Cáncer Humano
Extracto
Una plataforma bio-cuantitativo de imágenes se ha desarrollado para el análisis de la diseminación del cáncer humano en un ensayo de vertebrados xenotrasplantes a corto plazo. Seis días después de la implantación de células cancerosas en embriones de pez cebra, de formación de imágenes automatizado en placas de 96 pocillos acoplados a los algoritmos de análisis de imagen cuantifica extendiéndose por todo el huésped. Los hallazgos en este modelo se correlacionan con el comportamiento en modelos de roedores de xenoinjertos a largo plazo para los paneles de poorly- frente a líneas celulares altamente malignos derivados de mama, colorrectal y cáncer de próstata. Además, las células de cáncer con características mesenquimales dispersas muestran una mayor capacidad de difusión de tipos de células con apariencia epitelial. Por otra parte, la interferencia de ARN establece el papel metástasis supresor de E-cadherina en este modelo. Este ensayo de bio-imágenes animal entero cuantitativa automatizada puede servir como una primera línea
in vivo
etapa de tamizado en la tubería de objetivos farmacológicos contra el cáncer
Visto:. Ghotra VPS, He S, de Bont H, van der Ent W, Spaink HP, van de Water B, et al. (2012) Automatizado animal entero Bio-Imaging Ensayo para la Difusión del Cáncer Humano. PLoS ONE 7 (2): e31281. doi: 10.1371 /journal.pone.0031281
Editor: Laurent RENIA, Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación - Singapur Inmunología red, Singapur
Recibido: 2 Agosto, 2011; Aceptado: January 4, 2012; Publicado: 8 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Ghotra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Sociedad holandesa del cáncer (UL-2010-4670) y el proyecto FP7 cáncer ZF UE (SALUD-F2-2008-201439). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pantallas tradicionales de medicamentos contra el cáncer se realizan utilizando líneas celulares en cultivo 2D o utilizando
in vitro
ensayos de unión en proteínas. la progresión del cáncer, sin embargo, es un proceso complejo de interacciones dinámicas entre células cancerosas y el organismo que implica alteraciones genéticas que conduce a la supervivencia y la proliferación desregulada, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [1]. Idealmente, los genes que juegan un papel en este proceso se identifican por
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la ablación o el silenciamiento. Aunque los modelos genéticos de ratón para los modelos de xenotrasplante de células cancerosas y tumores humanos en roedores siguen siendo esenciales, tales sistemas son costosos, lentos y menos susceptibles de ensayos de alto rendimiento para la detección de destino medicamento contra el cáncer. Existe una clara necesidad de desarrollar
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sistemas rápidos, semi-automatizado para el medio a aplicaciones de cribado de alto rendimiento en la detección de destino preclínica y la identificación de compuestos de plomo.
A este respecto, el pez cebra ( ZF) ofrecen una serie de ventajas únicas para la investigación de los mecanismos que impulsan la formación y progresión del cáncer. ZF son vertebrados que pueden elevarse en grandes cantidades de una manera rentable. Una secuencia del genoma casi completo revela que la mayoría de los genes del cáncer y genes supresores de tumores son altamente conservadas entre ZF y los seres humanos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish) y la forma ZF tumores espontáneos con histopatológico similares y los perfiles de expresión de genes como los tumores humanos [2] - [4]. Es importante destacar que los xenotrasplantes con células cancerosas humanas es posible [5], [6]. embriones ZF que se utilizan para este propósito carecen de un sistema inmune adaptativo, lo que aumenta el éxito de los xenotrasplantes, mientras que proporcionan un microambiente donde las células tumorales humanas proliferan, migran, las masas de forma tumorales y estimulan la angiogénesis [5] - [8].
embriones ZF son particularmente útiles para las plataformas semi-alto rendimiento análisis microscópico ya que son translúcidas, y pueden ser mantenidas en placas de 96 pocillos. La transparencia óptica de ZF ofrece oportunidades de investigación interesantes que permiten la visualización del proceso metastásico en alta resolución [8], [9]. Hallazgos recientes indican que una amplia gama de compuestos farmacéuticamente activos ilícitos respuestas fisiológicas en embriones de ZF e inhiben el desarrollo de enfermedades similares a los efectos en los sistemas de mamíferos [10] - [12]. Estos resultados subrayan el potencial para un modelo de embrión xenotrasplantes ZF para ser utilizado en el proceso de descubrimiento de fármacos anti-cáncer. Sin embargo, en este momento, el uso de ZF para detectar el cáncer de drogas relevante - y objetivos de genes se ve limitada por la falta de bioensayos automatizados integrales. A continuación, se aplicó automatizado procedimientos de imágenes y análisis de imágenes a un modelo de xenotrasplante de ZF para desarrollar el primer ensayo de bio-cuantitativo de imágenes semiautomático de todo el organismo para el análisis de la difusión del cáncer en un vertebrado.
Resultados
Hemos desarrollado un método no invasivo, cuantitativa animal entero bioimagen para la diseminación de las células cancerosas humanas en embriones xwnotransplantado ZF en formato de 96 pocillos. Todos los pasos se describen brevemente en la Figura 1.
(A) de la implantación el saco vitelino del CM-marcadas con Dil células tumorales en Tg (Fli: EGFP) embriones ZF 2 días después de la fertilización. (B) El formaldehído fija 6 embriones dpi dispuestos en placas de 96 pocillos. (C) automatizado de adquisición de imágenes utilizando la plataforma CLSM equipado con plataforma móvil capta múltiples pilas Z por embrión utilizando 488 y 561 nm líneas láser. (D y E) Creación automática de imágenes compuestas de profundidad extendida. (F) múltiples imágenes de profundidad extendidos que representa embriones que yacen en diferentes orientaciones laterales. (G) automatizado reorientación uniforme de imágenes. (H) Diagrama de dispersión que representa la carga focos tumorales en múltiples embriones pertenecientes a una condición experimental.
automatizada captura de imágenes y pre-procesamiento
CMDiI-etiquetados células tumorales fueron inyectadas en la yema saco de 2 días de edad embriones FLI-EGFP [13] y fijos 6 días después de la implantación (ppp) (Figura 1A). Fija los embriones fueron dispuestos en vidrio de 96 pocillos placas de fondo para la imagen automatizado (& lt; 5 minutos por placa) (Figura 1B). microscopía de epifluorescencia no pudo detectar células tumorales diseminadas debido a fondo excesivo de la masa del tumor primario. Por lo tanto, usando un microscopio confocal de escaneo láser (CLSM) combinado con una etapa automatizada; múltiples pilas z por embrión fueron capturados para cada pocillo en un procedimiento totalmente automatizado (Figura 1C, 1D y vídeo S1). Confocal de imágenes se convirtieron automáticamente en imágenes compuestas de profundidad extendida (Figura 1E) que se reorganizan a una orientación uniforme (Figura 1 F y G) para permitir un análisis cuantitativo de imágenes automatizado (Figura 1H).
análisis multiparamétrico automatizado de cáncer difusión celular
Después de haber condiciones para la formación de imágenes automatizado y la imagen pre-tratamiento de los tumores de células de embriones implantados ZF establecido; Posteriormente, hemos desarrollado un algoritmo para el análisis automatizado de la carga de focos tumorales en las imágenes post-proceso de ZF. Para ello, se ha desarrollado software basado Image-Pro, que lleva a cabo esencialmente tres funciones principales (véase la sección de materiales y métodos para obtener información detallada sobre la macro 's).
1)
reorientación de las imágenes (Figura 2): todos los embriones fueron reorientadas automáticamente a una orientación horizontal, con la cabeza hacia la derecha y el saco vitelino hacia el fondo.
2)
Determinación de la posición de inyección de las células tumorales marcadas (Figura 3A-C): la posición de inyección se calcula a partir de las imágenes basadas en el canal de GFP segmentado (y confirmados mediante inspección visual usando el canal rojo).
3)
La detección de focos tumorales (Figura 3D y E):. Se segmentó el canal rojo utilizando un umbral de intensidad y mínimos y máximos en la zona de filtros
(A) Imagen de gran profundidad de 6 dpi ZF embrión. Imagen valor de gris de la combinación de los canales verde y rojo (B). (C) Imagen borrosa de color gris después de aplicar el filtro de cierre para optimizar la determinación de contorno. (D) Embrión segmentado después de aplicar el umbral de intensidad y el filtro de área. Punta de flecha indica un objeto rojo fuera del esquema que se excluye de la segmentación. (E) Imagen recortada con objeto sólo seleccionado. (F) Embrión girado por x ° para la reorientación horizontal. (G y H) Determinación del valor de la posición x del centro de masa (
cm) y el centro del centro de gravedad (
cc
). (I) Inversión horizontal de la imagen sólo si
cm
está en el lado izquierdo de
cc
, dando como resultado imágenes con la cabeza del embrión siempre hacia el lado derecho. (J) de imagen después de la aplicación de filtro cerrado con el canal verde y rojo combinado para obtener el contorno del embrión. Punto situado en el 75% la distancia desde el extremo izquierdo de la silueta del embrión se calcula. Eje Y se dibuja en esta posición X del contorno superior al inferior. rectángulo superior 1 se dibuja. (K) Baja rectángulo 2 se dibuja. (L) flip vertical de la imagen sólo si la intensidad del color rojo en el rectángulo 1 es mayor que en el rectángulo 2. (M) Representación esquemática de los cálculos para los pasos E-I. En total, este procedimiento resulta en imágenes en las que la cabeza está a la derecha y el saco vitelino está en la parte inferior de la imagen. Barra de escala = 200 micras de imagen gran profundidad de 6 dpi embrión fijo después de la realineación E e I.
(A). (B) Esquema de embriones de canal GFP segmentado y el eje Y que intersecta el eje X en el 75% de extrema izquierda. (C) punto de inyección Calculado al 75% la distancia desde el extremo izquierdo y el 75% a partir de la primera posición Y. (D) segmentado canal de color rojo con carga focos tumorales en el embrión. (E) focos tumorales identificados. (F) Múltiples parámetros de carga focos tumorales calculan por embrión. Cada número en la imagen corresponde a uno de los focos del tumor. (G) La diseminación tumoral focos en un solo embrión representado como diagrama de dispersión (coordenadas 0,0 en lugar de la inyección calculado). (H) Combinado diagrama de dispersión que muestra la difusión focos tumorales de 39 embriones inyectados. (I) La cuantificación de la distancia acumulada (CD). Cada cuadrado relleno representa la distancia acumulada desde el punto de todos los focos tumorales identificados por inyección en un único embrión. distancia media acumulada (MCD) en los 39 embriones inyectados en este experimento es 15.024 micras. Barra de escala = 200 micras de A.
Los datos fueron exportados a sobresalir y múltiples parámetros numéricos se calcularon para describir la carga de células tumorales por embrión. Estos número total incluido de focos tumorales, distancia media de focos tumorales del sitio de inyección, y la distancia acumulada recorrida desde el lugar de la inyección (Figura 3F). Como sólo el parámetro de distancia número acumulado combinado de células diseminadas con su distancia desde el sitio de la inyección, razonó que este parámetro refleja mejor la capacidad de diseminación tumoral (Figura S1). Los datos se representan como gráficos que muestran las posiciones de tumor focos con respecto al punto de inyección (en las coordenadas x, y = 0,0) para cada embrión (Figura 3G) o todos los embriones de una sola condición experimental (Figura 3H). A partir de estos datos, la distancia acumulada de todos los focos del tumor detectado se calculó por embrión (CD) y, posteriormente, promediados para todas las embriones inyectados en un grupo experimental como un cuantificación final del diseminación de células tumorales (media distancia acumulada (MCD) (Figura 3I y S1) .
Se realizó experimentos para determinar el momento más temprano que permitía la discriminación robusta entre las líneas celulares poco agresivos y altamente agresivos Usando LNCaP y PC3 como un ejemplo para el cáncer de próstata [14] - [19]. no hemos observado diferencia en 2 dpi; MCD de PC3 podía distinguirse de MCD de LnCAP en 4 dpi, y en 6 dpi MCD fue notablemente mayor en PC3 en comparación con LnCAP con significación fuerte (Figura 4) por lo tanto, 6 dpi fue elegido para el análisis en todos. más experimentos.
(a y B) LnCAP (a) o células PC3 (B) y se implantaron los embriones fueron fijados a los 2, 4, 6 o dpi para imágenes (imágenes de inmunofluorescencia y análisis de imágenes automatizado (dispersión parcelas )). imágenes fila inferior (barra de escala = 50 micras) muestran zoom-in del área marcada por la línea de puntos en las primeras imágenes de fila (barra de escala = 100 micras). (C) CD a los 2, 4 y 6 dpi para LnCAP (gris) y embriones PC3-inyectado (negro) calculados a partir de los diagramas de dispersión en A y B, respectivamente. la prueba estadística de la diferencia entre LNCaP y PC3 en diferentes dpi se indica. * P & lt; 0,05, *** p & lt;. 0.001
Para la caracterización de los focos tumorales identificados por este método, se calculó el diámetro medio de los objetos rojos segmentados en la región de la cola de embriones PC3 implantado. El diámetro medio promedio fue de ~ 15 m con algunos objetos más grandes de hasta ~ 45 micras pero no objetos con un diámetro medio & lt; 8 micras ser seleccionado para el análisis, encajando con la identificación de células tumorales individuales o grupos pequeños (Figura 5A). Asimismo, analizaron los focos tumorales identificadas por imágenes de alta resolución, la reconstrucción 3D, y la representación de la superficie (Figura 5B y vídeo S2). Esto confirmó y extendió el hallazgo de que las células tumorales individuales o pequeños grupos fueron identificados por el análisis de imágenes automatizado y mostró células tumorales que interactúan con la vasculatura huésped (Figura 5B). Para descartar artefactos debido a etiquetado CMDiI, inyectamos mCherry etiquetado células PC3. Totalmente de acuerdo con las propiedades de los objetos rojos identificados después de la inyección de PC3 marcado con CMDiI, se observaron células PC3-mCherry individuales en estrecha asociación con los vasos sanguíneos de acogida (Figura 5C y vídeo S3). Finalmente, los experimentos con embriones no implantados (Figura 6A) y la comparación de las células PC3 marcadas con CM-Dil inyectan en embriones que carecen de todos los pigmentos (Figura 6B y C) estándar fli-EGFP o Casper fli-EGFP, descartado falsos positivos debido a la autofluorescencia de células de pigmento.
(A) Cuantificación del diámetro medio de focos de células tumorales-macro identificados a partir de la región de la cola de los embriones PC3-inyectado. Los datos obtenidos a partir de 5 embriones. (B) de alta resolución de imagen de focos de células tumorales PC3 marcado con CM-Dil. (B1) focos de células tumorales PC3-Macro identificado. (B2) Zoom-in en la zona indicada en
B Opiniones 1 muestra células tumorales en asociación con la vasculatura huésped. (B3 y B4) Tres reconstrucción y la superficie tridimensional prestación de área en la inserción de B2; puntas de flecha apuntan a las células tumorales en parte en el interior de recipiente de la anastomosis distal longitudinal (Video S2 y S3). (C) de alta resolución de imagen de PC3-mCherry focos de células tumorales. C1-4, como B1-4 para PC3-mCherry. La barra de escala es de 100 micras de B1 y C1; 50 micras de B2 y C2; 15 micras de B3 y C3; 10 micras de inserciones en C3 B3 y; 5 micras de B4 y C4.
(A-C) En cada caso la parte superior izquierda muestra la imagen de la señal verde (FLI-EGFP) y la imagen superior derecha muestra la señal roja para las células tumorales. imágenes inferiores muestran los zooms de área del recuadro de imagen superior izquierda en la prestación de verde (izquierda) y la señal roja (en el centro) y la luz transmitida (derecha). La barra de escala es de 100 micras de imágenes que muestran embrión conjunto y 50 micras de imágenes ampliadas. (A) del embrión no implantado FLI-EGFP proyectado en 8 días después de la fecundación. Número de embriones no implantados y número de células tumorales (falsamente) detectada por el método de formación de imágenes y análisis de imágenes automatizado se indica a la derecha. (B) FLI-EGFP embrión implantado con PC3 marcado con CM-Dil fotografiado a las 6 dpi. (C) FLI-EGFP Casper embrión implantado con PC3 marcado con CM-Dil fotografiado a las 6 dpi.
En su conjunto, este método elimina la necesidad de una evaluación visual y permite la generación automática y archivo de imágenes y datos numéricos que describen la difusión de células tumorales en un organismo vertebrado. Por otra parte, para las células tumorales identificados por este ensayo bio-imagen automatizada, interacciones tumor-huésped se pueden estudiar más en detalle por microscopía de alta resolución
Validación del ensayo:. Correlación con el comportamiento en modelos de ratón y epitelial frente fenotipo dispersa
para demostrar la aplicabilidad de nuestra plataforma automatizada para diferenciar entre células cancerosas poco agresivos y altamente agresivas, se analizaron tres paneles diferentes de líneas celulares:
1) Opiniones sobre el cáncer de próstata, PC3 (altamente metastásico en modelos de ratón; próstata metástasis de carcinoma /ósea, crecimiento dispersos en cultivo 2D;; andrógeno independiente marcadores mesenquimales) y LNCaP (muy mal metastásico en modelos de ratón, carcinoma de próstata nodo /linfático; la expresión de marcadores de diferenciación de próstata; islas epiteliales en cultivo 2D; marcadores epiteliales) se analizaron [14] - [19].
2) Opiniones sobre el cáncer de mama, BT474 (metastásico en modelos de ratón; mama invasivo carcinoma ductal /conducto; ER + /+ /PR p53mutated; alta expresión de Her2; "epitelial débilmente luminal como" fenotipo en la cultura; la reducción de expresión de células epiteliales marcadores) y MCF7 (muy débil potencial metastásico en ausencia de oncogenes expresados ectópica; adenocarcinoma de mama /efusión pleural; ER + /PR + /p53 normal, bajo Her2; islas epiteliales en cultivo 2D; marcadores epiteliales) se analizaron [20] - [23 ].
3) Opiniones sobre el cáncer colorrectal, SW620 (adenocarcinoma colorrectal Dukes tipo C /metástasis de ganglios linfáticos, el crecimiento dispersos en cultivo 2D; marcadores mesenquimales) y HT29 (adenocarcinoma colorrectal /de colon; islas epiteliales en cultivo 2D; marcadores epiteliales ) se analizaron [24]. Sorprendentemente, para cada tipo de cáncer ensayado, la difusión en este ensayo xenoinjerto ZF correlacionó significativamente con la capacidad metastásica reportado en modelos de ratón y /o características se sabe están asociados con la progresión del cáncer, incluyendo marcadores de diferenciación o epitelial frente fenotipo dispersa (Figura 7A y B; Figura S2 ). Estos datos validan este método bio-imagen automatizada a corto plazo y muestran que representa una poderosa herramienta para predecir la agresividad de las células cancerosas en más complejo, a largo plazo
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sistemas.
( a) representación gráfica de dispersión de difusión de células tumorales de próstata se indica por (
Tarjetas telefónicas gráficos superiores), mama (
medio), y las líneas celulares de cáncer colorrectal (
inferiores
gráficos). Número de embriones inyectados de 2 repeticiones biológica se indica. (B) MCD determinado a partir de datos representados en A. Los datos se presentan como media ± s.e.m. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001. (C) 6 dpi embriones inyectados con PC3 que muestra la carga focos tumorales determinada a partir del canal rojo segmentado (
la izquierda), y representado como diagrama de dispersión (
derecha). (D) la determinación automatizada de la región para la exclusión de los focos tumorales alrededor del sitio de implantación y en la zona de desarrollo intestinal (
la izquierda), y focos tumorales que queda representado como diagrama de dispersión (
derecha). (E) antes de MCD (
negro
) y después de la exclusión (
bares blanco |) para la próstata se indica (
la izquierda), mama (
medio
), y las líneas de cáncer colorrectal (
derecho gráfica
). Doblar la diferencia entre las líneas celulares mal y altamente agresivos se indica. Los datos se presentan como media ± s.e.m. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001. (F) MCD después de la exclusión de PC3 y MCF7 en múltiples experimentos independientes demuestra la reproducibilidad. Los datos se presentan como media ± s.e.m.
Amplia movimiento celular ZF se lleva a cabo en la región del saco vitelino, donde se produce el desarrollo intestinal dentro del marco de tiempo de nuestro análisis [25]. Queríamos excluir cualquier influencia de la migración pasiva de las células tumorales implantados debido a este proceso de desarrollo, cerca de la zona de implantación primaria. Por esta razón, hemos ampliado la macro con un paso adicional en el que se excluyeron todos los focos tumorales dentro de un cuadrado que abarca esta región a partir del análisis de forma automatizada no sesgada (Figura 7C y D). Aunque esto puede llevar a una subestimación del parámetro distancia acumulada, hemos encontrado que este paso exclusión se amplió aún más la ventana entre la no agresiva frente a los tipos de células altamente agresivas (Figura 7E). Por otra parte, el análisis de varios experimentos independientes usando PC3, BT474 y MCF7, demostró que esta metodología es altamente reproducible (Figura 7F).
Hemos ampliado el análisis de un panel más amplio de líneas celulares de cáncer humano de diferentes orígenes, incluidos de próstata, mama, pulmón, colorrectal, de piel, y tejido conectivo. Curiosamente, cuando estas líneas se agrupan de acuerdo a su morfología en la cultura y la expresión de marcadores epiteliales o mesenquimales 2D, había una clara correlación de alta difusión con un fenotipo dispersa (una excepción notable fue HT1299, que no difunda de manera efectiva); todas las líneas de células epiteliales que crecen como islas tenían muy baja capacidad de difusión (Figura 8A; Tabla S1). Hemos probado funcionalmente el papel de un marcador típico del fenotipo epitelial, la célula-célula del receptor de adhesión E-cadherina. Para ello, se utilizó células de carcinoma de mama 4T1 de ratón que poseen un fenotipo intermedio, que crecen como grupos de células poco adheridas en 2D y expresan E-cadherina, así como algunos marcadores mesenquimales como la vimentina (Figura 8B). E-cadherina fue silenciado que resulta en un fenotipo totalmente dispersos en 2D (Figura 8B y C) y se inyectaron estas células en ZF para determinar la capacidad de difusión. De hecho, la orientación shRNA E-cadherina, pero no controlar shRNA fuerte aumento de la difusión de células 4T1 y el método bio-imagen automatizada permitido separación significativa entre 4T1shCdh1 por un lado y 4T1Wt y 4T1shCtr en el otro (Figura 8D-F).
(a) MCD en un panel de líneas celulares de cáncer humano de diferentes orígenes. Número de embriones inyectados se indica.
Las barras blancas indican
líneas de células que muestran un fenotipo dispersos en cultivo celular 2D.
Las barras negras indican
líneas celulares que crecen como islas epiteliales en cultivo 2D.
Grey bares
indican las líneas celulares con características intermedias /mixto epitelial /mesenquimales. células (B) 4T1 de cáncer de mama en crecimiento como islas de células fusiformes poco adheridas (
la izquierda) y el crecimiento completamente dispersa de células 4T1 siguiente silenciamiento E-cadherina (
derecha). (C) E-cadherina expresión en la superficie mediante FACS. la representación gráfica (D) de dispersión de variantes indicadas 4T1. Se muestra el número de embriones inyectados de 2 experimentos independientes. (E) Imágenes representativas de los embriones inyectados con 4T1 indicadas variantes. (F) MCD determinado a partir de los datos representados en D. Los datos se presentan en relación con el tipo salvaje 4T1 como media ± s.e.m. ** P & lt; 0,01. La barra de escala es de 200 micras en E.
modelo bio-imágenes de todo el organismo total, un rendimiento medio a corto plazo totalmente automatizado ha sido desarrollado que distingue con buenos tipos de células cancerosas que crecen reproducibilidad como islas o tener marcadores epiteliales o han demostrado ser poco agresiva en modelos de ratón de las líneas celulares que se encuentran dispersos o tener más characterisitics mesenquimales o son conocidos de metástasis en ratones. Es compatible con RNAi para la identificación de los reguladores de la difusión de células cancerígenas y permite que el cambio de imagen de baja resolución rápida de alta resolución de un análisis detallado para estudiar los efectos en las propiedades de células tumorales o las interacciones célula-huésped tumorales.
Discusión
a continuación, desarrollamos un
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ensayo de xenoinjerto ZF corto plazo que sea compatible con las imágenes automatizado en placas de 96 pocillos y acoplado al análisis de la difusión de células tumorales totalmente automatizado. Este ensayo representa el primer ensayo bioimagen todo organismo automatizado en un vertebrado que permite para el estudio de los aspectos de la progresión del cáncer. Nuestros resultados muestran que este ensayo refleja estrechamente los resultados obtenidos en más caro y ensayos de rendimiento mucho más bajos tales como xenoinjertos de roedores
El modelo de xenoinjerto de ZF se ha aplicado previamente a los estudios de migración cáncer [5] - [9].. Existen limitaciones en este modelo, incluyendo las posibles diferencias en el microambiente de acogida y la necesidad de trabajar a temperaturas que son compatibles con la supervivencia y la migración de células de mamífero, mientras que al mismo tiempo es favorable para la fisiología normal ZF. Sin embargo, hemos modificado las condiciones experimentales tales que el comportamiento de un gran panel de líneas celulares de cáncer humano de diversos orígenes se asemeja estrechamente comportamiento conocido en modelos de roedores. Por otra parte, nuestro trabajo ofrece este modelo con la automatización en la formación de imágenes y análisis de imágenes, así como con la potencia estadística necesaria para su aplicación en los procedimientos de selección.
Ofrecemos la prueba de principio a dicha aplicabilidad probando un conocido regulador de la migración de células de cáncer. El uso de un panel de líneas celulares se muestra que esta plataforma de formación de imágenes puede discriminar entre tipos de células con más características epiteliales o cada vez mayor en islas frente a aquellos con más características mesenquimales o presentan un fenotipo dispersa). a continuación, combinamos el ensayo con ARNi para silenciar la célula-célula molécula de adhesión, E-cadherina. rápidamente obtenemos datos de ~ 90 animales por grupo experimental en dos réplicas biológicas apoyo a la función inhibidora de E-cadherina en la diseminación del cáncer.
En su conjunto, este ensayo el rendimiento medio relativamente rápido puede ser utilizado como un primer
vivo
plataforma de análisis de la tubería en la detección de destino. Se proporciona la automatización y el poder estadístico para identificar aquellos éxitos de gran escala en las iniciativas de detección in vitro ARNi que requieren más tiempo y dinero que consumen los estudios en modelos de ratón. Orientaciones futuras incluirán incorporación del análisis de manera similar automatizado de la inducción de la angiogénesis tumoral y la proliferación de células tumorales para capturar múltiples aspectos de la progresión del cáncer dentro de este ensayo de bio-imágenes.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y manipulación
ZF
Todas las líneas celulares de cáncer humano se obtuvieron de ATCC y se cultivaron de acuerdo con el protocolo proporcionado. ZF y los embriones se plantearon, organizaron y mantenidos de acuerdo con los procedimientos estándar en el cumplimiento de las regulaciones locales de bienestar animal. La línea transgénica ZF Tg (FLI1: EGFP) que expresa EGFP en las células endoteliales en el tipo salvaje o de fondo "Casper", se mantuvo de acuerdo con protocolos estándar (http://ZFIN.org). células PC3-mCherry se generaron utilizando un vector lentiviral pCMV-mCherry-bc-puro-Kl201 (proporcionado por el Dr. R. C. Hoeben, Leiden University Medical Center, Leiden NL). Las células 4T1-shCdh1 y 4T1-shCtr se generaron mediante transducción lentiviral usando TRC shRNA construye (Sigma)
procedimiento de implantación
Las células de mamífero se marcaron con el perseguidor de células fluorescentes lipofílica (CM-Dil;. de excitación máximo 553 nm, lote Nº C7000;. Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La suspensión celular marcada se carga en agujas capilar de vidrio de borosilicato (1 mm D.O. × 0,78 mm I.D .; Harvard Apparatus) y las inyecciones intrayolk se realizaron con una bomba neumática Pico y un manipulador (WPI). Dechorionated 2 días después de la fertilización embriones ZF se anestesiaron con 0,003% tricaína (Sigma) y se colocan en una placa de Petri de 10 cm recubierto con 1% de agarosa. Mediante el control de la presión de inyección y la duración se fijó el número de células inyectadas en ~ 100 por embrión como se determina por el recuento de células estándar de las gotas de inyección. embriones inyectados se mantuvieron en agua de huevo a 34 ° C y se fijaron 6 ppp con paraformaldehído al 4%.
automatizado de microscopía y de imágenes de alta resolución
Fija los embriones fueron dispuestos de forma manual en 96 placas de fondo de vidrio, así (no.655892 material; Greiner) con cada pocillo que contiene un único embrión. Esto se hace fácilmente en & lt; 5 min por placa. La adquisición de imágenes se realizó usando un Nikon Eclipse Ti CLSM, que integra la óptica avanzada, detección de fluorescencia y hardware de exploración en una sola plataforma controlado por software EZ C1. 488 y 561 nm luces láser se utilizan para excitar Tg (FLI1: EGFP) embriones y células tumorales positivas DiI-. (lateral) secciones sagitales en serie fueron capturados 6 dpi de forma automatizada (14 × 30 m) usando un objetivo seco Plan de Apo 4X Nikon con 0,2 NA y 20 WD. Para imágenes en tres dimensiones de 0,5 micras pilas Paso Z (1024 × 1024 planos focales, 50-74 micras de profundidad) fueron adquiridas mediante el uso de 40 × Nikon seco objetivo fluor plan con 0,75 y 0,66 NA WD
software. El análisis de imágenes
automatizado de imágenes pre-procesamiento, análisis automatizado, y la reconstrucción y la superficie representación 3D fueron realizadas por Image-Pro Plus software de base de medios de comunicación cibernética.
Extended profundidad de campo
el software utilizado imágenes en color Z-pila del microscopio confocal. Las imágenes obtenidas fueron grises seudo color de verde a rojo para GFP y CM-marcadas con Dil células tumorales. Una macro fue construida que utiliza dos canales de procesamiento por lotes de todas las imágenes en una carpeta. En primer lugar de la pila Z una sola, que tiene el foco, se hizo imagen compuesta. Se analizaron los píxeles de la Z-pila. Para cada posición, se seleccionó el pixel desde el plano con la varianza más grande o el contraste local. A continuación se utilizó este píxel de la imagen compuesta final.
orientación automatizada de los embriones (Figura 2)
Para el análisis de imágenes, todos los embriones deben tener la misma orientación. Para ello, un macro fue desarrollado en el que se modificaron las imágenes de modo que todos los embriones estaban orientadas horizontalmente, con la cabeza hacia la derecha y el saco vitelino hacia el fondo de la imagen
automatizada alineación horizontal:. El color la imagen se convierte en una imagen un valor de gris para dar una combinación de la GFP y canales rojo. a continuación, el embrión se segmentó utilizando el valor de la intensidad media del histograma y el filtro de mínima y máxima área. A continuación, se determinó un valor de la dirección del objeto segmentado, que se utiliza para dar el embrión una posición horizontal
orientación horizontal automatizado:. Se determinó el valor de la posición X del centro de masa de la GFP combinado gris y canales rojo. Si este valor se encuentra a la izquierda desde el centro del centro de gravedad, la imagen se invierte en horizontal. En todos los casos, esto proporcionó imágenes en las que la cabeza del embrión se orientó hacia la derecha
automatizada orientación vertical:. A partir de las posiciones horizontales exteriores, el punto situado en el eje X en el 75% de la distancia se determinó la extrema izquierda del esquema embrión. En esta posición X del eje Y se extrae de la parte superior a la inferior contornos. Un rectángulo se extrajo de -20 a 20 píxeles horizontalmente desde el punto 75% calculado y verticalmente 80 píxeles por encima de la mitad de la del eje Y superior. Otro rectángulo se dibuja con parámetros horizontales idénticos y verticalmente 80 píxeles por debajo del centro del eje inferior. La intensidad media de fluorescencia en el canal rojo se determinó para ambas rectángulos. Si la intensidad fue mayor en el rectángulo superior en comparación con el rectángulo inferior, la imagen se volteará vertical. El mismo procedimiento se puede realizar utilizando el canal de GFP en el que las imágenes de casos se da la vuelta si la intensidad fue mayor en el rectángulo inferior. La inspección visual demostró que este procedimiento, en todos los casos resultó en imágenes en las que el saco vitelino se orientó a la parte inferior de la imagen.
automatizada cálculo de la posición de inyección de las células Cy3 etiquetados
Primera se determinaron la más a la izquierda y las posiciones más a la derecha de X el contorno del embrión. A partir de estas posiciones X, se determinó un punto situado en el 75% de la extrema izquierda. Entonces, desde esta posición X se determinaron las posiciones Y alto y más bajo. Posteriormente, a partir de estas posiciones Y se determinó un punto situado en el 75% de la posición más alta Y, que fue designada como el punto de inyección arbitraria.