La terapia
Extracto
Anti-EGFR se utiliza comúnmente para tratar el cáncer colorrectal (CCR), aunque sólo un subconjunto de pacientes se benefician del tratamiento. Mientras que
KRAS
mutación predice la falta de respuesta, los marcadores predictivos positivos no son en la práctica clínica. Anteriormente puso de manifiesto que la inmunohistoquímica (IHC) guiada por
EGFR
número de copias de genes (GCN) análisis puede identificar a los pacientes de CRC que se benefician de un tratamiento anti-EGFR. Aquí hemos probado el valor predictivo de este tipo de análisis en quimiorrefractaria CRC metastásico, dilucidado
EGFR
GCN heterogeneidad dentro de los tumores, y se evaluó la asociación entre el
EGFR
GCN,
KRAS
estado y respuesta de anticuerpos anti-EGFR en las líneas celulares de CRC. La cohorte de pacientes consistió en 54 quimiorrefractaria
KRAS
de tipo salvaje (WT) de los pacientes con CCR metastásico.
EGFR
estado GCN fue analizado por la plata
In situ
hibridación utilizando un valor de corte de 4,0
copias del gen EGFR
/célula.
KRAS
-WT y
KRAS
líneas celulares mutantes CRC con diferente
EGFR
GCN se utilizaron en
in vitro
estudios. Los tumores CRC quimiorrefractaria con
EGFR
aumento GCN (≥4.0) respondieron mejor a la terapia anti-EGFR que
EGFR
GCN (& lt; 4,0) tumores (beneficio clínico,
P
= 0,0004; PFS, HR = 0,23, IC 95% 0,12 a 0,46).
EGFR
GCN contaron usando orientación EGFR IHC fue significativamente mayor que el valor de las áreas seleccionadas al azar verificar intratumoral
EGFR
GCN heterogeneidad. En líneas celulares de CRC,
EGFR
GCN correlaciona con la expresión de EGFR. Mejor respuesta anti-EGFR fue visto con
KRAS
-WT,
EGFR
GCN = 4 células y la respuesta más pobre con
KRAS
-WT,
EGFR
GCN = 2 células. Respuesta anti-EGFR se asoció con Akt y ERK1 /2 fosforilación, que fue inhibida de manera efectiva sólo en las células con
KRAS
-WT y el aumento de
EGFR
GCN. En conclusión, IHC-guiado
EGFR
GCN es un predictor prometedor de la eficacia del tratamiento anti-EGFR en quimiorrefractaria CRC
Visto:. ALGARS A, T Avoranta, Österlund P, Lintunen H, J Sundström , Jokilehto T, et al. (2014) Heterogénea
EGFR número de copias de genes
aumento es común en el cáncer colorrectal y define la respuesta a la terapia anti-EGFR. PLoS ONE 9 (6): e99590. doi: 10.1371 /journal.pone.0099590
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 19 Enero, 2014; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 18 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 ALGARS et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación finlandesa médica, la Fundación finlandesa del cáncer, La Escuela Nacional de Graduados de Investigaciones clínicas, hospital de la Universidad de Turku subvención EVO, la Academia de Finlandia, y la Sociedad del cáncer del suroeste de Finlandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. AA, ML, JS, RR y OC son los inventores de una patente relacionada con esta trabajo: US 20110217296 A1 Método para la selección de pacientes para el tratamiento con un inhibidor de EGFR. Todos los demás autores han declarado no tener ningún conflicto de interés. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de señalización que comúnmente se activa en el cáncer colorrectal (CCR). EGFR de metas de anticuerpos monoclonales (mAb) se han convertido en una opción de tratamiento estándar, en particular en la fase de la enfermedad metastásica resistente a la quimioterapia [1].
KRAS,
una molécula de señalización corriente abajo del EGFR, está mutado en aproximadamente el 40% de los CCR [1] y estas mutaciones activadoras transmitir resistencia al tratamiento anti-EGFR [2]. En los tumores
KRAS
de tipo salvaje (WT), la respuesta objetivo se logra en cada tercera paciente que indica que otros factores contribuyen a la eficacia del fármaco [3]. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de nuevos marcadores predictivos.
número de copias del gen EGFR gratis (GCN) aumento se ha relacionado con la respuesta al tratamiento anti-EGFR. La mayoría de los estudios han demostrado una asociación entre el nivel de GCN y el beneficio clínico, la supervivencia libre de progresión (SLP), y, en algunos casos, con una supervivencia global (SG) [4] - [6]. Sin embargo,
EGFR
GCN no se utilizan actualmente en el contexto clínico debido a los obstáculos técnicos y una variación considerable entre los sistemas de puntuación [7]. Recientemente hemos informado de un nuevo algoritmo, lo que puede mejorar el valor predictivo de
EGFR
GCN. En primer lugar, demostramos que el
EGFR
GCN según el análisis de la plata
In situ
hibridación (SISH) se correlacionó positivamente con la inmunohistoquímica (IHC), cuando la evaluación se llevó a cabo desde las zonas tumorales de más alta intensidad de la tinción [ ,,,0],8]. Además, demostró que un aumento de la
EGFR
GCN, utilizando el valor de corte (≥4.0), se correlacionó positivamente con la respuesta a la terapia anti-EGFR en los tres parámetros analizados: beneficio clínico, la SLP y la SG.
EGFR
GCN era independiente de
KRAS
estado, y cuando se combinaron los dos análisis, que predijo la respuesta al tratamiento mejor que cualquiera de las pruebas solo. La media
EGFR
GCN, según el análisis de este método fue de 5,5, y copiar aumento número ≥4.0 se observó en el 64% de los tumores. El aumento de GCN se asocia típicamente con el cromosoma 7 polysomy, mientras que la amplificación de alto nivel se ve raramente.
Una de las razones para la variación de la publicación
EGFR
resultados GCN puede ser la heterogeneidad del tumor, que no ha sido abordado en estudios anteriores. Hay algunas pruebas de que el EGFR puede ser expresado heterogéneamente dentro de los tumores colorrectales individuales, tanto a nivel de genes y proteínas [5]. La heterogeneidad puede complicar el análisis de la expresión de la proteína EGFR y copiar alteraciones en el número y conducir a una mala reproducibilidad de los ensayos [7], [9]. Esto puede ser especialmente relevante en el análisis a base de pescado, en el que el conteo de GCN no puede correlacionarse con la histología [7]. Si
EGFR
heterogeneidad juega un papel biológico, a continuación, un algoritmo, en el que la expresión de proteínas (IHC) guías
EGFR
evaluación GCN, podría mejorar el valor predictivo.
El objetivo de este estudio fue probar la novela
EGFR
método de GCN en una cohorte de pacientes independiente y para evaluar el impacto de los
EGFR
estado GCN con el resultado en una cohorte de pacientes resistente a la quimioterapia combinada. En ambas cohortes de pacientes de un
EGFR
aumento (≥4.0) se mostró a asociarse con un resultado clínico mejorado, incluyendo la tasa de beneficio clínico, la SLP y la SG. Los objetivos secundarios fueron para dilucidar
EGFR
GCN heterogeneidad dentro de los tumores y para probar, si las líneas celulares de CRC con varios
EGFR
GCN, responden de manera diferente a EGFR mAb. De acuerdo con nuestros resultados,
EGFR
GCN es heterogénea en el CCR y los valores obtenidos con la orientación IHC de las zonas tumorales seleccionados son superiores a los obtenidos por la selección al azar. Es importante destacar que sólo el
EGFR
GCN contó con la orientación de EGFR IHC fue capaz de predecir la respuesta al tratamiento anti-EGFR. Nuestro
in vitro
estudios apoyan nuestros hallazgos clínicos, ya que la mejor respuesta al tratamiento anti-EGFR se observó en
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 4.0 células y la respuesta más pobre en el
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 2 células.
Materiales y Métodos
los pacientes
el primer hospital, la Universidad de Turku cohorte de descubrimiento ha sido reportado [8]. La cohorte de validación consistió en 31
KRAS
pacientes tratados con -WT EGFR mAb de segundo a sexto de línea en el Hospital de la Universidad de Helsinki para los CCR metastásico entre junio de 2008 y julio de 2010. Los criterios de selección para este estudio fueron: (I ) estaba disponible el tejido del tumor primario al momento del diagnóstico antes de comenzar cualquier tratamiento, (II) el tumor era
KRAS
-WT, (III) los pacientes recibieron un tratamiento de segunda a la sexta línea con cetuximab o panitumumab con o sin quimioterapia, y (IV) los pacientes no tenían otra malignidad en su historia. La histología de cada caso validación cohorte fue re-evaluado por un experto en la GI-patología (AR)
.
La cohorte de pacientes combinado resistente a la quimioterapia incluyó a 54 pacientes, 25 de la cohorte original Turku y 29 de la validación de Helsinki conjunto. La cohorte de pacientes quimiorrefractaria incluyó a los pacientes tratados con anticuerpos monoclonales anti-EGFR en tercera línea o más, ya sea como monoterapia o en combinación con irinotecan +/- una fluoropirimidina. Las características clave de las tres cohortes se describen en la Tabla 1.
La respuesta al tratamiento anti-EGFR se evaluó mediante tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (MRI) de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en Los tumores sólidos (RECIST versión 1.1) [10]. El beneficio clínico se consideró respuesta parcial (PR) o al menos 3 meses de enfermedad estable (SD). la supervivencia libre de progresión (SLP) se calculó a partir del inicio del tratamiento anti-EGFR hasta la progresión de la enfermedad. La supervivencia global (OS) se calculó a partir del inicio de la terapia anti-EGFR hasta la muerte por cualquier causa.
Declaración de Ética
El estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki. Los datos clínicos fueron recuperados y muestras histológicas recogidos y analizados con el aval de la Autoridad Nacional de Asuntos Médico-Legal, así como la Junta de Revisión Institucional del Distrito de Hospitales del suroeste de Finlandia y la Junta de Revisión de Ética del Hospital Universitario de Helsinki. consentimiento informado por escrito u oral no se obtuvo debido al hecho de que una gran parte de los pacientes incluidos en este estudio retrospectivo se había muerto de su enfermedad. La necesidad de consentimiento informado de los participantes fue cortado por la Autoridad Nacional de Asuntos Médico-Legales.
Procedimientos IHC y sish
KRAS
análisis de la mutación se realizó con DXS KRAS kit de mutación (DxS Ltd, Manchester, Reino Unido). Métodos detallados de EGFR IHC y
EGFR
GCN se han descrito [8]. En resumen, tres micras secciones se tiñeron primero con EGFR (clon 5B7) MAB (Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson, AZ, EE.UU.). Tinciones se realizaron con XT de referencia (Ventana /Roche) utilizando
de ultra
kit de detección DAB universal VER (Ventana /Roche).
EGFR
gen se detectó a partir subsiguientes de cinco micras secciones con
EGFR
sonda de ADN (Ventana /Roche) y
de ultra
VISTA kit de detección SISH (Ventana /Roche). En cada tumor,
EGFR
GCN de cuarenta células tumorales se analizó utilizando un objetivo de 40x por dos observadores (ML, JS) de las zonas de mayor reactividad IHC. Los investigadores fueron cegados de la información clínica. Para evaluar la media
EGFR
GCN dentro de cada tumor, cinco áreas tumorales fueron elegidos de forma arbitraria. De cada una de estas áreas,
EGFR
GCN de 20 células de cáncer seleccionados al azar fue contado por dos observadores (TA, JS). Los resultados se presentan como media y el rango dentro de cada área.
Líneas Celulares, Western Blot y Ensayos de citotoxicidad
El C2BBe1, las líneas celulares SK-CO-1 y NCI-H747 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y la línea celular CW-2 desde el centro de bio-RIKEN (Tsukuba, Japón). Las células NCI-H747 y CW-2 se cultivaron en medio RPMI-1640, las células SK-CO-1 en células EMEM y C2BBe1 en DMEM suplementado con 0,01 mg /ml de transferrina humana (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.). Todos los medios se complementaron con 10% de FBS, glutamina 2 mM y 1% de penicilina /estreptomicina.
Para las células de análisis vía de señalización se hicieron crecer en 6 pocillos de placas y se dejó que se unieran durante 12 horas en medio normal. Luego se cambiaron en medio con FBS al 1% y se les da 0-200 g /ml cetuximab (Erbitux, Merck Serono) durante 24 horas. 25 mg /ml de EGF se le dio a las células durante cinco minutos antes de la lisis.
Los niveles de proteína se analizaron por transferencia Western de las células lisadas en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P -40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, ortovanadato 1 mM, y la mezcla de inhibidor de proteasa, pH 7,4). Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de la incubación durante la noche en + 4C ° con el anticuerpo primario [anti-EGFR (D38B1, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), fosfo-EGFR (Tyr1173, 53A5, Señalización Celular Tecnología), ERK2 (K-23, Santa Cruz Biotechnology , Dallas, TX, EE.UU.), fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, D13.14.4E, Tecnología células de señalización), fosfo-AKT (Ser 473), panAKT (C67E7, señalización celular Tecnología)], las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa (Dako, Glostrup, Dinamarca) y las señales se detectaron con SuperSignal West Pico sustrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Anti-α-tubulina mAb (B-1-5-1-2, Sigma) o conjugado con HRP anti-GAPDH mAb (mAbcam 9484, Abcam, Cambridge, Reino Unido) se utilizó como control de carga.
Para los ensayos de viabilidad celular, 5000 células /pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche en presencia de 2% de FBS, las células fueron expuestas a 0-200 g /ml cetuximab (Erbitux, Merck Serono) o panitumumab (Vectibix, Amgen) durante 72 horas en medio suplementado con 1% de FBS. Cada tratamiento se realizó por triplicado y el experimento se repitió cuatro veces. La viabilidad celular se evaluó con el One Solution ensayo de proliferación celular CellTiter 96 acuoso (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La viabilidad celular se da como porcentaje de las células control.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con los programas SAS 9.2 y Empresa Guía 4.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC). datos de la tabla de frecuencias se analizaron con el χ2-test o prueba exacta de Fisher. La diferencia en
EGFR
valores GCN obtenidos por diferentes métodos de evaluación (variables de distribución normal) se calculó con la prueba t de Student. Kaplan-Meier y log-rank pruebas, así como Cox modelo de regresión de riesgos proporcionales fueron utilizados para el análisis de supervivencia univariante. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
P-valores
& lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La significación estadística de los ensayos de viabilidad celular se calculó con Microsoft Excel 2011 y StatPlus: mac LE (Versión de 2009, AnalystSoft Inc.). La significancia entre las diferencias en las respuestas en las líneas celulares se determinó con ANOVA de dos vías seguido de múltiples pruebas t.
Resultados
EGFR
GCN Validación de la prueba con una cohorte de pacientes independiente
Para validar nuestros resultados anteriores sobre la asociación entre el
EGFR
GCN y la respuesta al tratamiento anti-EGFR, se estudió una cohorte independiente del paciente atendido en el hospital de la Universidad de Helsinki. Los métodos para
EGFR
detección de GCN y el valor de corte para aumentar GCN fueron idénticos al estudio de descubrimiento [8]. En la cohorte de validación, 18 de los 31 (58%), los tumores tenían un
EGFR
GCN por encima del valor de corte (≥4.0), en comparación con 64% en el conjunto de descubrimiento original. Catorce (78%) de la alta
EGFR
GCN (≥4.0)
KRAS-
WT pacientes mostraron un beneficio clínico [respuesta parcial (PR) + enfermedad estable (SD)] de anti-EGFR terapia, mientras que sólo 4 (31%) de baja
EGFR
GCN (& lt; 4,0) se benefició del tratamiento (prueba de chi-cuadrado,
P
= 0,009). Un elevado
EGFR
GCN asocia significativamente con una mejor supervivencia. La mediana del tiempo de la SSP
EGFR
GCN≥4.0 fue de 25 semanas en comparación con sólo 11 semanas de la
EGFR
GCN & lt; 4,0 pacientes (log-rank test,
P =
0,002; prueba de Cox,
P = 0,003
, HR = 0,28; IC del 95%: 0,12-0,65; Figura 1a). Por otra parte, el
EGFR
GCN≥4.0 asoció significativamente con la mejora de la SG (mediana de 12,1 frente a 8,2 meses; log-rank test,
P = 0,004
; prueba de Cox,
P
= 0,006, IC HR = 0,32, 95% 0,14-0,72;. Figura 1b)
supervivencia libre de progresión (a) y la supervivencia global (b) de la cohorte de validación de ensayo según
EGFR
número de copias del gen. la supervivencia libre de progresión (c) y la supervivencia global (d) de la cohorte de pacientes resistente a la quimioterapia combinada.
Correlación entre los
EGFR
GCN y la respuesta al tratamiento en pacientes quimiorrefractaria
Se combinaron los quimiorrefractaria
pacientes KRAS WT
de ambas cohortes (
n
= 54) para los análisis estadísticos adicionales. El ochenta por ciento (28 de 35) de los pacientes con un alto
EGFR
GCN (≥4.0) lograron un beneficio clínico. Por el contrario, la tasa de beneficio clínico era sólo el 32% (6 de 19) de los pacientes con una baja
EGFR
GCN (& lt; 4,0) (prueba de chi-cuadrado,
P =
0,0004).
Se analizaron por separado los 31 pacientes tratados con cetuximab resistente a la quimioterapia (57%) y 21 con panitumumab (39%). Dos pacientes se trataron con ambos anticuerpos anti-EGFR excluidos secuencialmente y por lo tanto del análisis. La tasa de beneficio clínico en los pacientes tratados con cetuximab +/- terapia citotóxica con un alto
EGFR
GCN en sus tumores primarios fue del 86% (18/21) en comparación con el 20% (2/10) en el grupo de pacientes con un
EGFR
GCN & lt; 4.0 (prueba exacta de Fishers,
P = 0,0007
). En el grupo de pacientes tratados con panitumumab +/- beneficio clínico de terapia citotóxica fue del 67% (8/12) de los pacientes con un alto
EGFR
GCN y el 44% (4/9) de los que tienen una baja
EGFR
GCN. Los resultados se presentan en más detalle en la Tabla S1.
Aumento de
EGFR
GCN Asociados con la mejora de SLP y la SG en la enfermedad resistente a la quimioterapia
La mediana de SLP de la cohorte de pacientes fue resistente a la quimioterapia significativamente mayor en los
EGFR
pacientes GCN≥4.0 que en el
EGFR
GCN & lt; 4,0 pacientes; . 29.5
vs
10.8 semanas (log-rank test,
P Hotel & lt; 0,0001; prueba de Cox,
P Hotel & lt; 0,0001 CI, HR = 0,23, 95%: 0,12 -0.46). La mediana del tiempo de SG en pacientes con
EGFR
tumores GCN≥4.0 fue de 12,5 meses frente a 7,2 meses para aquellos con
EGFR
GCN por debajo del valor de corte (log-rank test,
P = 0,0002
; prueba de Cox,
P = 0,0003
, HR = 0,32, IC del 95%: 0,17 hasta 0,59). las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se muestran en la Figura 1 c-d.
PFS permaneció más tiempo en los pacientes con un alto
EGFR
GCN independientemente de lo que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-EGFR. En los pacientes tratados con cetuximab +/- terapia citotóxica el tiempo de la mediana de SG fue estadísticamente significativamente mayor en el grupo de pacientes con un
EGFR
GCN≥4.0 en comparación con aquellos con un
EGFR
GCN por debajo de 4,0 (12,5
vs
4,6 meses;. log-rank test
P = 0,0006
; prueba de Cox
P = 0,001
, HR 0,25, IC del 95%: 0,10-0,58 ), mientras que no hay diferencia estadísticamente significativa OS se observó en los pacientes tratados con panitumumab. Los resultados se muestran en la Tabla S1.
Los datos de supervivencia del descubrimiento- original, el validation- independiente, y cohortes de pacientes resistente a la quimioterapia combinada se comparan en la Figura 2.
Los cocientes de riesgo y la confianza se muestran los intervalos del descubrimiento original, validación y cohortes de pacientes quimiorrefractaria combinados. Un alto
EGFR
GCN (IHC SISH guiada) se asocia con una enfermedad resultados mejoraron en las tres
KRAS tipo salvaje
metastásicos cohortes de pacientes con cáncer colorrectal tratados con terapia anti-EGFR (dos cohortes independientes y una cohorte de pacientes combinado resistente a la quimioterapia).
EGFR
GCN La heterogeneidad dentro de los tumores
EGFR
GCN se evaluó de forma aleatoria, sin la guía de IHC, de todos los tumores de cohortes 31 de validación. La media
EGFR
valores GCN las zonas seleccionadas al azar fueron significativamente más bajos en comparación con el método en el que el
EGFR
GCN se evaluó de forma selectiva de las zonas con más alta expresión de la proteína EGFR (
P
& lt; 0,0001). La mediana
EGFR
GCN de estos 31 CRC tumores primarios fue de 4,3 cuando se utilizó la guía de IHC y 3,3 cuando el análisis se realizó de forma aleatoria. La heterogeneidad de los
EGFR
GCN dentro de una muestra de tumor CRC se demuestra en la Figura 3.
EGFR IHC muestra la tinción heterogénea con reactividad membranosa intensiva en el medio (a).
EGFR
SISH desde el área que muestra grupos de genes intensamente teñidas (b).
EGFR
SISH de los alrededores con débil o negativa tinción de EGFR IHC muestra marginalmente el número de copias de genes normales o elevados (c-d).
Cuando el elegido al azar
EGFR
valores GCN fueron utilizados para análisis de supervivencia (
EGFR
GCN≥4.0
vs EGFR
GCN & lt; 4.0.) se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos (PFS:
P = 0,07
, HR 0,40, IC del 95%: 0,15 a 1,08; OS:
P = 0,22
, HR = 0,58, IC del 95%: 0,25 a 1,38). No hubo diferencias significativas en la eficacia del tratamiento anti-EGFR (beneficio clínico
vs.
Enfermedad progresiva) se indicará bien (prueba exacta de Fisher,
P
= 0,19).
EGFR
GCN y respuesta a los Abs anti-EGFR in vitro
Se realizaron búsquedas en la base de datos línea celular de cáncer de Sanger Center (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP /cghviewer/CghHome.cgi) para
EGFR
alteraciones GCN. Un bajo nivel de
EGFR
aumento GCN (4-15 copias /célula), por lo general debido al cromosoma 7 polysomy, se observó en 18 de los 39 (46%) líneas celulares. Para correlacionar el
EGFR
GCN y
KRAS
estado con respuesta anti-EGFR mAb, se optó por cuatro líneas de análisis. La líneas celulares C2BBe1 CW-2 y son
KRAS
-WT y tienen dos y cuatro copias de
EGFR, España, respectivamente. NCI-H747 y SK-CO-1 son ambas
KRAS
mutantes y que tienen más de cuatro copias (6-7) de
EGFR
. El
EGFR
GCN fue confirmada por SISH (Figura 4a). El
EGFR
GCN se reflejó directamente en la expresión de la proteína EGFR, como se indica por Western blot (Figura 4b). En los ensayos de viabilidad celular, el
KRAS
línea celular -WT con
EGFR
GCN 4 (C2BBe1) fue el más sensible tanto a cetuximab y panitumumab tratamiento (Figura 4c). La diferencia fue altamente significativa cuando se compara con cualquiera de las otras líneas celulares (t-test de Student,
P
& lt; 0,001). Curiosamente, el
EGFR
disómico, WT
KRAS
línea celular (CW-2) fue más resistente al tratamiento con mAb. Las líneas de células con mutante
KRAS
y
EGFR
GCN & gt; 4 mostraron sensibilidad intermedia, especialmente para el tratamiento de panitumumab. Los resultados son, pues, de acuerdo con nuestros datos clínicos que indican que tanto
EGFR
GCN y
KRAS
estado de definir la respuesta de las células tumorales a los mAb anti-EGFR.
(a)
EGFR
análisis GCN SISH de las diferentes líneas celulares. (B) Una imagen de transferencia de Western que muestra los niveles de la proteína EGFR en las diferentes líneas celulares. α-tubulina se utilizó como control para la igualdad de la carga. La viabilidad celular de las diferentes líneas de células a diferentes concentraciones de (c) cetuximab y (d) panitumumab. Los resultados se dan como porcentaje de células viables en comparación con las células no tratadas (media ± SE de cinco experimentos). (E) Las transferencias Western muestran EGFR moléculas en las diferentes líneas celulares vía de señalización. Las células se trataron previamente con las cantidades indicadas de cetuximab durante 24 horas en medio que contiene 1% de FBS y EGF dado (25 mg /ml) durante 5 minutos antes de la lisis. Las moléculas de señalización indicados se analizaron con el Western Blot. GAPDH se utilizó como control para la igualdad de la carga.
Nos parecía aún más el efecto del tratamiento anti-EGFR mAb en la señalización intracelular en estas líneas celulares. En
KRAS
líneas celulares mutantes con más de cuatro
EGFR
copias de genes, la fosforilación de EGFR fue evidente y eficientemente bloqueado por contra EGFR-MAB (Figura 4e). la inhibición anti-EGFR reducidas parcialmente 2 niveles /pErk1, mientras que el nivel de pAKT no se vio afectada. En
KRAS
líneas celulares en peso con 2-4
EGFR fosforilación
copias del gen EGFR estaba bajo el límite de detección (no se muestra). Sin embargo, la vía era aparentemente operativa, como se indica por las respuestas sobre la señalización aguas abajo. En el
EGFR
línea disómico CW-2, el tratamiento anti-EGFR mAb reducido nivel de pERK1 /2, pero no afectó a la fosforilación de AKT (Figura 4e). Sólo en
se detectó EGFR de tipo salvaje
polysomic y
KRAS
células C2BBe1, un bloqueo eficaz de la señalización ERK1 /2 y AKT, (Figura 4e). Estos resultados sugieren que, tanto
EGFR
GCN y
KRAS
estado de mutación determinar el efecto de anticuerpos anti-EGFR mAb de EGFR señalización corriente abajo y la supervivencia de células de cáncer colorrectal.
Discusión
en este estudio, hemos demostrado que la heterogénea
EGFR
aumento GCN es un fuerte predictor de los beneficios del tratamiento anti-EGFR en CCR metastásico. Los resultados amplían nuestros resultados anteriores de una cohorte de pacientes solo instituto a una cohorte de validación independiente. Además, demuestran el valor predictivo de
EGFR
GCN para la eficacia de la terapia anti-EGFR en pacientes con CRC resistente a la quimioterapia, el grupo de pacientes más importante elegibles para este tratamiento. Los resultados muestran además que intratumoral
EGFR
GCN heterogeneidad es común en el CCR. Nuestra hipótesis es que este previamente contabilizada
EGFR
heterogeneidad es una razón para la pobre correlación entre informado
EGFR
análisis de GCN y la eficacia de la terapia anti-EGFR, y sugerir un método mejorado para predictivo
EGFR
pruebas de GCN.
El material del paciente en nuestro estudio incluyó pacientes tratados con terapia anti-EGFR tanto en una fase temprana y resistente a la quimioterapia de la terapia CRC metastásico. Para controlar los efectos de confusión de la sensibilidad de la quimioterapia cuando se combina con anticuerpos monoclonales anti-EGFR en nuestros resultados, el valor predictivo de
EGFR
GCN en la respuesta al tratamiento anti-EGFR se evaluó por separado en el subgrupo de pacientes tratados en un quimiorrefractaria fase (tercera línea o más). Los resultados obtenidos en el subgrupo quimiorrefractaria fueron similares a los resultados de toda la cohorte de pacientes, que apoya nuestra interpretación de que un alto
EGFR
GCN es de hecho un factor de predicción de la respuesta al tratamiento anti-EGFR favorable.
Tanto cetuximab y panitumumab en el subgrupo de pacientes quimiorrefractaria demostraron mejora de la SSA en
EGFR
pacientes GCN≥4.0. La supervivencia global y la tasa de control de la enfermedad se mejoró estadísticamente para la cohorte cetuximab, y numéricamente, pero no estadísticamente en la pequeña cohorte de panitumumab. Los dos Abs terapéuticas son de tipo diferente, panitumumab ser un mAb completamente humanos, mientras que cetuximab es una quimera de ratón-humano.
in vitro
ensayo demostró la citotoxicidad idéntico para las líneas de CRC probados, pero
in vivo
, otros mecanismos, como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) puede estar en funcionamiento. A este respecto, cetuximab y panitumumab pueden ser diferentes y, por lo tanto, el aumento de
EGFR
GCN podría indicar una mejor sensibilidad al tratamiento cetuximab [11]. De acuerdo a las terapias citotóxicas pre-clínicos y los datos clínicos ciertas +/- agentes inmunomoduladores, incluyendo, por ejemplo, Gilf (gemcitabina, irinotecán, levofolínico, y 5-fluorouracilo), GILFI (gemcitabina, ácido irinotecán, levofolínico, fluorouracilo, aldesleucina), y GOLFIG (gemcitabina, oxaliplatino, levofolinato, 5-fluorouracilo, GM-CSF, aldesleukina) regímenes, tienen la capacidad de eficacia hasta de regular la expresión de EGFR en células de cáncer de colon, mejorando así la sensibilidad de las células de cáncer de colon a cetuximab mediada por ADCC [12] - [14]. En nuestro estudio, panitumumab se utilizó como terapia única con más frecuencia que el cetuximab, 42.9
vs
6,5%, respectivamente, que al menos en parte puede explicar la diferencia observada en los resultados de eficacia entre los dos anticuerpos. Ambos anticuerpos, cuando no se administra como tratamiento único, se combinaron con los regímenes de quimioterapia basados en irinotecán. En nuestro estudio, oxaliplatino o capecitabina sola no se combinaron a la terapia anti-EGFR en la fase resistente a la quimioterapia de la enfermedad. Dos pacientes recibieron cetuximab y panitumumab secuencialmente y por lo tanto excluidos de este estudio. Por lo tanto, ni la combinación de fármacos citotóxicos ni la administración de ambos anticuerpos secuencialmente, explica la diferencia en los resultados obtenidos con los diferentes anticuerpos anti-EGFR. Alternativamente, nuestro resultado puede reflejar una diferencia entre los pacientes tratados. Cetuximab se usa más comúnmente en la cohorte de descubrimiento, que define el valor de corte de prueba y panitumumab en la cohorte de validación con sólo los pacientes resistente a la quimioterapia. Como ambas cohortes eran retrospectivos, no podemos excluir las diferencias en las poblaciones de pacientes, lo que podría explicar las diferencias en los resultados del tratamiento.
heterogeneidad tumoral se ha sugerido para contribuir a las dificultades encontradas en la validación de biomarcadores oncológicos [15] . En el presente trabajo, la media
EGFR
valores GCN fueron significativamente inferiores cuando se analiza de una manera aleatoria, en comparación con los valores obtenidos por la elección de las células con la más alta GCN. Sólo este último método era capaz de distinguir a los pacientes en función de su respuesta al tratamiento anti-EGFR. Esto apoya la opinión de que la toma de decisiones terapéuticas en base a meter el fenotipo dominante puede ser engañosa [15]. Incluso un pequeño porcentaje de alelos mutantes y los perfiles de expresión génica puede ser crucial para la respuesta al tratamiento [16].
EGFR
GCN heterogeneidad es un fenómeno bien establecido en los gliomas [17]. Aunque
EGFR
GCN heterogeneidad en CRC pueden haber sido identificados anteriormente, este hallazgo ha sido generalmente ignorado, y no se utiliza como parámetro en los análisis de diagnóstico. En algunos aspectos, la asociación entre el
EGFR
GCN y la respuesta al tratamiento se asemeja a los resultados de otro miembro de la familia EGFR,
Her2, España en el cáncer gástrico.
Her2
es amplificada o sobreexpresada en el 7-34% de los cánceres gástricos [18]. A diferencia de en el cáncer de mama, la expresión de Her2 en espectáculos de cáncer gástrico marcada heterogeneidad intra-tumoral, y por lo tanto la interpretación prueba de diagnóstico difiere de cáncer de mama [19]. Los diagnósticos predictivos actuales para el tratamiento trastuzumab en el cáncer gástrico se basa en una combinación de Her2 IHC y
Her2
análisis GCN de áreas con alta tinción IHC. En las biopsias, tales áreas pueden cubrir sólo el 5% del tumor [19]. A pesar de que hay un paralelismo, el algoritmo de cáncer gástrico HER2-difiere de
EGFR
GCN en el CCR. En el cáncer gástrico, el valor de corte se basa en el gen de la relación cromosoma ≥2.0, aunque la mayoría de las recomendaciones recientes sugieren que
Her2
GCN & gt; 6.0 puede ser considerado como positivo. En el CRC, el
EGFR
aumento GCN es típicamente un resultado del cromosoma 7 polysomy y por lo tanto el gen a la proporción de cromosoma no es informativo. Por otro lado el cromosoma 17 es raramente poliploide en el cáncer gástrico, lo que indica un mecanismo biológico diferente para
EGFR
y
Her2
aumento.
heterogeneidad tumoral se ha sugerido que la base de resistencia a la terapéutica del cáncer específicos [15]. A este respecto, el hallazgo de que una población menor de
EGFR
pilas de gran GCN define la respuesta al tratamiento es inesperado.