Extracto
Antecedentes
K-RAS mutación plantea un problema particularmente difícil para la terapia del cáncer. La activación de mutaciones en K-RAS son comunes en cánceres de pulmón, páncreas y colon y están asociados con una mala respuesta a la terapia. Como este tipo de terapias dirigidas, que anulan oncogenicidad inducida por K-RAS serían de gran valor.
Métodos
Se realizaron búsquedas de inhibidores de moléculas pequeñas de quinasas que afectan preferentemente el crecimiento de células de cáncer colorrectal que expresan mutante K-RAS. El mecanismo de acción de un inhibidor se exploró el uso de enfoques químicos y genéticos.
Resultados
Se identificaron BAY61-3606 como un inhibidor de la proliferación de células de cáncer colorrectal que expresan formas mutantes de K-RAS, pero no en células que expresan isogénicas de tipo salvaje K-RAS. Además de sus efectos anti-proliferativos en las células mutantes, BAY61-3606 exhibió una propiedad biológica distinta en células de tipo salvaje al conferir sensibilidad a la inhibición de la RAF. En este contexto, BAY61-3606 actuó mediante la inhibición de MAP4K2 (GCK), que normalmente activa NFκβ señalización en las células de tipo salvaje en respuesta a la inhibición de la RAF. Como resultado de la inhibición MAP4K2, las células de tipo salvaje se convirtieron en sensibles a AZ-628, un inhibidor de la RAF, cuando también se trató con BAY61-3606.
Conclusiones
Estos estudios indican que BAY61-3606 ejerce actividades biológicas distintas en diferentes contextos genéticos
Visto:. Lau KS, Zhang T, Kendall KR, Lauffenburger D, Gray NS, Haigis KM (2012) BAY61-3606 afecta a la viabilidad de las células del cáncer de colon en un genotipo Forma -dirigida. PLoS ONE 7 (7): e41343. doi: 10.1371 /journal.pone.0041343
Editor: David J. Reiner, Universidad de Carolina del Norte, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2012; Aceptado: 20 Junio 2012; Publicado: 18 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Lau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (K01-CA118425 y P30-CA006516) y la Sociedad Americana del cáncer (MGO-114877) y una donación del Fondo de Dotación de la familia Merlino. KSL es un Robert Negro miembro de la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GTPasas de la familia RAS actúan como conmutadores binarios que se someten a un cambio conformacional tras la unión a GTP, lo que les permite acoplarse a una serie de efectores de señalización corriente abajo que incluyen RAF, PI3K, y RalGDS [1]. La actividad GTPasa intrínseca de RAS hidroliza GTP a GDP, con la ayuda de la proteína activadora de GTPasa (GAP) cofactores, para inactivar su capacidad de señalización. mutaciones de sentido erróneo en los codones 12, 13, 61, o 146 son comunes en el cáncer y están asociados con la resistencia a la actividad GAP, lo que permite RAS para persistir en el, estado unido a GTP activado. La activación de las mutaciones K-ras se producen en aproximadamente el 15% de todos los cánceres (por lo que es uno de los oncogenes más frecuentemente mutados), pero son más comunes en las formas más letales de cáncer, tales como los que surgen en el tracto biliar, colon, pulmón, y el páncreas [2]. En el cáncer colorrectal, por ejemplo, K-RAS mutado en casi el 40% de los casos [2]. Es importante destacar que los tumores con mutaciones K-RAS son especialmente refractarios a las terapias convencionales y específicos y por lo general se asocian con mal pronóstico [3] - [5].
El principal reto de contrarrestar los efectos oncogénicos de gen K-RAS es la incapacidad de inhibir directamente la proteína mutante. Debido a que las propiedades de señalización de K-RAS se han mejorado a través de la inactivación de su actividad GTPasa, la inhibición farmacológica directa de RAS no es una estrategia terapéutica viable. Una estrategia alternativa para contrarrestar mutante K-RAS es inhibir sus efectores aguas abajo, por ejemplo, vía la RAF-MEK-ERK (MAPK). inhibidores de MEK han recibido atención debido a su mecanismo alostérico de la acción, lo que confiere especificidad extrema, y su eficacia demostrada en melanomas y cánceres de colon que expresan activado B-RAF [6], [7]. inhibidores de MEK un mal desempeño en los cánceres que expresan mutantes K-RAS, sin embargo, tal vez debido a mutaciones secundarias que afectan la respuesta o la existencia de MEK-independiente de señalización corriente abajo de la RAF [8], [9]. Dada la presumptiveness de estos escenarios, es evidente que se necesita una mejor comprensión de cómo la red de señalización K-RAS opera en el cáncer de desarrollar nuevas terapias.
En los últimos años, los enfoques de genómica funcional a gran escala han sido empleada para descubrir objetivos quinasa que cuando son derribados "sintético letal" con RAS mutante. dianas terapéuticas potenciales que se han identificado incluyen TBK1 [10], STK33 [11], CDK4 [12], y Plk1 [13], aunque queda por ver si alguno de ellos representan
de buena fe
dianas terapéuticas para K-RAS mutante cánceres. Mientras que la comprensión de los mecanismos por los cuales las señales de K-RAS a través de estos objetivos es fundamental para el diseño de fármacos eficaces, una menos estudiado, y con frecuencia se pasa por alto, la pregunta es por qué las células de tipo salvaje, que también expresan estos objetivos, tolerar la pérdida de la función de éstos enzimas. Este problema es igualmente importante para el diseño de fármacos debido a la ventaja de las terapias dirigidas (más quimioterapias convencionales) es su selectividad potencial de las células malignas.
En este estudio, hemos caracterizado la actividad de BAY61-3606 en el contexto de cáncer colorrectal, proporcionando información sobre (1) dianas terapéuticas potenciales para los cánceres que expresan mutantes K-RAS y (2) las vías que regulan la respuesta de las células no mutantes a los inhibidores específicos. BAY61-3606 se identificó originalmente como un inhibidor disponible por vía oral, ATP-competitiva de Spleen tirosina quinasa (SYK) [14]. Desde SYK juega un papel activo en la respuesta inflamatoria, BAY61-3606 se ha utilizado principalmente para estudiar la función de las células inmunitarias. Por ejemplo, BAY61-3606 suprime la inflamación de las vías respiratorias inducida por antígeno en ratas y la migración de células B en ratones [14], [15]. Mientras que todos los efectos de BAY61-3606 en las células inmunes están relacionadas con su capacidad para inhibir SYK, se desconoce si tiene BAY61-3606 objetivos alternativos de relevancia biológica en otros contextos celulares. En este estudio, hemos caracterizado dos actividades SYK-independientes asociados con BAY61-3606 en células de cáncer colorrectal.
Métodos
Las líneas celulares, caídas, y los tratamientos con fármacos
Todo líneas celulares de cáncer de colon se mantuvieron en DMEM suplementado con penicilina (100 unidades /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y suero bovino fetal al 10% (FBS). La línea celular de cáncer rectal (Car1) se mantuvo en DMEM /F12 suplementado con penicilina (100 unidades /ml) /estreptomicina (50 mg /ml), y 5% de FBS. Caídas se lograron con pSICOR o pLKO vectores lentivirales [16]. Las secuencias diana para caídas se pueden encontrar en la Tabla S2. En los experimentos de tratamiento de drogas, se sembraron células durante 24 horas antes de la exposición a la droga. AZ-628 se obtuvo de AstraZeneca. CI-1040 se obtuvo de Pfizer. R406 se sintetizó en el laboratorio Gray. BAY61-3606 y IKK VII se compraron de Merck Biosciences. derivados BAY se sintetizaron para este estudio.
Análisis del ciclo celular y ensayos de viabilidad celular
El análisis del ciclo celular se realizó a través de la cuantificación de yoduro de propidio basado en FACS, utilizando métodos estándar. Para medir la viabilidad celular, las células fueron cultivadas en placas de 96 pocillos en presencia o ausencia de fármaco durante 72 horas, se fijaron con paraformaldehído al 4%, y luego se tiñeron con Syto60 (Invitrogen). Las placas se obtuvieron imágenes y se cuantificaron utilizando el sistema de Odyssey LiCor (LiCor).
Bio-Plex ensayos de señalización
El sistema de ensayo Bio-Plex se utilizó para medir la señalización en las células tratadas con fármaco. Brevemente, las células se incubaron en presencia de fármaco para varias cantidades de tiempo y luego se lisaron en tampón de lisis celular Bio-Rad (Bio-Rad). la cuantificación de proteínas se realizó utilizando el ensayo BCA (Pierce) y 5 g de proteína de cada muestra se utilizó para el análisis Bio-Plex. ensayos de fosfo-señalización se realizaron usando kits de ensayo de fosfato de señalización disponibles y se cuantificaron en un sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad): p-Iκβα (Ser32 /Ser36), p-JNK (Thr183 /Tyr185), p-MEK1 ( Ser217 /Ser221), p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), p-p90rsk (Thr359 /Ser363), p-p38 (Thr180 /Tyr182), PC-Jun (Ser63), p-ATF2 (Thr71 ), p-AKT (Ser473), p-S6 (Ser235 /Ser236), p-STAT3 (Ser727), p-STAT3 (Tyr705), y p-GSK3α /β (Ser21 /Ser9). ensayo de Bio-Plex para MEK1 Total también se realizó como control de carga. Todas las señales se normalizaron a una línea celular de control común lisado a fin de que los ensayos entre placas para ser comparables.
ensayos de actividad bioquímica
La actividad bioquímica de BAY61-3606 y derivados se mide de dos maneras . En primer lugar, hemos utilizado la tecnología KINOMEscan ™ de Ambit para identificar aquellas quinasas que son inhibidas por la unión de los compuestos sustrato, todo ensayaron a 1 mM. En segundo lugar, se utilizó Servicio de Bioquímica SelectScreen® quinasa perfiles de Invitrogen para determinar los
in vitro
IC50 para los compuestos contra quinasas específicas.
derivación química de BAY61-3603
Detalles sobre la síntesis de derivados de laurel, y las estructuras de estos derivados, se puede encontrar en la figura S5.
resultados
AZ-628 y el crecimiento BAY61-3606 suprimir en células que expresan K-RAS
G13D
en un esfuerzo por identificar nuevas dianas terapéuticas para el cáncer colorrectal que expresan mutantes K-RAS, se realizó una pantalla para las pequeñas inhibidores de la cinasa de moléculas que afectan a la viabilidad de una manera específica del genotipo. En estos estudios, se utilizó un conjunto de líneas celulares de cáncer de colon isogénicas que difieren sólo en su estado de mutación K-RAS. Las líneas celulares de sus padres, HCT-116 y DLD-1, llevan una mutación activadora heterocigotos en K-RAS (G13D /+). Las líneas celulares derivadas, hke-3 y DKS-8, conservan el alelo de tipo salvaje, pero han perdido el alelo mutante de K-RAS en virtud de la orientación de genes [17]. De acuerdo con nuestro trabajo previo [9], encontramos que las células mutantes K-RAS eran hipersensibles a AZ-628, un inhibidor de pan-RAF [18], [19], en comparación con las células de tipo salvaje, pero insensible a CI-1040 , un inhibidor de MEK [6] (Fig. 1a). También se encontró que BAY61-3606, un inhibidor de la quinasa de tirosina del bazo (SYK), afectó a la viabilidad general de HCT-116 y las células DLD-1 en comparación con hke-3 y células DKS-8 (Fig. 1a, Fig. S1a).
(a) la viabilidad celular se cuantifica por Syto60 después de 72 horas de AZ-628, CI-1040 o el tratamiento BAY61-3606 en HCT-116 (K-RAS
G13D /+, rojo) o hke-3 (K-RAS
- /+, azul) líneas celulares. la viabilidad celular relativa se normalizó con el control tratado con vehículo DMSO para cada línea celular. Las barras de error representan SEM para 3 experimentos independientes. Las células que expresan mutantes K-RAS fueron relativamente sensibles a AZ-628 y BAY61-3606, pero no CI-1040. (B) los perfiles del ciclo celular, tal como se determina por tinción con yoduro de propidio, de células de cáncer colorrectal con B-Raf mutante (HT-29) tratados con CI-1040 o mutante K-RAS (DLD-1) tratados con BAY61-3606. Mientras que la inhibición de MEK induce la detención G1 en las células HT-29, como se evidencia por la pérdida del pico de 4N, BAY61-3606 no parece alterar el perfil de células DLD-1. (C) La viabilidad celular de células de cáncer colorrectal que expresan B-Raf mutante (V600E) después de 72 horas de tratamiento con BAY61-3606 y /o CI-1040. Las células que expresan el mutante B-RAF (HT-29 - línea de trazo continuo y la RKO - contorno de puntos) fueron sensibles tanto a BAY61-3606 y CI-1040 y estos dos inhibidores cooperaron para producir una respuesta mejorada. (D) La fosfo-MEK1 (Ser217 /Ser221) y fosfato ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) los niveles de K-RAS la exposición de tipo salvaje y las células mutantes después de 45 minutos hasta 1 M AZ-628, 1 M BAY61-3606, o control del vehículo. Las señales se midieron usando ensayos de Bio-Plex. relativa de la señal se normalizó a un lisado de control maestro. tratamiento AZ-628 redujo el nivel de fosfo-MEK y ERK-fosfo, pero BAY61-3606 no lo hizo.
Para determinar la viabilidad BAY61-3606 afectada de células que expresan mutantes K-RAS, que analiza el ciclo celular de las células tratadas con el fármaco. Se encontró que BAY61-3606 no alteró el perfil del ciclo celular de las células DLD-1, ni tampoco inducir la apoptosis (Fig. 1b). En contraste con las células de cáncer colorrectal que expresan K-ras, líneas de células mutantes que expresen B-Raf mutante fueron sensibles a la inhibición de MEK y el tratamiento con inducida CI-1040 arresto G1 [6] (Fig. 1b, c). Curiosamente, encontramos que B-RAF células mutantes líneas también fueron sensibles a BAY61-3606 y que CI-1040 y BAY61-3606 cooperado para producir un efecto negativo mayor en la viabilidad de las células que expresan activado B-RAF (Fig. 1c). En conjunto, estas observaciones sugirieron (1) que BAY61-3606 inhibe una proteína que se requiere para la viabilidad general de las células que expresan el mutante K-RAS o B-RAF y (2) que se dirige a BAY61-3606 una vía que es independiente de MAPK canónica /ERK señalización.
Para probar la segunda parte de esta hipótesis directamente, que mide el estado de activación de MEK y ERK en las células que fueron tratadas con BAY61-3606. Se encontró que la inhibición de la RAF con el AZ-628 suprime la fosforilación de MEK y ERK, pero que BAY61-3606 fue incapaz de hacerlo (Fig. 1d). Por lo tanto, mientras que AZ-628 y BAY61-3606 tanto afectan selectivamente la viabilidad de las células mutantes K-RAS, parecen hacerlo a través de distintas vías, con la orientación BAY61-3606 una vía que es independiente de MEK y ERK.
SYK no es el objetivo de BAY61-3606 en células que expresan mutantes K-RAS
Dado que BAY61-3606 se desarrolló originalmente como un inhibidor de la ATP-competitiva de SYK [14], no es sorprendente que, al parecer para apuntar a una vía MEK /ERK-independiente. Sin embargo, las células HCT-116, que son sensibles a BAY61-3606, no expresan niveles detectables de SYK, lo que sugiere que puede que no sea el blanco de BAY61-3606 en este contexto. Para explorar más a fondo, hemos utilizado lentiviral shRNA para derribar SYK en LDN-1 células (Fig. 2A). Desmontables de SYK no afectó la tasa de crecimiento global ni afectó significativamente la respuesta de las células DLD-1 a BAY61-3606 (Fig. 2b). Además, el tratamiento de las células con R406, un inhibidor estructuralmente distinta de SYK, no dio lugar a un efecto preferencial en células que expresan mutantes K-RAS (Fig. 2b). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que SYK no era el objetivo relevante de BAY61-3606 en células de cáncer colorrectal que expresan mutantes K-RAS.
(a) Desmontables de proteína SYK en las células DLD-1 a través de shRNA, como se muestra por el Western Blot. La línea de células Ramos (R), una línea celular hematopoyético con una alta expresión de SYK, se utilizó como control positivo. (B) La viabilidad celular de las células DLD-1 (rojo), y su K-RAS de tipo salvaje (DKS-8 - azul) y SYK desmontables (rojo sombra) de derivados después de 72 horas de tratamiento con 1 M de BAY61-3606 o R406, un inhibidor de la SYK distinta. la viabilidad celular relativa se normalizó con el control tratado con vehículo DMSO para cada línea celular. Las barras de error representan SEM para 3 experimentos independientes. células DLD-1 y sus derivados de tipo salvaje de K-RAS no mostraron sensibilidad a la R406, tiempo, elimine los SYK en las células DLD-1 sólo afectó mínimamente su sensibilidad a BAY61-3606.
BAY61- 3606 fija un pequeño número de quinasas
la hipótesis de que la actividad de BAY61-3606 en las células de cáncer de colon se debió a un efecto "fuera del objetivo" del inhibidor, se sabía aún poco sobre la promiscuidad de este particular, compuesto. Para identificar otros posibles objetivos de BAY61-3606, primero se ensayó la capacidad de BAY61-3606 para inhibir competitivamente la unión de un panel de 402 quinasas sitio activo. Se encontró que 1 M BAY61-3606 inhibió la unión en más de un 90% para sólo 15 quinasas (Fig. 3a, Tabla 1, la Tabla S1), que indica que es un inhibidor altamente selectivo, similar en la selectividad a dos inhibidores de la quinasa clínicos, el imatinib y Gefitinib [20]. Dado que la inhibición del sitio activo de mayo de unión, o no, estar directamente correlacionada con la inhibición de la actividad quinasa, se realizó un análisis secundario en el que se determinó la
in vitro
valores de IC50 para BAY61-3606 contra muchos de estos candidatos objetivos. Este estudio reveló MAP4K2, una quinasa STE-20 de la familia, como la quinasa más sensibles a BAY61-3606, con un
in vitro
CI50 de 11,3 nM (Tabla 1).
(a) imagen TREEspot que representa la actividad inhibidora de BAY61-3606. Quinasas que son inhibidas por la unión de ATP por BAY61-3606 se indican con puntos rojos en el árbol filogenético de las quinasas. El tamaño del punto rojo corresponde a la cantidad de inhibición por 1 M BAY61-3606. La identidad de las quinasas individuales se puede encontrar en la Tabla S1. (B) La viabilidad celular se cuantifica por Syto60 después mediada desmontables shRNA de los objetivos potenciales en BAY61-3606 DKS-8 líneas celulares (azul) DLD-1 (rojo) o. la viabilidad celular relativa se normaliza a las líneas celulares parentales infectados con único vector. Las barras de error representan el SEM para 2 experimentos independientes.
El análisis genético de objetivos potenciales BAY61-3606
durante el seguimiento en nuestro análisis bioquímico de BAY61-3606 actividad, usado lentiviral shRNA para determinar si la precipitación de cualquiera de los objetivos potenciales fue capaz de phenocopy tratamiento con el fármaco (es decir, para afectar selectivamente la viabilidad de K-RAS células mutantes) (Fig. S1c, Tabla S2). Para estos estudios, hemos utilizado los DLD-1 /DKS-8 líneas celulares isogénicas porque habíamos usado este par para el análisis genético de SYK (Fig. 2). Desmontables de solamente uno de los posibles objetivos que ensayadas, HIPK2, fue capaz de afectar selectivamente la viabilidad de células mutantes K-RAS (Fig. 3b). Sin embargo, sólo se pudieron identificar una única secuencia shRNA que produjo la precipitación adecuada de este objetivo. Como resultado de ello, este estudio fue sugestivo, pero no concluyente, de un papel para HIPK2 como un objetivo de BAY61-3606 en células que expresan mutantes K-RAS. Hemos tratado de manera independiente para identificar el blanco de BAY61-3606.
Identificación de derivados biológicamente activos BAY61-3606
Secundario en nuestro análisis genético, que le dio un enfoque químico para estudiar BAY61-3606 . En este estudio, se generaron 30 derivados estructuralmente relacionados de BAY61-3606 y se ensayó su capacidad de afectar selectivamente la viabilidad de células que expresan mutantes K-RAS (Fig. S2). De estos 30 derivados, sólo uno (derivado 6) retenido su selectividad con potencia similar a la del compuesto parental (Fig. 4a, b, Fig. S1b). Otros (por ejemplo, derivado 8) conservaron la selectividad pero pierden potencia. Para hacer frente a la selectividad de BAY derivado de 6 en términos más generales, se evaluó su actividad en un panel de líneas celulares de cáncer colorrectal que eran o mutante de tipo salvaje de K-RAS. De acuerdo con nuestro análisis de pares isogénicas, 4/5 líneas celulares que expresan por mutación gen K-RAS respondió a BAY derivado 6, mientras que 0/3 líneas celulares que expresan de tipo salvaje de K-RAS respondió (Fig. S3).
(a) los valores de GI50 para BAY61-3606 derivados realizadas en HCT-116 (rojo) o células hke-3 (azul). Derivado 6 fue elegido para el estudio adicional para el aumento de su potencia y especificidad para las células mutantes K-RAS. (B) La viabilidad celular se cuantifica por Syto60 después de 72 horas de exposición a BAY derivado 6 en HCT-116 (rojo) o células hke-3 (azul). la viabilidad celular relativa se normalizó con el control tratado con vehículo DMSO para cada línea celular. Las barras de error representan SEM para 3 experimentos independientes. HCT-116 células fueron relativamente sensibles a derivado BAY 6.
Para comparar con BAY61-3606, que analizaron la capacidad de varios derivados para inhibir competitivamente la unión de un gran panel de quinasas sitio activo. Notablemente, cada uno de los derivados que se probaron esencialmente perdido su capacidad de inhibir competitivamente la unión de los 402 quinasas que se analizaron, incluyendo HIPK2 (Fig. S4) sitio activo. En consonancia con esta observación,
in vitro
ensayos de actividad en revelaron una pérdida de actividad de inhibición de la quinasa de los dos derivados prueba (Fig. S5).
BAY61-3606 objetivos MAP4K2 afectar la respuesta de la naturaleza de tipo células a AZ-628
en el análisis de las actividades relativas de AZ-628 y BAY61-3606, hemos probado si estos dos compuestos podrían cooperar para producir un mayor efecto en las células que expresan mutantes K-RAS, similar a el efecto cooperativo visto con CI-1040 y BAY61-3606 en células que expresan B-Raf mutante. AZ-628 y BAY61-3606 no cooperaron en células HCT-116 (Fig. 5a), sin embargo, lo que sugiere que pueden tener como objetivo una vía común. Curiosamente estos dos inhibidores cooperaron para afectar negativamente a la viabilidad de las células que expresan de tipo salvaje de K-RAS. En esencia, hke-3 células que eran resistentes a la formalmente AZ-628 se convirtieron en sensibles cuando también se trataron con BAY61-3606 (Fig. 5a). BAY derivado 6, que conserva su capacidad para suprimir selectivamente la proliferación de las células que expresan mutantes K-RAS (Fig. 4b), perdió su capacidad de cooperar con el AZ-628 en células que expresan de tipo salvaje de K-RAS (Fig. 5b).
(a) la viabilidad celular se cuantifica por Syto60 después de 72 horas de tratamiento combinatorio con concentraciones variables de BAY61-3606 y 1 M AZ-628 en las células HCT-116 (línea roja) o hke-3 (líneas azules). la viabilidad celular relativa se normalizó con el control tratado con vehículo DMSO para cada línea celular. Las barras de error representan SEM para 3 experimentos independientes. Los dos inhibidores cooperan en las células de tipo salvaje, pero no en las células que expresan mutantes K-RAS. (B) La viabilidad celular después de 72 horas de tratamiento combinatorio con concentraciones variables de derivados BAY 6 y 1 M AZ-628 en HCT-116 y células hke-3. derivado BAY 6 no confiere sensibilidad adicional para AZ-628 a hke-3 células. viabilidad (c) de la célula se cuantifica por Syto60 después de 72 horas de tratamiento AZ-628 en HCT-116 o hke-3 líneas celulares, con la eliminación MAP4K2. La pérdida de MAP4K2 no afecta a la respuesta AZ-628 en células que expresan mutantes K-RAS, pero aumenta el efecto de AZ-628 en células que expresan de tipo salvaje K-RAS. viabilidad (d) de la célula después de 72 horas de tratamiento combinatorio con 1 mM y 1 mM BAY61-3606 AZ-628 (sombreado) o 1 M AZ-628 solo (borrar) en hke-3 células con MAP4K2 caída. la viabilidad celular relativa se normalizó a 1 micra AZ-628 muestras tratadas. En las células parentales hke-3, BAY61-3606 confiere sensibilidad a AZ-628. Tras la pérdida de MAP4K2, BAY61-3606 ya no sensibiliza.
Con la excepción de SYK, BAY61-3606 era más de 10 veces más eficaz en la inhibición MAP4K2 que cualquier otra quinasa. Por otra parte, derivado BAY 6 perdió su capacidad de inhibir de forma eficaz la
vitro
actividad de la quinasa en de MAP4K2 (Fig. S5). Sobre la base de estas observaciones, hemos explorado si MAP4K2 juega un papel en la sensibilidad de tipo salvaje y las células mutantes K-RAS a BAY61-3606. células hke-3 y Dks-8 que carecen de MAP4K2 eran hipersensibles a AZ-628, mientras que MAP4K2 knockout tuvo ningún efecto sobre la respuesta de HCT-116 o DLD-1 en las células (Fig. 5c, Fig. S6a). Razonó que si la inhibición de MAP4K2 por BAY61-3606 representó la respuesta alterada de las células de tipo salvaje a AZ-628, células de tipo salvaje entonces K-RAS faltaba MAP4K2 no serían más sensibilizados a AZ-628 mediante el tratamiento con BAY61- 3606. Como se predijo, BAY61-3606 y AZ-628 no afectaron la viabilidad en forma cooperativa hke-3 células que carecen de MAP4K2 (Fig. 5d). Los resultados sugieren fuertemente que BAY61-3606 altera la respuesta de células que expresan de tipo salvaje K-RAS para AZ-628 mediante la inhibición de la actividad quinasa de MAP4K2.
MAP4K2 activa la vía de NFkB para contrarrestar la inhibición del crecimiento dependiente de AZ628
Dado que MAP4K2 es importante para la respuesta de las células de tipo salvaje a AZ-628, la próxima pregunta cómo funciona la MAP4K2 que regulan la respuesta a la inhibición de la RAF. Para identificar la vía responsable de la acción MAP4K2, se utilizó el análisis de fosfo-proteínas Bio-Plex para medir los efectos de la caída MAP4K2 en diversas vías de señalización celular. En total, perfilamos 13 fosfoproteínas: Iκβα (Ser32 /Ser36), JNK (Thr183 /Tyr185), MEK1 (Ser217 /Ser221), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), RSK (Thr359 /Ser363) , p38 (Thr180 /Tyr182), c-Jun (Ser63), ATF2 (Thr71), AKT (Ser473), S6 (Ser235 /Ser236), STAT3 (Ser727), STAT3 (Tyr705), y GSK3α /β (Ser21 /Ser9 ) (Fig. S7). Encontramos dos diferencias entre hke-3 y HCT-116 que planteamos podría estar relacionado con la función de MAP4K2. En primer lugar, se encontró que el nivel basal de fosforilación Iκβα fue significativamente menor en HCT-116 que en hke-3 células, lo que sugiere que la señalización de NFκβ se suprime en las células que expresan activado K-RAS (Fig. S7). Iκβα fosforilación se indujo aún más en hke-3 células después del tratamiento con el AZ-628 y esta inducción era dependiente de MAP4K2 (Fig. 6a). Esta observación es consistente con estudios anteriores que une MAP4K2 a NFκβ señalización [21]. En segundo lugar, se encontró que JNK se activa fuertemente en hke-3 células después del tratamiento con AZ-628 (Fig. S7). Aunque MAP4K2 ha sido previamente vinculado a la señalización de JNK, esta activación no parece requerir MAP4K2 (Fig. S6b).
(a) Evolución temporal de fosfo-Iκβα (Ser32 /Ser36) la activación después de 1 M AZ- 628 en el tratamiento HCT-116 (líneas rojas) o hke-3 (línea azul) con células MAP4K2 derribar, medido a través de Bio-Plex. relativa de la señal se normalizó a un lisado de control maestro. Las barras de error representan SEM para 3 experimentos independientes. señalización NFκβ se mejoró en hke-3 células después de la exposición a AZ-628 y esto dependía de MAP4K2. (B) La viabilidad celular se cuantifica por Syto60 después de 72 horas de tratamiento combinatorio con VII inhibidor de IKK y 1 M AZ-628. la viabilidad celular relativa se normalizó con el control tratado con vehículo DMSO para cada línea celular. Al igual que BAY61-3606, inhibidor de IKK VII aumentó el efecto de AZ-628 específicamente en las células de tipo salvaje de K-RAS. viabilidad (c) de la célula después de 72 horas de tratamiento combinatorio de 1 M VII inhibidor de IKK y 1 M AZ-628 (sombreado) o 1 M AZ-628 solo (borrar) en células HKe3 con MAP4K2 caída. la viabilidad celular relativa se normalizó a 1 micra AZ-628 muestras tratadas. La pérdida de MAP4K2 abrogó la capacidad del inhibidor de IKK VII para sensibilizar hke-3 células a AZ-628.
Desde NFκβ se apareció a la hiper-activa en las células de tipo salvaje de una manera dependiente de MAP4K2, que conjeturado que la inhibición de la vía de NFκβ tendría el mismo efecto que BAY61-3606 o knockdown MAP4K2. Es decir, que esperábamos que la inhibición de NFκβ aumentaría la sensibilidad de las células de tipo salvaje de K-RAS a AZ-628 sin afectar a la sensibilidad de las células mutantes K-RAS. Como se predijo, la inhibición de NFκβ aumentó la sensibilidad de hke-3 y DKS-8 células para AZ-628, phenocopying esencialmente MAP4K2 desmontables (Fig. 6b, Fig. S6c). Por el contrario, la inhibición de JNK no alteró la sensibilidad de hke-3 células a AZ-628 (Fig. S6D). Además, al igual que con el tratamiento BAY61-3606, desmontables de MAP4K2 abolió la capacidad de inhibición NFκβ para sensibilizar a las células de tipo salvaje a AZ-628 (Fig. 6c). A partir de estos datos, se concluye que las funciones MAP4K2 aguas arriba en la vía de NFκβ para regular la respuesta de las células de cáncer colorrectal a la inhibición de la RAF.
Discusión
K-RAS se activa por mutación en aproximadamente el 40% de los cánceres colorrectales [2]. Activado K-RAS se cree que confieren oncogenicidad a través de sus canónicas vías de señalización aguas abajo, por ejemplo, la RAF-MEK-ERK (MAPK) cascada de señalización. En consonancia con esta idea, la activación de mutaciones en B-RAF se producen en el 15% de los cánceres colorrectales y son mutuamente excluyentes con mutaciones K-RAS [22]. Sin embargo, la inhibición de la MAPK señalización, típicamente inhibiendo directamente la MEK, ha sido en gran medida ineficaz en el tratamiento de K-RAS mutante cáncer colorrectal [9], [23]. La falta de eficacia de los inhibidores de MEK en este contexto puede ser debido a la función pleiotrópica de K-RAS, que se ha demostrado para promover la transformación a través de las vías efectoras de PI3K y RAL además de MAPK [24], [25]. Sin embargo, las mutaciones vía PI3K también se producen en los cánceres colorrectales y son a menudo coincidente con mutaciones K-ras, lo que sugiere que PI3K no es un efector común de K-RAS de señalización en el cáncer de colon [26]. Y mientras que las mutaciones de PI3K se han asociado con la resistencia a los inhibidores de MEK en líneas celulares de cáncer [27], [28], K-RAS mutante cánceres de colon de ratones genéticamente modificados son intrínsecamente resistentes a la inhibición de MEK [9]. Nuestros datos son consistentes con una explicación alternativa a la falta de eficacia de los inhibidores de MEK en el cáncer colorrectal que expresan mutantes K-RAS -. Que existe un suplente /vía paralela aguas abajo de B-RAF que media oncogenicidad inducida por K-RAS
en nuestro estudio, hemos caracterizado la actividad de una molécula pequeña, BAY61-3606, que la viabilidad preferentemente afectada en células de cáncer colorrectal que expresan mutantes K-RAS en comparación con las células que expresan sólo isogénicas de tipo salvaje de K-RAS (Fig. 1a, Fig. S1a). Desde BAY61-3606 es un inhibidor de quinasa ATP-competitivo, la capacidad de afectar preferentemente células que expresan mutantes K-RAS inicialmente sugirió que se dirige a una quinasa que funciona aguas abajo de K-RAS para promover la proliferación. Hemos demostrado previamente que el K-RAS promueve la proliferación de células de cáncer de colon a través de una RAF-dependiente, pero MEK-independiente, vía de señalización [9]. Tres piezas de evidencia implican BAY61-3606 como un inhibidor de esta vía MEK-independiente corriente abajo de la RAF. En primer lugar, BAY61-3606 no cooperó con AZ-628 en las células que expresan mutantes K-RAS (Fig. 5a), lo que sugiere que estos inhibidores dirigidos de una vía común. En segundo lugar, BAY61-3606 afectó el crecimiento de las células mutantes KRAS, pero, a diferencia de AZ-628, no afectó el estado de fosforilación de MEK o ERK (Fig. 1d). Finalmente, BAY61-3606 ralentizó el crecimiento de células de cáncer colorrectal que expresan mutante B-RAF y cooperó con un inhibidor de MEK para producir una respuesta mejorada en estas células (Fig. 1c).
Aunque BAY61-3606 se caracterizó inicialmente como un inhibidor de la quinasa competitivos ATP, su selectividad para la disminución de la viabilidad de las células mutantes K-RAS puede no requerir esta actividad. Nuestros estudios de BAY61-3606 derivados demuestran que los que carecen de la capacidad de afectar a la unión todavía se puede mantener su capacidad de afectar selectivamente la viabilidad celular sitio activo. Una posible explicación para esta observación es que el objetivo correspondiente de BAY61-3606 y sus derivados biológicamente activo es una proteína no quinasa. Además de la inhibición de quinasas, análogos de ATP pueden afectar a la biología a través de otros procesos, incluyendo la síntesis de ácidos nucleicos [29], [30] y el transporte motor microtúbulos [31]. Alternativamente, el objetivo relevante no puede ser uno de los 402 quinasas que fueron encuestados en nuestro ensayo o BAY61-3606 y derivados podrían inhibir la actividad de quinasa sin afectar sitio de unión activo. Si es así, no habrían marcar en la pantalla de nuestro
Además de su actividad en las células que expresan mutantes K-RAS o B-RAF, también identificó un efecto biológico secundario de BAY61-3606.; que confiere a las células de tipo salvaje, que normalmente son resistentes a AZ-628, sensibilidad a la inhibición de la RAF (Fig. 5a). Usando una variedad de enfoques, hemos identificado MAP4K2 y como destino de BAY61-3606 en las células de tipo salvaje.