53 mut) células (barras 3-6; Figura 1A). Del mismo modo p53 nivel de proteína se analizó en las células cancerosas antes mencionadas y sólo MCF-7 mostró aumento significativo en el nivel de proteína p53 en GAQ
3 tratamiento (Figura 1A). Estos datos sugirieron que p53 juega papel importante en la regulación positiva GAQ
3-mediada de TRPC6. Además se observa la relación entre la expresión de p53 y la expresión TRPC6. El análisis del curso del tiempo del nivel de TRPC6 mRNA (PCR en tiempo real) en GAQ
3 tratados con células MCF-7, células H1299 y PC3 muestran que TRPC6 mRNA fue significativamente alta en p53 (+ /+) MCF-7 células ( Figura 1B; línea de negro). análisis de tiempo-curso muestra que GAQ
3 induce la expresión de TRPC6 dentro de las 6 horas de su incubación y la expresión TRPC6 aumenta de 6
th a 24
th hr en un patrón similar en el que aumento en la expresión de p53 células
3 tratados con GAQ [6] se colocan ahora ref. Estos datos sugieren que p53 y TRPC6 muestran relación temporal en su perfil de expresión de ARNm. El papel directo de p53 en la expresión de TRPC6 en GAQ
3-tratada células MCF-7 se observa por el silenciamiento de genes p53 en GAQ
3 tratados con células MCF-7 (Figura 1C). Los resultados muestran que la expresión de proteínas TRPC6 fue significativamente alto de GAQ
3 tratamiento (carril 2); Sin embargo subida inducida-3 esta GAQ
en TRPC6 fue revertido completamente al silenciamiento de p53 (carril 3). Estos datos sugieren que p53 tiene un papel importante en la regulación del gen TRPC6. Además, se analizó la eficacia de siRNA y TRPC6 TRPC6 ADNc (2 M) en células MCF-7.
A) El efecto de GAQ
3 en la expresión de ARNm de p53 TRPC6 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) y H1299 células PC3 p53 (MT /MT) se observó mediante qPCR. Los resultados muestran que GAQ
3 puede inducir la regulación de TRPC6 sólo en células MCF-7 con Wt p53 (carril 2). Del mismo modo GAQ
3 puede inducir la expresión de la proteína TRPC6 sólo en células MCF-7 (n = 5). B) PCR en tiempo real muestra el tiempo de análisis de la expresión de mRNA en TRPC6 tratado con GaQ3 MCF-7 (línea de color negro), H1299 (línea verde) y PC3 (células de la línea roja). Los resultados muestran que TRPC6 mRNA está regulada positivamente sólo en células MCF-7 y no en las células H1299 y PC3. Además, el aumento de TRPC6 mRNA se observó en el 6
ª h de incubación GaQ3. El aumento de la TRPC6 ARNm es temporal relacionado con el aumento de ARNm de p53 en tratados con GaQ3 MCF-7 células (* (rojo) representa una diferencia significativa en los resultados entre la línea roja, verde y negro en el 9
º punto de tiempo hr , p & lt; 0,028), n = 5, Anova, barras de error representan SD). C) El papel de p53 en GAQ
3-inducida se observa la regulación positiva de TRPC6. p53 silenciamiento de genes usando siRNA p53 en GAQ
3 tratados con células invertir el aumento en el nivel de proteína TRPC6 (carril 3) (* (rojo) representa una diferencia significativa en los resultados entre carriles 1 & amp; 2, p & lt; 0,036 y el carril 2 & amp; 3, p & lt; 0,042). La eficiencia de TRPC6 siRNA y TRPC6 ADNc se muestra en el carril 4 y 5.
p53 activa transcripcionalmente promotor TRPC6
TRPC6 (11q22.1 cromosoma, cadena inversa) y p53 mostró temporal las relaciones en su perfil de expresión en células de cáncer de GAQ
3-tratados, por lo tanto, es de interés para definir el papel de p53 en la regulación de TRPC6. La región promotora TRPC6 fue identificado como la secuencia de ADN de 650 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción 1, usando combinaciones de matriz determinados por Mat Inspector (Genomatix). promotor TRPC6 se proporcionó el locus ID GXP_193240 por el Inspector Mat. Esta región se encuentra entre las regiones 101,374,672-101,375,321 (punto de ref TSS representado por Mat inspector es 101 374 772) y está representado por ENST00000527240 y AK027769. Bioinformática análisis del promotor TRPC6 utilizando el módulo Mat Inspector de base de datos de Genomatix mostró sitio de unión al ADN de p53 putativo (sim matriz; puntuación & gt; 0,9) (Figura 2A), sugiriendo que p53 podría ser un regulador potencial TRPC6. Para establecer esto, hemos clonado un promotor putativo TRPC6 0,65 kb que lleva el elemento de respuesta a p53 (p53RE) en un vector pGL3 básico para generar pTRPC6p-luc1. El pTRPC6p-luc1 se transfectó en la no tratada y GAQ
3 tratados con células PC3 MCF-7, y H1299. GAQ
3 tratamiento indujo aumento de 5 veces en la actividad promotora TRPC6 en células MCF-7 en comparación con las células no tratadas (Figura 2B; barra 2 y 3). El aumento en la actividad promotora TRPC6 era dependiente de p53 desde aumento silenciamiento de los genes p53 p53 siRNA utilizando invirtió la GAQ
3 inducida por la actividad promotora TRPC6. GAQ
tratamiento 3 fue incapaz de inducir la actividad del promotor TRPC6 en H1299 y células PC3 (barra 5, 6, 8 & amp; 9). promotor TRPC6 se activó en GAQ
3-tratada H1299 células que se transfectaron con ADNc de p53 (barra 7). Estos datos mostraron que TRPC6 estaba regulado por p53 en células GAQ
3-tratados. Para confirmar aún más el papel de p53RE en la regulación mediada por p53 de promotor TRPC6, la región entre pares de bases -74 a -99 (con referencia a la SEC TSS (101,374,772) del promotor TRPC6 que lleva la p53RE se clonaron en un vector pGL3 para generar la mínima pTRPC6p-luc2. este promotor mínimo TRPC6 se indujo a GaQ3 tratos en células MCF-7 y el silenciamiento de p53 abolido este aumento de la actividad del promotor (Figura 2C, la barra 2-4). con el fin de establecer el papel de la recientemente identificado p53RE en la regulación mediada por p53 del gen TRPC6, la secuencia p53RE se mutó y se clonó en el vector PGL3 para generar el mutante mínimo mmpTRPC63p-luc2. la transfección de mmpTRPC63p-luc2 en GAQ
3 tratada-MCF-7, PC3 y células H1299 no mostraron aumento en la actividad del promotor TRPC6 (Figura 2D). Estos datos establece que p53 regula transcripcionalmente TRPC6 en GAQ
células de cáncer de 3-tratada.
a) un sitio de unión putativo p53 se observa en el promotor TRPC6 utilizando el módulo Genomatix, MatInspector. TRPC6-p53RE se encuentra entre -422 a -400 pb en el promotor TRPC6 de 0,6 kb. La SEC de ADN del promotor TRPC6, junto con la ubicación de RE p53 (en rojo) se representa esquemáticamente. B) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb construcción de promotor de la luciferasa) se transfecta en GAQ
3 tratados con células MCF-7 y el efecto de p53 en la actividad de luciferasa se mide. GAQ la activación de genes p53 inducida por 3
induce aumento de 8 veces en la actividad luciferasa pTRPC6p-luc1 (barra 3). p53 silenciamiento génico mediante siRNA p53 invierte este efecto y promotor TRPC6 activación se abolió (barra 4). La transfección de pTRPC6p-luc1 en las células H1299 y PC3 en ausencia o presencia de GAQ
3 no tiene ningún efecto sobre la actividad del promotor TRPC6. Tras la adición exógena de cDNA p53 Wt en GAQ
3-tratada células H1299 el promotor TRPC6 muestra aumento de 9 veces en la actividad de luciferasa (barra 7). Estos datos muestran que p53 regula promotor TRPC6 transcripcionalmente. (C) pTRPC63p-luc2, el TRPC6-p53RE (-422 a -400) clonado en el vector de luciferasa se transfecta en GAQ
3 tratados con células MCF-7. Los resultados muestran que p53 induce un aumento de 6 veces en la actividad de luciferasa TRPC6-p53RE (barra 3). p53 silenciamiento génico mediante siRNA p53 suprime el aumento de la actividad de la luciferasa (barra 4). El aumento en la actividad promotora TRPC6 está ausente en las células H1299 y PC3. Los datos muestran que p53 regula promotor TRPC6 través TRPC6-p53RE. (D) El mmpTRPC6p-luc2 construir con la secuencia mutada de TRPC6-p53RE se transfecta en GAQ
3 tratados con células MCF-7. Se observó un aumento en la actividad de la luciferasa, que muestra la especificidad de TRPC6-p53RE. Para la figura 2b-2d, (* (rojo) representa una diferencia significativa en los resultados de todos los valores de p & lt; 0,05), n = 7, Anova, barras de error representan SD)
p53 WT se une directamente a. su elemento de respuesta en el promotor TRPC6
la unión de p53 en la región de par 22 de base en el promotor TRPC6 se analizó en
in-vitro
condiciones usando EMSA (Figura 3A). Los datos mostraron unión de p53 en la secuencia TRPC6-p53-RE como un cambio claro y super-desplazamiento del complejo se observó (carril 2). La unión entre p53 y su elemento de respuesta se perdió en la proteína de desnaturalización de calor p53 (carril 3). La unión entre p53 y su elemento de respuesta fue muy específico ya que la mutación de la secuencia de RE par p53 22 de base abolió la unión entre p53 y su RE (carril 5-8). La unión entre p53 y su elemento de respuesta a p21 en el elemento 5 'promotor sirve como control positivo (carril 9-12). Para definir mejor el papel de TRPC6-p53RE en la inducción de p53 TRPC6 mediada por debajo de
in vivo