Extracto
La línea celular 22Rv1 es ampliamente utilizado para la investigación del cáncer de próstata y otros estudios realizados en todo el mundo. Se establecieron Estas células de un tumor de próstata humano, CWR22, que se pasa en serie en ratones desnudos y seleccionado por la independencia de andrógenos. Se sabe que las células 22Rv1 para producir altos títulos de virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotropic (XMRV). Estudios recientes sugieren que XMRV se ha creado de forma inadvertida en la década de 1990 cuando dos virus de la leucemia murina (MLV) genomas (pre-XMRV1 y pre-XMRV-2) recombinado durante los pases del tumor CWR22 en ratones. La conclusión de que el XMRV se originó a partir de ratones y no el paciente se basó en parte en la falta de detección de XMRV en xenoinjertos CWR22 tempranas. Mientras que la deducción es, sin duda justificada, se analizó la posibilidad de que un virus estrechamente relacionado podría haber estado presente en el tejido tumoral primario. Aquí mostramos que hemos localizado el tejido del tumor de próstata originales extirpados de CWR22 paciente y hemos ensayado el ADN correspondiente por PCR y las secciones de tejido mediante fluorescencia
In situ
hibridación para detectar la presencia del XMRV o un virus similar. Los tejidos de tumor primario carecían de ADN de ratón como se determina por PCR para intracisternal Un DNA de partículas tipo, evitando así una de las limitaciones de xenoinjertos estudian. Se demuestra que ni el XMRV ni un virus estrechamente relacionados estuvo presente en el tejido prostático primario de CWR22 paciente. Nuestros resultados confirman y refuerzan la conclusión de que el XMRV es un virus de ratón generadas en el laboratorio recombinante que está altamente adaptado para las células de cáncer de próstata humano
Visto:. Das Gupta J, Luk KC, Tang N, C Gaughan, Klein EA , Kandel ES, et al. (2012) La ausencia de XMRV y virus estrechamente relacionados en cáncer de próstata tejidos primarios utilizados para derivar la línea celular XMRV-Infected 22Rv1. PLoS ONE 7 (5): e36072. doi: 10.1371 /journal.pone.0036072
Editor: Gilda Tachedjian, Burnet Institute, Australia |
Recibido: 1 de Febrero, 2012; Aceptado: March 25, 2012; Publicado: 16 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Das Gupta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estas investigaciones se llevaron a cabo con el apoyo de la Fundación Geyer Charlotte, la Fundación y Abbott Laboratories Maltz Familia (RHS y EAK), NCI subvención CA137708 (al ESK), y por la extracción del tejido, Facilidad de Histología e inmunohistoquímica núcleo del Centro Integral del cáncer de la caja (CA43703 P30). Los co-autores en Abbott estaban involucrados en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito. Las otras agencias de financiación no tiene un papel tan
Conflicto de intereses:. KL, NT y JH son empleados y accionistas de Abbott Laboratories. JDG, JAE, y RHS son inventores de patentes concedidas a los Laboratorios Abbott que se relacionan con el XMRV. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El virus de la leucemia murina relacionada con el virus xenotropic (XMRV) es un gammaretrovirus descubierto durante los estudios de pacientes con cáncer de próstata con una deficiencia genética sutil en el gen para la proteína antiviral de RNasa L [1]. Mientras que varios estudios posteriores proporcionan evidencia adicional, ya sea para el XMRV o un virus estrechamente relacionados en pacientes con cáncer de próstata [2] - [6], más estudios o bien no pudieron detectar ninguna evidencia del XMRV en pacientes con cáncer de próstata o se obtuvieron pruebas pero no se limitan a una pequeño número de muestras humanas [7] - [16]. Algunos de los resultados positivos en el cáncer de próstata, incluyendo, pero no limitado a, mapeo del sitio de integración y la detección de productos de PCR fueron encontrados más tarde a ser el resultado de contaminación de laboratorio [17], [18]. Las posibles fuentes de contaminación incluyen ADN de ratón que alberga provirus MLV, plásmidos o PCR productos XMRV, y la propia XMRV a partir de líneas de células infectadas. Por ejemplo, el ADN de ratón a veces está presente en cantidades traza en algunas polimerasas Taq, PCR Master Mix preparaciones y kits de extracción de ADN que conducen a falsos positivos en los ensayos de PCR [19] - [22]. Los falsos negativos también pueden ser producidos en los ensayos de PCR aún más la detección de confusión de XMRV o virus relacionados [23]. Un único estudio también mostró la presencia de XMRV en pacientes con síndrome de fatiga crónica [24], pero recientemente los resultados se han atribuido en gran medida a la contaminación del laboratorio [25] - [27] y el informe original de RETRACTE [28]. Basado en un estudio reciente a gran escala de los donantes de sangre en los EE.UU., es poco probable que el XMRV
per se
ha entrado en esta población humana en un grado significativo (0% de prevalencia; 95% intervalo de confianza del 0% -0.017 %) [29]. Sin embargo, algunos de los resultados positivos que implican métodos no basados en la PCR, como la serología, la inmunohistoquímica y la fluorescencia
In situ
hibridación (FISH), que aparentemente han detectado XMRV o virus similares en muestras humanas todavía tienen que ser plenamente explaine [1], [3], [24]. Tal evidencia deja abierta la posibilidad de que cualquiera de ADN de ratón o un virus XMRV similar está presente en al menos algunos de los seres humanos.
En este contexto, el origen del XMRV fue recientemente aclarada mediante el estudio de la línea celular de cáncer de próstata humano, 22Rv1, y sus precursores xenoinjertos cultivan en micrófono nude [30]. Las células 22Rv1 están infectadas con, y producen títulos elevados de, una XMRV que es casi idéntico en la secuencia de la cepa XMRV VP62 de Studie de cáncer de próstata [1], [30], [31]. El origen de las células 22Rv1 se remonta a un carcinoma de próstata humano (grado de Gleason 9) que se escindió en 1992 en la Case Western Reserve Universit [32]. Posteriormente, el tumor, denominado CWR22, se trasplantó en serie en ratones desnudos. En 1996, después de cuatro años de paso en serie en ratones desnudos, se realizó la castración de los ratones que conduce a la regresión y la recaída del tumo [33]. El tumor andrógeno-independiente resultante, CWR22R, entonces fue trasplantado en ratones en serie hasta 1999, cuando fue utilizado para establecer la celda 22Rv1 lin [34]. Los altos niveles de XMRV están presentes en las líneas celulares 22Rv1 ya finales de pasajes del tumor CWR22, pero no en xenoinjerto temprana [30], [35]. Sorprendentemente, los ratones huésped contienen dos provirus, pre-XMRV1 y pre-XMRV2, con tramos largos (& gt; 3,2 kb) que son 99.9% idéntica a XMR [30]. Se planteó la hipótesis de que la recombinación entre los dos provirus llevó a XMRV y que XMRV estaba ausente del tumor original. Sin embargo, las muestras tumorales originales no se evaluaron en esos informes mientras xenoinjertos contienen inevitablemente niveles bajos de células de ratón. La presencia de provirus endógeno de ratón en el ADN de dichas células de ratón contaminantes limita la elección de sondas y cebadores de PCR que podrían ser utilizados para identificar de forma exclusiva elementos XMRV como en esas muestras. A continuación se describe el análisis de los bloques incluidos en parafina de próstata CWR22 del paciente y demostrar que ni el XMRV ni virus estrechamente relacionados están presentes en el tumor primario.
Materiales y Métodos
Tratamiento de bloques de tejido de la próstata
Tratamiento de bloques fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) se llevó a cabo en el Instituto de Medicina Genómica y el Departamento de Medicina de Laboratorio, Clínica de Cleveland. Cinco de próstata bloques de parafina de tejido de CWR22 paciente (A marcada, B, C, E, y K) se seccionaron a un ancho de 5 μ en un micrótomo que había sido utilizado exclusivamente para muestras humanas. Las secciones fueron recogidas en tubos ya sea para la extracción de ADN o se colocan en portaobjetos de microscopio para el análisis FISH. Las secciones se almacenan en un refrigerador 4 ° C en el Instituto de Medicina Genómica biorepositorio (Cleveland Clinic). La extracción de ADN se realizó en el mismo laboratorio en el que se utilizó nunca ni XMRV ni plásmido XMRV. El tejido recogido originalmente a partir del cual se produce el trasplante CWR22 se descartó el tejido y no se requería el consentimiento del paciente.
La extracción de ADN a partir de secciones de próstata
La extracción de ADN se realizó mediante el método siguiente (proporcionada por El Dr. Charis Eng, Instituto de Medicina Genómica, Cleveland Clinic: http://www.lerner.ccf.org/gmi/gmb/methods.php). Desparafinización se llevó a cabo mediante la adición de xileno 1 ml a 18 secciones (5 μ de anchura cada uno), agitando suavemente durante 10 min, centrifugación durante 10 min a 16.000 g a temperatura ambiente y descartar los sobrenadantes. Esta etapa se repitió dos veces. Después, la extracción se realizó con 1 ml cada uno de etanol 100% (2 veces), 80% de etanol (2 veces) y 50% de etanol (2 veces), cada vez de centrifugar durante 10 min a 16.000 g a temperatura ambiente y descartar los sobrenadantes . Para el sedimento se añadió 1 ml de agua libre de nucleasa (USB /Affymetrix) y se incubaron a 4 ° C durante la noche. El sedimento se recogió después de la centrifugación durante 10 min a 16.000 g a temperatura ambiente después de descartar el sobrenadante. Nucleic Acid tampón de lisis, 700 l, (10 mM Tris Base, NaCl 400 mM, Na 2
2EDTA y 0,7% SDS), se añadió al sedimento. Se añadió proteinasa K, 50 l (30 mg /ml) (Invitrogen) y la digestión se realizó a 65 ° C durante 24 hrs. Se añadieron 50 l adicionales de solución de proteinasa K, incubadas durante la noche a 65 ° C, se añadieron 250 l de 6 M de NaCl, se mezcla a fondo, y se deja a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 10 min a 16.000 g a temperatura ambiente para sedimentar el ADN y los sobrenadantes se descartaron suavemente. Los sedimentos se lavaron con 70% de etanol y se secó al aire en la parte superior del banco de unos pocos min. Cada sedimento se resuspendió en 40 l de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM) (USB /Affymetrix) y se almacenó a 4 ° C
polimorfismo de nucleótido único (SNP) genotipado (Roswell Park Cancer. Instituto)
genotipado de SNP se realizó mediante el sistema compacto MassARRAY (Sequenom, Inc., San Diego, CA) en un panel de 30 ensayos de SNP encargo diseñados utilizando RealSNP y MassARRAY Ensayo Designer (Sequenom). Brevemente, el protocolo implica la amplificación PCR de 10 ng de ADN usando cebadores específicos de SNP, seguido de una reacción de extensión de base utilizando la química IPLEX Gold (Sequenom). Los productos finales de extensión de base fueron tratados y vistos en una SpectroCHIP 384-pad (Sequenom) utilizando un nanodispenser ChipSpotter LT (Samsung). A MassARRAY analizador compacto MALDI-TOF MS (Sequenom) se utilizó para la adquisición de datos de la SpectroCHIP. Los genotipos resultantes se denominan utilizando MassARRAY Typer Analizador v4.0 (Sequenom).
PCR cuantitativa (qPCR) para XMRV (Cleveland Clinic)
Las muestras de ADN se diluyeron a 100 ng /l en TE tampón y 2 l (200 ng) se utilizaron alícuotas por duplicado para los ensayos de qPCR (excepto para la muestra K, 17 ng de ADN se utilizó debido a una menor cantidad de ADN disponible). Fast Mastermix (Applied Biosystems) se utilizó para los ensayos de qPCR utilizando un Primer Paso Plus máquina de PCR en tiempo real, siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Las condiciones de PCR para el uso de PCR Mastermix Fast fueron: 95 ° C durante 20 s para la desnaturalización inicial, seguido de 95 ° C durante 1 seg, 60 ° C durante 20 seg (etapa de recogida de datos), que se repite durante 50 veces. Las sondas de oligonucleótidos contenían 6-carboxifluoresceína (FAM) vinculado al extremo 5 'y no fluorescentes Refrescante-Menor Grove Carpeta (NFQ-MBG) relacionado con el extremo 3' (Applied Biosystems].
env
gen:
6124F: 5'-GGCCGAGAGAGGGCTACT-3 '
6159R: 5'-FAM-CACATCCCCATTTGCC-NFQ-MGB-3'
6197R: 5 ' -TGATGATGATGGCTTCCAGTATGC-3 '
gag
gen:
625F: 5'-GTAACTACCCCTCTGAGTCTAACCT-3'
668F: 5'-FAM-TCCAGCGCATTGCATC- NFQ-MGB-3 '
708R: 5'-CTTCTTGACATCCACAGACTGGTT-3'
pol
gen:
4843F: 5'-3-CGGGACAGAACTATCCAGTATGTGA '
4873F: 5'-FAM-ACCTGCACCGCCTGTG- NFQ-MGB-3'
4912R: 5'-TGGCTTTGCTGGCATTTACTTG -3 '
Como control interno, que mide se utilizaron niveles del gen RNasa P (un gen de una sola copia) que codifica la porción de ARN de la enzima RNasa P. de control marcada con VIC RNasa P combinación de cebadores-sonda de Applied Biosystems. un número de copias conocido de la longitud completa XMRV VP62 genoma en el plásmido pcDNA 3.1 [36] se utilizó como control positivo para probar cada combinación de cebadores-sonda.
intracisternal a-partículas (IAP) ensayos de qPCR (Cleveland Clinic) guía
QPCR para el ratón IAP ADN se realizó con los siguientes oligonucleótidos cebadores /sonda:
IAP-1414F: 5'-TGGCGAAAGTCAGCGTACTG-3 '
IAP-1435F: 5'-FAM-TCAACCTCCCGGCAGT-NFQ-MGB-3 '
IAP-1472R: 5'-CATAGGGCGGACCTTGAAAC-3'
Como control positivo para el IAP, el ADN de la cola del ratón se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN Qiagen, su concentración se mide mediante la absorbancia y diluyeron en serie en tampón TE para generar la curva estándar. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las que se utilizan para detectar secuencias XMRV.
tiempo real pruebas RT-PCR para XMRV (Abbott Molecular)
Single-ronda tiempo real de reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa ( RT-PCR) ensayos del prototipo se realizaron en el
m
de 2000
rt
TM (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) instrumento. Un promedio de 500 ng de ADN de cáncer de próstata CWR22 paciente (bloques A, B, C, E y K) se amplificó con dos juegos de cebadores diseñados para dirigirse individualmente la polimerasa (
pol
) o un sobre (
env
) regiones del genoma XMRV. Cada muestra de ADN se diluyó en agua para alcanzar un volumen de 25 l se combinó con 25 l de mezcla maestra que contenían tampón 10x EZ, enzima rTth, dNTPs, tinte de referencia Rox, MnCl
2, cebadores y sondas, para obtener una final volumen de reacción de PCR de 50 l. secuencias /sonda de cebos, las condiciones de los ciclos y la estimación de la sensibilidad /especificidad de
pol
y
env ensayos
RT-PCR han sido descritas en detalle previousl [37]. Un conjunto de cebador /sonda para detectar los 136 bases de humano
β-globina
gen se utilizó para controlar por especímenes de adecuación y se amplificó y se detectó simultáneamente con XMRV (señal de Fam) en la misma reacción con un colorante de fluorescencia diferente (señal de Cy5). tampón TE que contiene 1,5 mg /ml de poli dA: dT se utilizó como control negativo de ensayo (NC). plásmido ADN VP62 XMRV diluida en el CN se utilizó como control positivo del ensayo (PC).
fluorescencia
In situ
hibridación (FISH) (Abbott Diagnostics)
El XMRV- SO FISH sonda se preparó mediante el etiquetado directamente a todo el ADN plásmido (~13.6 kb) del clon VP62 /pcDNA3.1 que lleva un genoma de longitud completa (~8.2 kb) del XMRV VP62 (36) con SpectrumOrange fluoróforo a través de reacciones químicas como se describe previousl [38], [39]. El porcentaje de incorporación de SpectrumOrange en la sonda de XMRV-SO era ~ 8%. Se obtuvo la sonda CEP8-SA derivada de la secuencia centromérica del cromosoma humano 8 y directamente marcado con fluoróforo SpectrumAqua de Abbott Molecular, Inc.
Para la evaluación de rendimiento de la sonda XMRV FISH, XMRV no infectada de células de cáncer de próstata DU145 [36] se utilizaron como un control negativo, mientras que las células de cáncer de próstata 22Rv1 albergar ~ 10 copias integradas del XMRV por célula y la generación de alto título de virus XMRV [31] se utilizaron como control positivo. Ambas líneas celulares se cultivaron en DMEM-F12 medio completo (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. Después de alcanzar 60% -70% de confluencia, 1 ml de solución colcemid (10 mg /ml; Invitrogen) se añadió por medio de cultivo 50 ml y las células se cultivaron a 37 ° C durante 2 hr. Las células se recogieron después de tripsinización, se lavaron una vez con 40 ml de 1x DPBS (Invitrogen), se resuspendieron en 40 ml de solución de cloruro de potasio 0,075 M (Invitrogen), y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las células se lavaron a continuación con 40 ml de fijador de Carnoy (03:01 v /v de metanol: ácido acético glacial; Fisher, Pittsburgh, PA) cuatro veces, se resuspendieron en 5 ml de fijador de Carnoy y almacenados a -20 ° C. Los portaobjetos con una mezcla de DU145 y 22Rv1 se prepararon mediante el depósito de 10 l de cada suspensión de células en un SuperFrost Plus diapositivas cargado positivamente (ThermoShandon, Pittsburgh, PA). El portaobjetos fue durante la noche antes de pretratamiento FISH y la hibridación
portaobjetos de células se trataron previamente en 2x SSC se secó al aire (0,3 M NaCl, citrato de sodio 0,03 M, pH 7,0; Invitrogen). A 73 ° C durante 2 min después se incubaron en 0,5 mg /ml de pepsina en HCl 10 mM (USB, Cleveland, OH) a 37 ° C durante 10 min. Los portaobjetos se enjuagaron en 1X DPBS (Invitrogen) durante 5 min a temperatura ambiente, se fijaron en solución de formalina tamponada neutra al 1% (Fisher) durante 5 min, después se sumerge en 1X DPBS para 5 min. Los portaobjetos se deshidrataron en una serie de etanol de 70%, 85% y 100% durante 1 min cada uno, y después se secó al aire. Diez l de solución de hibridación se preparó mezclando XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng de ADN de placenta humana se sometió a ultrasonidos 100 ng, 250 ng humano Cot-1 DNA, y 7 l LSI /WCP tampón de hibridación (Abbott Molecular, Inc. ), y se aplicó a cada diapositiva. Un cubreobjetos (22 x 22 mm; VWR, Radnor, PA) se coloca sobre la solución de la sonda, y se sella a la corredera con el cemento de caucho (Staples, Framingham, MA). Las sondas y los ácidos nucleicos de células en cada portaobjetos fueron co-desnaturalizados a 73 ° C durante 3 minutos y después se hibridaron a 37 ° C durante 16-24 horas en una plataforma de hibridación (ThermoBrite; Abbott Molecular, Inc.). Después de la hibridación, los portaobjetos se lavaron en 0,4 x SSC /0,3% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) durante 2 minutos a 73 ° C y luego en 2x SSC /0,1% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) para 1 min a temperatura ambiente. Diez l de contratinción nuclear DAPI II (125 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) se aplicó a cada muestra, y se evaluaron portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. sonda de XMRV-SO se visualizó con un conjunto de filtros de color naranja, la sonda CEP8-SA se visualizó con un conjunto de filtros de agua, y DAPI nuclear se visualizó con un conjunto de filtros DAPI.
Los portaobjetos montado con secciones de tejido de cáncer de próstata FFPE se cocieron a 56 ° C durante 4 horas y después se almacenó a temperatura ambiente. En la preparación para la hibridación FISH, muestra de tejido portaobjetos se desparafinaron tres veces en Hemo-De disolvente (Seguridad Scientific disolventes, Keller, TX) durante 5 min cada uno a temperatura ambiente y se enjuagaron dos veces en etanol absoluto durante 1 min cada uno. Los portaobjetos se pretrataron a continuación en una solución de ácido fórmico 45% (Fisher) /0.3% peróxido de hidrógeno (Calbiochem, San Diego, CA) durante 15 min a temperatura ambiente y se enjuagaron en H
2O para 3 min. Los portaobjetos se incubaron a continuación en solución de pretratamiento (Abbott Molecular, Inc.) a 80 ° C durante 35 min, se lavaron en H
2O a temperatura ambiente durante 3 min, se incubaron en una solución de pepsina (1,5 mg /ml en 0,1 N HCl ) a 37 ° C durante 22 min, se enjuagaron en H
2O a temperatura ambiente durante 3 min. Las láminas fueron posteriormente se deshidrataron en 70%, 85% y 100% de etanol durante 1 min cada uno, y se dejó secar a temperatura ambiente. Diez l de sonda de mezcla de hibridación que contenía 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonicated ADN de placenta humana, humano 250 ng de ADN Cot-1, y 7 l de tampón de hibridación LSI /PMC se colocó sobre cada sección de tejido. Un cubreobjetos se aplicó y los bordes se sellaron a la corredera con cemento de goma. Las sondas y los muestra de tejido ácidos nucleicos en cada diapositiva se co-desnaturalizado durante 5 minutos a 73 ° C y se hibridaron durante 16-24 horas a 37 ° C en un ThermoBrite. Después de la hibridación, los portaobjetos se colocan en 2x SSC /0,1% NP-40 a temperatura ambiente durante 5 a 10 min, se lavaron en 0,4 x SSC /0,3% NP-40 a 73 ° C durante 2 min y en 2 x SSC /0,1% NP-40 a temperatura ambiente durante 1 min. Diez l de DAPI contratinción nuclear I (1.000 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) se aplicaron a cada sección de tejido, y se evaluaron portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia
Declaración Ethical
Estos. los estudios fueron aprobados por la Cleveland Clinic Foundation Junta de Revisión Institucional#1.
resultados
identificación y verificación de los tejidos de la próstata CWR22
en 1992, el cáncer de próstata CWR22 pacientes fueron sometidos a resección transuretral de la próstata en la Case Western Reserve Universit [32]. Después de la cirugía, los chips de tejido prostático fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra y se incluyeron en bloques de parafina. Después de los estudios de diagnóstico y emisión de un informe de patología estándar, los bloques se mantienen en almacenamiento por parte del Departamento de Patología (Case Western Reserve University) a temperatura ambiente constante, sobre todo en las habitaciones sin luz. A mediados de 2011, los bloques de tejido fueron identificados, aunque registros impresos archivados como el resultado de CWR22 paciente y luego fueron recuperados de almacenamiento. La Hospitales Universitarios (Cleveland) Junta de Revisión Institucional permite el mantenimiento de registros de pacientes y muestras para estudios futuros; con una capacidad para la re-vinculación manteniendo al mismo tiempo un cortafuegos para evitar la liberación de cualquier información de salud pública a los investigadores
.
Los bloques de próstata se seccionaron en un micrótomo utilizado exclusivamente para los tejidos humanos en el Departamento de Medicina de Laboratorio (Cleveland Clinic ). El ADN se extrajo en el Instituto de Medicina Genómica (Cleveland Clinic) en un laboratorio donde se utilizaron ni XMRV ni ácidos nucleicos XMRV. Para confirmar el origen común de las muestras, las muestras de ADN de cinco bloques de próstata FFPE de CWR22 paciente (etiquetados como A, B, C, E & amp; K) se compararon entre sí, así como a la descrita anteriormente [35] muestras de un xenotrasplante CWR y la línea celular 22Rv1 por análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el Roswell Park Cancer Institute (Buffalo). Que se basó en un método para detectar SNPs utilizando el sistema totalmente automatizado de Sequenom, Inc. (San Diego, CA). El sistema se basa en la amplificación por PCR de la región de interés, seguido de la extensión del cebador a través del sitio polimórfico en la presencia de tres desoxirribonucleótidos trifosfato y un trifosfato de dideoxiribonucleótido, y la determinación de la composición de nucleótidos de los productos de extensión corto usando espectrometría de masas [ ,,,0],40]. Se observó que todas las siete muestras llevaron a un patrón idéntico de SNPs en los treinta de los sitios examinados (Tabla 1), lo que confirma que los bloques de tejido de la próstata se originó con el mismo paciente al igual que las células de xenoinjerto CWR y 22Rv1.
Ausencia de ADN XMRV o la de un virus estrechamente relacionado en CWR22 paciente
Para determinar si los ácidos nucleicos de XMRV o un virus estrechamente relacionados estuvo presente en la próstata del paciente CWR22, la PCR se llevó a cabo de forma independiente en el Departamento de Biología del cáncer, Clínica de Cleveland (Cleveland) y en Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines).
qPCR de la Cleveland Clinic.
para determinar la sensibilidad de qPCR para XMRV
gag
,
pol
, y
env
, los ensayos se realizaron con el clon molecular del virus de longitud completa, el plásmido XMRV VP62 [36]. Tan solo 15 copias de plásmido XMRV se detectaron de forma reproducible con cebadores y sondas para los tres genes XMRV (
gag
,
pol
, y
env
) (fig. 1A ). Debido a que la secuencia de nucleótidos del XMRV es hasta un 95% idéntico a varias proviruse endógena MLV [1], hemos tratado de determinar si qPCR para XMRV
gag
,
pol
, y
env también habría
amplificar secuencias de ADN a partir de MLV ratón. QPCR con XMRV
gag
y
env
cebadores amplificó productos desde tan poco como 100 fg de ADN de la cola del ratón, mientras que el XMRV
pol
cebadores no producían productos PCR de ratón de ADN (Fig. 1B & amp; C y los datos no presentados). Estos resultados sugieren que MLV provirus endógenos pueden ser detectados por qPCR, ya sea con el XMRV
gag
o
env
cebadores, pero no con los
pol
cebadores. Para supervisar la contaminación de ADN del ratón, qPCR se realizó para ratón IAP (elementos móviles similares a retrovirus endógenos [41] que son fácilmente detectables por PC [18]). Sorprendentemente, tan poco como 1 fg de ADN de la cola del ratón fue detectado por qPCR para el ADN IAP (Fig. 1D). Estos resultados son consistentes con la presencia de alrededor de 50 MLV provirus [42] y 1000 copias de ADN por ratón IAP genoma haploide [41].
(A) nueve diluciones diferentes de XMRV VP62 plásmido (de 15 a 15 × 10
9 copias de cada reacción por duplicado) se utilizaron para generar la curva estándar utilizando
gag
,
pol
y
env
combinaciones de sonda cebador. (B-D) La dilución en serie de ADN de la cola del ratón (1 fg a 100 ng de cada reacción por duplicado) se utilizaron para generar los datos para (B)
gag
, (C)
env
y (D) IAP. e, exponente (10 a la potencia de
n
).
Para demostrar unidades de fluorescencia representativas en función del número de ciclo, el XMRV VP62 plásmido fue sometido a qPCR para XMRV
gag
,
pol
, y
env Hoteles en comparación con el control de reacciones que carecen de ADN añadido (Fig. 2A). ensayo de QPCR se realizó usando ADN de los diferentes bloques de tejido de próstata de CWR22 paciente. Sin embargo, no se detectó ADN XMRV en ensayos duplicados para los tres genes XMRV con ADN CWR22 de próstata a partir de bloques A, B, C, E y K (Fig. 2B y en la Tabla 2). Uno de los 2 ensayos para XMRV
env
en el bloque C sólo se produce una respuesta débil a & gt; 40 ciclos, lo cual está por debajo del límite de detección y fiable de probabilidad representa un artefacto. Sin ratón IAP ADN fue detectado por PCR del ADN extraído de los tejidos de la próstata CWR22 que indica una ausencia de contaminación de ADN de ratón en estas muestras (Tabla 2).
gráfico de amplificación de análisis en tiempo real qPCR para (a) la detección de regiones específicas XMRV (
gag
,
pol
y
env
) usando el XMRV plásmido ADN VP62 (3.750 copias) y (B) en el ADN extraído de las diferentes secciones de los tejidos de la próstata (CWR22 tejido bloques a, B, C & amp; e, cada uno está probado en duplicado). Para el bloque C solamente, 1 de 2 ensayo para
env
fue débilmente positivo, todos los otros ensayos para
gag
,
pol
y
env
fueron negativos .
RNasa P
sondas se utilizaron para detectar la presencia de ADN genómico en los tejidos tumorales.
Real-time RT-PCR en Abbott Molecular.
Para interrogar más las muestras de tejido de la próstata para detectar la infección por XMRV,
pol
y
env
se utilizaron dos de una sola vuelta adicional en tiempo real RT-PCR ensayos dirigidos XMRV. La sensibilidad y la especificidad de los dos ensayos para la detección de XMRV anteriormente se han demostrado; estos se basan en la comparación de múltiples ensayos con paneles de control codificados creados por el XMRV del grupo sanguíneo de Investigación Científica de Trabajo (BSRWG) [37], [43]. Utilización de los paneles de sangre y de plasma preparados por el BSRWG, estos ensayos eran iguales a los ensayos de teste más sensible [43]. El uso de diluciones en serie de los controles de plásmido XMRV VP62, ambos ensayos podrían detectar de forma fiable 5 copias de ADN por reacción. En base a esta sensibilidad del ensayo, se estima un límite inferior de detección de aproximadamente 1 genoma proviral por 17.000 células. reacciones de control positivo eran controles positivos y negativos fueron negativos (Fig. 3A). No XMRV se detectó ya sea por el
pol
o
env
ensayos en ADN extraído a partir de bloques de próstata CWR22 A, B, C, E y K (Fig 3A;. Tabla 2). gráficas de amplificación de señal de
β- globina
(Cy5) amplificada durante la misma ejecución (fig. 1B, Tabla 2), reveló que todas las muestras de los pacientes fueron positivos para
β-globina
ADN, lo que indica que hay fue suficiente ADN presente en las muestras para la amplificación.
gráficas de amplificación de la PCR en tiempo real el análisis de la señal (a) XMRV (FAM) en el ADN extraído a partir de diferentes secciones de tejidos de próstata CWR22 y ejecutar los controles con el
pol
y
env
cebador /sonda fija; (B)
β- globina
señal (Cy5) durante el mismo plazo.
Análisis XMRV FISH de secciones de tejido CWR22
Un enfoque alternativo para la identificación molecular de infección viral es el pescado. secciones de tejido FFPE de cada uno de los bloques de CWR22 de próstata A, B, C, E y K fueron seleccionados para la evidencia de infección XMRV utilizando una sonda marcada directamente-(XMRV-SO). La mezcla de sondas contenía también una segunda sonda, CEP8-SA, que se hibrida con la región centromérica del cromosoma humano 8, que sirvió como un control interno para controlar la integridad de la etapa de FISH hibridación. Se utilizaron las diapositivas que contienen una mezcla de células de cáncer de próstata DU145 no infectadas y 22Rv1 células de cáncer de próstata XMRV infectados (≥10 copias integradas /célula) para establecer la especificidad y la localización de la hibridación FISH. Los resultados de este análisis se muestran (Fig 4A & amp;. B). El marcador cromosómico CEP8-SA distingue fácilmente las dos líneas celulares como tres copias estaban presentes en DU145 mientras que 22Rv1 contenía dos copias. XMRV FISH hibridación sólo se observó para las células 22Rv1. XMRV-tinción en las células 22Rv1 fue localizada principalmente en el núcleo, mientras que algunos tinción se encuentra en el citoplasma. El pretratamiento de las células con RNasa A para digerir tanto el ARN celular y viral antes de la hibridación de la sonda XMRV-SO dado lugar a un patrón de tinción punctuate, indicativo de DNA proviral integrado XMRV, localizado en el núcleo (datos no mostrados). Imágenes representativas del análisis FISH XMRV en secciones de tejido CWR22 de los bloques A, B, C, E y K se muestran (Fig. 4C-G, respectivamente). Las secciones de tejido de los bloques B, C y E fueron negativos para la tinción con la sonda XMRV-SO a pesar de que fueron positivos para la sonda de control interno CEP8-SA (Fig. 4 y datos no mostrados). Las secciones de los bloques A y K fueron negativos para la tinción XMRV con la excepción de algunas células a lo largo de un borde de cada diapositiva. Para examinar la especificidad de esta tinción, un virus del papiloma humano tipo de sonda 16 sonda marcada en la misma manera que la sonda XMRV se hibridó con secciones de los bloques A y K. De manera similar a lo que se observó con la sonda XMRV-SO, las secciones fueron negativos con la excepción de las células a lo largo del mismo borde de las diapositivas (datos no mostrados). Por lo tanto, la tinción observada a lo largo del borde de estas diapositivas parece ser un artefacto no específica. Sobre la base de este análisis, se concluye que las secciones de todos los bloques de tejido CWR22 son negativos para el XMRV y virus relacionados.
Cada diapositiva se hibridó con una mezcla de sondas que consiste en la sonda XMRV-SO viral derivado de un completo -length XMRV VP62 y CEP8-SA sonda de control interno de la secuencia centromérica del cromosoma humano 8. (a) imagen representativo que muestra tinción XMRV-SO naranja en una mezcla de células de cáncer de próstata DU145 no infectada y 22Rv1 XMRV infectados; (B) la misma imagen que muestra CEP8-SA tinción aqua en DU145 (tres copias /célula) y 22Rv1 (dos copias /célula); . (C - G) que muestra imágenes representativas resultados de FISH en secciones de tejido de los bloques A, B, C, E y K, respectivamente, de CWR22 SO-XMRV
Discusión
Un estudio anterior propuso que XMRV se generó por recombinación entre dos provirus endógenos de ratones, pre-XMRV1 y pre-XMRV2, durante el paso de las células tumorales CWR22 en mic nude [30]. Mientras XMRV originó en ratones, es muy adaptado para las células epiteliales de próstata humano como resultado de las interacciones de células virus-huésped en vivo. Por ejemplo, el XMRV de trata de epitelio prostático dentro de 6 o 7 días de la infección experimental del macaco rhesus [44], aunque no en macacos cola de cerdo en 119 días post-INFECTIO [45]. Las infecciones iniciales en el linaje de células CWR22 que llevaron a la línea celular 22Rv1 probablemente fueron facilitadas por las deficiencias de la inmunidad innata.