Extracto
El gen del antígeno de cáncer de próstata 3 (
PCA3
) está incrustado en un intrón de un segundo gen
BMCC1
(Bcl2- /E1B de adenovirus diecinueve kDa-proteína de interacción 2 (BNIP-2) y molécula que contiene motivo de homología Cdc42GAP BCH en el carboxilo terminal de la región 1), que también se regula positivamente en el cáncer de próstata. BMCC1 fue anotado inicialmente como dos genes (
C9orf65 /PRUNE
y
BNIPXL
) a ambos lados de PCA3 pero nuestros datos sugieren que representa un único gen que codifica para una proteína de alto peso molecular. Aquí se demuestra por primera vez la expresión de a & gt; 300 kDa proteína BMCC1 (BMCC1-1) en el cáncer de próstata y líneas celulares de melanoma. Esta proteína se encuentra exclusivamente en la fracción microsomal y localizada en vesículas citoplásmicas. También se observó la expresión de la proteína BMCC1 en las secciones de cáncer de próstata utilizando inmunohistología. GST pull down, estudios de inmunoprecipitación y de interacción de proteínas espectrometría de masas identificados varios miembros del adaptador Complejo Relacionado 2 (AP-2) como interactores BMCC1. Consistente con un papel para BMCC1 como una proteína de interacción endosomal AP-2, BMCC1 co-localizada con β-adaptin en la región perinuclear de la célula. BMCC1 también mostró co-localización parcial con la temprana endosoma pequeño GTP-asa Rab-5, así como fuerte co-localización con internalizada pulso-caza transferrina marcada (Tf), proporcionando pruebas de que BMCC1 se localiza en vesículas endocíticas funcionales. BMCC1 caída no afectó a la absorción de Tf y AP-2 desmontables no dispersar BMCC1 distribución vesicular, con exclusión de un papel esencial para BMCC1 en canónica AP-2 captación endocítica mediada. En lugar de ello, postulamos un nuevo papel para BMCC1 en el tráfico de post-endocítica. Este estudio proporciona la caracterización fundamental del complejo BMCC1 en células de cáncer de próstata y por primera vez, implica que en el tráfico de vesículas
Visto:. Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, Kim H, M Buck, et al. (2013) BMCC1 es una proteína AP-2 Asociada Endosomal en células del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10.1371 /journal.pone.0073880
Editor: Gnanasekar Munirathinam, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Febrero 2013; Aceptado: 23 de julio de 2013; Publicado: 6 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Harris et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue financiado por la Fundación de cáncer de próstata de Australia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es un tumor maligno comúnmente diagnosticado y una causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo. Esta condición muestra un amplio espectro de cambios histológicos y comportamientos, que van desde lesiones premalignas, para los cánceres de próstata localizados que siguen un curso indolente a un porcentaje de los cánceres que metastatizan temprana y el progreso rápidamente [1]. Por lo tanto, además de desarrollo de mejores herramientas de diagnóstico y pronóstico, se requiere una comprensión detallada de la biología celular de desarrollo del cáncer de próstata y la progresión. Uno de los más prometedores biomarcadores para el cáncer de próstata es el ARN no codificador de PCA3 [2,3]. Este ARN se identificó como un biomarcador de cáncer de próstata mediante análisis de presentación diferencial de ARN a partir de tejido normal y maligno histológicamente de los mismos pacientes, y fue descrito originalmente como diferencial Display clon 3 (DD3) [2]. Los altos niveles de expresión de PCA3 están fuertemente asociados con la transformación maligna del epitelio de próstata, sin embargo, la base biológica para esta correlación no se ha dilucidado [2-4].
previamente demostrado que
PCA3
está incrustado en el intrón de otro gen,
BMCC1
[5].
BMCC1
fue anotado originalmente como dos genes discretos
c9orf65 /PRUNE gratis (que codifica la región N-terminal) y
BNIPXL gratis (que codifica la región C-terminal). Un
BNIPXL gratis (
BMCC1-4
) marco de lectura abierto fue identificado por la búsqueda de la base de datos homólogos a la Bcl-2 de proteínas que interactúan BNIP-2 [6]. Los autores identificaron
BNIPXL /BMCC1-4
como un gen con una región de alta
BNIP-2
homología, y el nombre de la región homóloga del BCH (BNIP-2 /Cdc42GAP homología) de dominio [ ,,,0],6]. El uso de proteínas BNIPXL exógena expresada etiquetados, demostraron que interactúa con RhoA y su activador proto-Lbc [6]. La coexpresión y de interacción estudios demostraron que BNIPXL une RhoA y proto-Lbc a través de las diferentes regiones y que bloquea la expresión BNIPXL señalización RhoA, al menos parcialmente, mediante la inhibición de la interacción estimuladora RhoA-Lbc [6]. Machida et al. [7] identificado una isoforma más larga de BMCC1 en el neuroblastoma humano (BMCC1-3), que abarcó los exones de codificación 7-19 de la tarde BMCC1-1 identificado. Los altos niveles de expresión de esta transcripción se correlacionaron con un pronóstico más favorable para este tipo de cáncer. La evidencia de la expresión de la longitud BMCC1-1 transcripción completa que abarca el
c9orf65
y
BNIPXL
genes fueron provistos por el Iwama et al. [8], que clonado un ADNc de longitud completa a partir de células HeLa. En este estudio y, posteriormente, las transcripciones BMCC1 se han detectado en regiones restringidas del cerebro de ratón [8,9]. Clarke et al. [5] demostraron que la expresión del ARN BMCC1 es elevada en el cáncer de próstata y metástasis en comparación con tejido benigno, lo que indica que BMCC1 puede estar funcionando de manera diferente en diferentes tipos de cáncer y tipos de tejidos. Una visión general de la expresión de la isoforma BMCC1 y las diversas funciones de dominio BCH que contiene proteínas se proporciona en publicaciones recientes [10,11].
La identificación inicial de una proteína correspondiente a BMCC1-1 fue demostrado por Iwama et al. [8]. Este grupo levantó un anticuerpo específico para la región N-terminal extrema de BMCC1-1, y aunque múltiples bandas se detectaron por transferencia de Western de Hela MR, células HEK293T y glioma KNS81, sólo las bandas de & gt; 250 kDa fueron sensibles a la depleción de siRNA específico. La espectrometría de masas se utilizó para identificar estas bandas de alto peso molecular como BMCC1-1. En el mismo estudio, la expresión de la proteína exógena a partir de un clon de ADNc también produjo múltiples bandas en SDS-PAGE, indicando probablemente la proteólisis sustancial, lo que hace difícil su interpretación. Más recientemente, Li et al. [12] identificado olfaxin proteínas correspondientes a los sitios de inicio de transcripción alternativos BMCC1 expresadas en el bulbo olfatorio, con la banda predominante a 52 kDa. Arama et al. [11] detectó una banda del mismo tamaño en lisados de todo el cerebro y las neuronas y astrocitos en cultivo, que llamaron BMCC1s. En el presente estudio, la expresión y la caracterización inicial de una sola proteína de 340 kDa BMCC1 en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP se describe. La identidad de esta proteína se robustamente establecido por la detección con varios anticuerpos a C- y las regiones N-terminales de la proteína, el agotamiento de siRNA y apoyado por análisis MALDI TOF /TOF. Por primera vez, hemos identificado las interacciones de proteínas endógenas que implican una región fuera del dominio BCH. Se encontró que una región BMCC1 sin dominios funcionales computacionalmente identificables interactúa con el complejo de proteínas adaptador 2 (AP-2). Se demostró además co-localización de BMCC1 con β-adaptin y varios marcadores, incluyendo endosomal Rab5 y transferrina internalizada (Tf). análisis funcionales preliminares sugieren BMCC1 es una interacción de proteínas no canónica AP-2 implicados en el tráfico de post-endocítica.
Materiales y Métodos
Los tejidos y líneas celulares
tejidos de próstata humanos fueron donados por los pacientes en el hospital Royal Brisbane con el consentimiento informado por escrito en virtud de la aprobación ética del Instituto Queensland de Investigación médica comité de ética humana. formularios de consentimiento del paciente se han conservado. tejidos de ratón se obtuvieron de mes a5 de tipo salvaje varón viejo BalbC ratón, en virtud de la aprobación ética del Instituto Queensland de Investigación Médica (QIMR) animales comité de ética. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, ALVA, PC3 y MCF-7 se obtuvieron de la ATCC. A11, D11, D28, D33 y D38 fueron regalos de laboratorio Chris Schmidt (QIMR). Estos se obtuvieron de los pacientes incluidos en los ensayos clínicos en QIMR, con el consentimiento informado por escrito del comité de ética de investigación humana QIMR. Un estudio de microarrays en la líneas celulares A11 y D11 se ha publicado [13], al igual que un estudio clínico en los pacientes de la serie D [14]. Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (Gibco) con penicilina y estreptomicina, suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Gibco).
Extracción de ARN y síntesis de ADNc
ARN total de líneas celulares y los tejidos se purificó utilizando Trizol (Invitrogen) según las instrucciones de los fabricantes. Este ARN se transcribe de forma inversa en ADNc utilizando Superíndice III (Invitrogen) según las instrucciones de los fabricantes.
PCR y la generación de clones de cDNA
clones de ADNc de BMCC1 y otros genes se generaron por amplificación de el objetivo de LNCaP cDNA. Los oligonucleótidos se adquirieron de Sigma Aldrich, amplificaciones de PCR estándar se realizaron wth
Pfu Turbo
(Roche). las condiciones del ciclo típicas fueron 92 ° C 2 minutos, seguido de; 92 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (2 ciclos); 92 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (2 ciclos); 92 ° C durante 30 seg, 53 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (30 ciclos). Todos los q-PCR se realizó a través de Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Australia), Rotorgene-6000 Series Software (Qiagen, Australia) y el kit Quantitect® SYBR Green PCR (Cat. No. 204143, Qiagen, Australia). Las reacciones se prepararon por triplicado y contenían cada 7.5μl de qPCR mezcla maestra, 0.5μl de cada 10μM adelante y cebador y 5μl de ADNc diluida (dilución 1:10) se invierten. condición de ciclo por BMCC1 y ß
cebadores 2M fueron las siguientes: 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C para 20 segundos, 58 ° C durante 20 seg y 72 ° C durante 20 seg. Las condiciones de ciclación para cebadores AP2M1 fueron las siguientes: 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C para 20 segundos, 60 ° C durante 20 seg y 72 ° C durante 20 seg. Los datos fueron generados con el-6000 Rotorgene software de la serie y los niveles de expresión génica relativa se calcularon utilizando la metodología descrita en Pfaffl [15]. Primer secuencias y sitios de restricción se indican en el material complementario (Tabla S1). Todas las enzimas de restricción fueron adquiridos de NEB.
expresión de la proteína recombinante, purificación y
expresión de la proteína recombinante y la purificación y la reticulación de entrecruzamiento se realizaron a lo descrito previamente [16].
Los anticuerpos
recombinante BMCC1-GST proteínas de fusión se expresó y se purificó como se describe anteriormente. Los anticuerpos de conejo Ab-1 y Ab-3 se generaron por inyección de conejos con proteínas de fusión GST eluidas, no desnaturalizadas (mediante el Instituto de Medicina y Veterinaria, Adelaida tasa de dosis estándar, horario y adyuvantes). BMCC1 Ab-2 antisuero se generó mediante la inoculación de un conejo con proteína de fusión GST desnaturalizado incrustado en rodajas de gel de poliacrilamida no fijadas (IMV). BMCC1 antisuero de oveja se ha generado por la inoculación de una oveja con proteína de fusión GST-BMCC1 no desnaturalizado eluido (IMV) (Ab-4). Todas las proteínas tenían etiquetas GST N-terminales cuando se inocula y las secuencias BMCC1 específicos para cada anticuerpo se detallan en la Tabla S1. Los anticuerpos específicos y anticuerpos de control no específicos fueron purificados a partir del suero como se describe [16].
anticuerpos comerciales utilizadas en este proyecto fueron de ratón anti-ADN PKcs (producto Santa Cruz 18-2), ratón anti-ARN polimerasa II (Abcam, ab5408), de conejo anti-β-adaptin (que detecta AP-1B1 y AP-2B1) (Santa Cruz A-5), ratón anti-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610 457), ratón anti-α-tubulina (Sigma T9026) y el ratón anti-GAPDH (Millipore MAB374). Apropiados AlexaFluor burro conjugado con anticuerpos secundarios fueron obtenidos de Invitrogen y HRP conjugado con anticuerpos secundarios eran de Sigma.
plásmido del siRNA transfección
LNCaP se sembraron en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento libre de antibiótico al menos 48 h antes de la transfección. Los plásmidos se transfectaron en LNCaP usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante (2 g de plásmido y 5 l de Lipofectamine 2000 por 9,5 cm
2 también). dúplex de siRNA fueron adquiridos de Invitrogen (secuencias en la Tabla S1) y transfectadas utilizando Lipofectamine RNAiMAX o Lipofectamine 2000 (100 pmol de siRNA dúplex y 5 l de Lipofectamine por 9,5 cm
2 también).
Generación de células y los lisados de tejido
Las células se separan de su sustrato de crecimiento por tripsinización en DMEM libre de suero con 0,025% de tripsina (Gibco), y la tripsina se inactivó mediante la adición de DMEM que contiene 10% de suero. Las células se sedimentaron por centrifugación (500 x g durante 5 min) y se lavaron dos veces en PBS. sedimentos de células lavadas se lisaron entonces en helado de mamíferos Tampón de Lisis Celular (MCLB, 50 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40). Todos los lisados contienen una concentración de 2 x Roche inhibidor de la proteasa libre de EDTA completo. lavado a fondo para eliminar las células tripsina cultura y la adición de una alta concentración de inhibidores de la proteasa son
crítico para detectar BMCC1 no degradado, que está sujeto a una rápida proteolisis. tejido lisados fueron generados por homogeneización en MCLB, moliendo en un tamaño de 22 Kontes de vidrio esmerilado homogeneizador Dounce. Células y tejidos lisados fueron aprobados por centrifugación (17.000 x g durante 20 min a 4 ° C). Brain lisados de tejido se sometieron a procesamiento adicional para eliminar una capa de lípidos flotantes. Cerebrales tejido lisados fueron separados en al Biorad Micro Biospin columnas de cromatografía de desalación, que había sido pre-equilibrada con MCLB, que eliminó el material insoluble pegajosa. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteína Biorad, Lowry con estándares BSA.
Western blotting
Las muestras en tampón de carga de SDS-PAGE Laemelli se sometieron a SDS-PAGE estándar. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa Amersham en tampón de transferencia (6 g base /l de Tris, 3 g /l de glicina, 0,36 g /L de SDS, 20% metanol) para 100 V.h. Las membranas se bloquearon en solución de bloqueo (PBS-0.05% Triton-X100 con 5% de BSA o PBS /0,07% de Tween 20 con 4% de leche desnatada en polvo). Las membranas se probaron utilizando entre 0,2 y 5 ng /l de los anticuerpos indicados en solución a temperatura ambiente de bloqueo para 2 h o 4 ° C durante la noche y se detectó usando anticuerpos conjugados HRP secundaria y reactivo luminol Western relámpago (Pierce).
inmunoprecipitación y GST pulldowns
Los lisados celulares se generaron como se ha descrito anteriormente. Para la inmunoprecipitación, los lisados se incubaron con nula purificada o anticuerpos BMCC1 (0,5-2 g de anticuerpo por mg de lisado) a 4 ° C durante la noche. complejos BMCC1-anticuerpo se precipitó por adición de la proteína G de resina de agarosa durante 2 horas a 4 ° C. Para pulldowns GST, los lisados se incubaron con proteína de fusión GST-BMCC1 resina reticulada a 4 ° C durante la noche. En ambos casos, las proteínas no unidas se lavaron de la resina en 3 x 20 lavados volumen de lecho de tampón de lisis frío. Las proteínas precipitadas se eluyeron por adición de 2 volúmenes de lecho de resina de tampón de carga SDS-PAGE. Las proteínas eluidas fueron analizadas por SDS-PAGE y Western Blot.
Espectrometría de Masas
teñido con plata piezas de gel se destiñeron en tiosulfato de sodio 15 mM de ferricianuro de potasio y 50 mM y se lavaron en agua. Piezas se deshidrataron en 25 mM de bicarbonato de amonio /acetonitrilo al 50% y se seca al vacío. Ellos se redujeron de forma secuencial y se alquiló con 25 mM de DTT y yodoacetamida 55mm, tanto en bicarbonato amónico 25 mM. piezas de gel fueron deshidratadas en 25 mM de bicarbonato de amonio /50% de acetonitrilo y se secaron de nuevo. Posteriormente fueron rehidratados con 20 ng /l de tripsina de grado de secuenciación (Promega) en 40 mM de bicarbonato de amonio /acetonitrilo al 10%, llenos hasta arriba para evitar el secado y se digirieron durante la noche a 37
° C. Los péptidos se extrajeron por lavado de las piezas en 0,1% TFA. péptidos eluidos se desalaron usando C-18 ZipTips (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos se mezclan entonces con la matriz MALDI (Bruker) y se analizaron utilizando Bruker Ultraflex en el modo de ion positivo reflector con una tolerancia de MS /MS de 100 ppm. El análisis se realizó en el local usando la mascota, buscando la base de datos no redundante de mamíferos de 2012, teniendo en cuenta las modificaciones posteriores a la traducción por defecto y hasta un echado de menos tripsina división [17].
Purificación de microsomas
células LNCaP se separaron en fracciones nucleares y citoplasmáticas por douncing en solución hipotónica como se describe anteriormente [16]. Los microsomas fueron purificados de extracto citoplasmático por ultracentrifugación (100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C usando un rotor Beckman SW55Ti). Los microsomas se resuspendieron en tampón de lisis SDS (2% SDS, DTT 1 mM, 125 mM Tris pH 6,8) y borran a 17.000 x g durante 20 min. Citosol se concentró a 1/10 de su volumen original usando una unidad de filtración centrífuga de 10K de corte (Millipore) antes de SDS-PAGE.
inmunohistoquímico tinción
Un procedimiento de tinción inmunohistoquímica estándar fue seguido. secciones embebidas en parafina se cortaron en 4 micras y se montaron en 5-aminopropiltrietoxisilano diapositivas (AAS) recubiertos, que entonces se dejaron secar durante la noche. Las secciones incluidas en parafina fueron desparafinados en xileno y se trataron con calentamiento por microondas a 60 ° C durante 20 min en un tampón de citrato (2,1 g /1000 ml; pH 6,0) para la recuperación de antígeno. Después del bloqueo de la peroxidasa endógena, lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el bloqueo de la unión no específica del anticuerpo secundario con suero de cerdo normal se aplicó inmunotinción estreptavidina-biotina-peroxidasa de rutina con diaminobencidina. Las secciones se incubaron durante la noche en BMCC1 Ab-3. El anticuerpo primario fue sustituido con PBS en las secciones utilizadas como controles negativos. Las secciones se counterstained con hematoxilina de Harris. Desde BMCC1 es conocido por ser positivo en los tejidos prostática benigna, un núcleo de tejido de próstata con hiperplasia benigna se incluyó como control positivo en cada uno de la matriz.
puntuación de la expresión de la proteína BMCC1 dentro de las células de los tejidos de los 74 pacientes estudiados, se basó en la proporción de células teñidas con el anticuerpo policlonal BMCC1 y la intensidad de la mancha dentro de las células. intensidad de la tinción se puntuó en la siguiente escala: Sin manchas, leve, moderada y fuerte. Todas las muestras se analizaron bajo un examen microscópico usando un microscopio Olympus. (Modelo: BX40), con un aumento de x200
Inmunofluorescencia y microscopía
Las células se sembraron en cubreobjetos estériles al menos 24 h antes de fijación. El medio se aspiró y las células se lavaron una vez en PBS antes de la reticulación (en PBS con 10% foramlin durante 10 min a temperatura ambiente). El fijador se retiró y las células se lavó en PBS antes de permeabilización y el bloqueo en PBS con 0,05% de Triton-X100 y 5% de FBS. Las células fueron teñidas con entre 0,4 y 2 ng /l de los anticuerpos primarios indicados a temperatura ambiente durante 2 h o 4 ° C durante la noche. Especies emparejados IgG purificada se empleó como un control adecuado para el anticuerpo de reactividad cruzada /adsorción. Todos los anticuerpos fueron detectados utilizando apropiadas 594 burro anticuerpos secundarios Alexafluor488 o AlexaFluor. La microscopía confocal se llevó a cabo en un Zeiss LSM710. Co-localización se cuantificó usando el software Zen de 2011. coeficiente de solapamiento /coeficiente de solapamiento después de Manders, un método insensible a las diferencias en la intensidad de la señal, se utilizó para cuantificar co-localización en pares de imágenes.
transferrina captación
LNCaP se sembraron en cubreobjetos estériles 24 horas antes el etiquetado. captación de pulso-caza de un complejo transferrina-receptor conjugado (Tf-R) se realizó esencialmente como se describe por Aschenbrenner et al. [18]. Brevemente, las células se privaron de suero en medio libre de suero (libre de rojo fenol DMEM-F12, Life Technologies) durante 2 horas a 37 ° C. A la superficie de las células de la etiqueta con transferrina conjugada, las células se colocaron en hielo durante 30 min y después se incubaron con 20 microgramos /ml Alexafluor-594 transferrina conjugada (Molecular Probes) diluido en suero enfriado en hielo medios libres de 30 min. Las células se lavaron dos veces con medio libre de suero enfriado en hielo para eliminar la transferrina no unido y t = 0 cubreobjetos fueron cosechadas para BMCC1 inmunofluorescencia, como se describe. Los cubreobjetos restantes fueron perseguidos en el suero pre-calentado medio libre para los períodos de tiempo indicados antes de la cosecha. La captación de complejos de transferrina-receptor del conjugado también se lleva a cabo utilizando un método similar al Boucrot et al. [19]. Las células se enjuagaron una vez con DMEM-F12 /5% FCS a continuación, se incubaron durante 10 min con 10μM Alexafluor-594 transferrina conjugada en DMEM-F12 /5% FCS. Las células fueron lavadas con PBS frío antes de ser cosechadas para inmunofluorescencia.
Resultados
BMCC1-1 proteína se expresa en algunos tipos de cáncer
hBMCC1
es una unidad transcripcional grande y complejo, con el biomarcador del cáncer de próstata se utiliza rutinariamente
hPCA3
incrustado en
BMCC1
intrón 6.
BMCC1
se ha anotado anteriormente como discretos
PRUNE2 Opiniones y
BNIP
genes que flanquean
PCA3
, con estudios basados expresión exógena que reflejan esto. Los resultados recientes han demostrado que
BMCC1
produce una transcripción (denotado BMCC1-1) que se extiende a través de la antisentido incrustado
PCA3
gen [5,8]. Aquí se demuestra que el ARN BMCC1-1 se expresa en muestras de tejido de cáncer de próstata positiva 10/10 PCA3 (Figura S1).
Hemos demostrado anteriormente que la línea celular de cáncer de próstata LNCaP expresa altos niveles tanto de BMCC1- 1 y de PCA3 ARN [5]. Para extender estos estudios a la proteína endógena BMCC1, hemos generado varios anticuerpos policlonales usando fragmentos expresados de forma recombinante de BMCC1 como antígenos (esquema de la Figura S2, la clonación de cebadores en la Tabla S1). Se emplearon Estos anticuerpos para demostrar que
BMCC1
produce a & gt; 300 kDa proteína en LNCaP (Figura 1). El tamaño de esta proteína corresponde a la predicha a partir de los cds BMCC1-1 y traducidos secuencia peptídica (
es decir
3088 aminoácidos, ~ 340 kDa). La proteína de 340 kDa se detectó con BMCC1 tanto C-terminal Ab-1 (obtenido contra de aminoácidos 2345-2705) y N-terminal Ab-3 (obtenido contra de aminoácidos 1 a 369) en las células LNCaP. La expresión de esta proteína no se detectó en el PCA3 próstata negativo líneas celulares de cáncer PC3, DU145, ALVA, RWPE-I (Figura 1A). expresión BMCC1 también estuvo ausente de la línea celular de cáncer de mama MCF7 PCA3 negativo. BMCC1 no se detectó en las células normales como hemos [5] se informó anteriormente. La identidad de la banda de 340 kDa se confirmó por inmunoprecipitación de BMCC1 de LNCaP usando extractos de Ab-3, seguido por la detección de transferencia de Western con Ab-2 (obtenido contra aminoácidos 222 a 276) (Figura 1B). La especificidad de la detección BMCC1 se confirmó además por la depleción transitoria de expresión BMCC1 de siRNA y detección con múltiples anticuerpos. BMCC1 siRNA transfección causó una reducción dramática en la intensidad de la banda de proteína 340 kDa detectada por tanto C- y N-terminal anticuerpos Ab-1 y Ab-3 (Figura 1C). Esto es compatible con los datos de inmunoprecipitación para demostrar firmeza que
BMCC1
es una proteína del gen de codificación, la producción de una proteína de 340 kDa en la línea celular LNCaP que expresan el PCA3. No se detectó expresión de siRNA sensibles bandas reactivas anti-BMCC1 a pesos moleculares más bajos, lo que indica que la proteína BMCC1-1 es el producto del gen predominante en células de cáncer de próstata (datos no mostrados). expresión de la proteína BMCC1 no se detectó en varias líneas celulares derivadas de neuroblastoma, carcinoma de mama y de ovario (datos no mostrados). se detectó proteína BMCC1 en 3/5 líneas celulares de melanoma primario, y en algunos casos se observó un doblete (Figura S3). La identidad de las bandas en líneas celulares de melanoma se demostró con firmeza por la detección de BMCC1 con anticuerpos frente a diferentes regiones de la proteína, Ab-1 y Ab-3. Esto indica que BMCC1 podría tener un papel en otros tipos de tumores.
A. BMCC1 inmunotransferencia de extractos de células totales. 30 g de lisado por línea celular se sometió a 5% de SDS-PAGE. expresión BMCC1 se detectó usando un anticuerpos de conejo generados contra aa 2345-2705 (C-terminal, de conejo anti BMCC1, Ab-1) y un segundo anticuerpo, Ab-3 que reconoce el extremo N-terminal de BMCC1. ADN PKcs se utilizó como control de carga.
B. La inmunoprecipitación de BMCC1 del total de lisado de LNCaP. BMCC1 se inmunoprecipitó por incubación de 1 mg de lisado de LNCaP con 1 g de Ab-3 de 8 horas a 4 ° C seguido por la precipitación con proteína G agarosa. No específica (NS) IgG se utilizó en lugar de Ab-3 en un IP control. resina lavada se eluyó en colorante de carga SDS-PAGE y transferencia Western. La cadena pesada de IgG (carga) demuestra entrada igual anticuerpo.
C. El agotamiento de expresión BMCC1 por siRNA. células LNCaP fueron transfectadas con siRNA BMCC1 1730 (siBMCC1) o control siRNA (siCONTROL). lisado total se cosechó 3 días después de la transfección y expresión BMCC1 analizaron por transferencia Western con BMCC1 Ab-1 (C-terminal) y Ab-3 (N-terminal). La transferencia se desnudó completamente entre las sondas secuenciales. ARN polimerasa II es un control de carga.
Machida et al. [7] y Li et al. [12] utiliza
in situ
hibridación de embriones de ratón para mostrar que BMCC1 RNA se expresa predominantemente en el tejido neuronal, y Zhou et al. [20] utilizó PCR de ARN de tejido de ratón para demostrar que al menos el dominio BCH se expresa en una gama de tipos de tejidos. Iwama et al. [8] se utiliza cebadores de PCR que abarca todo el gen de demostrar una fuerte expresión en el ganglio de la raíz dorsal con la expresión intermedio en todo el cerebro, la médula espinal, próstata y útero y baja expresión en otros tejidos. Para hacer frente a esta discrepancia de constitutivo frente a la expresión del ARN restringido, y para obtener información adicional acerca de la expresión de proteínas y productos génicos empalmados putativo, que immunoblotted lisados de proteínas a partir de un panel de tejidos adultos de ratón utilizando BMCC1 Ab-4. En este contexto no carcinogénico que hemos detectado una fuerte ~ 80 kDa banda en los tejidos cerebrales, con una menor expresión de una banda más pequeña de 72 kDa (Figura S4). El 52kDa BMCC1s identificado por Arama et al. [11] no se observó aquí porque el antígeno para Ab-4 abarca los aminoácidos 2192 a 2433 de BMCC1-1 y no contiene ninguna parte de BMCC1s (ver Figura S2). Para confirmar la expresión de BMCC1 en un entorno tumor de cáncer de próstata, tinción inmunohistoquímico de los tejidos de cáncer de próstata se realizó utilizando Ab-3. Minimal tinción BMCC1 se observó en la hiperplasia benigna de la próstata epitelio glandular y estroma, con fuerte tinción observada en el epitelio glandular de los tumores de próstata (Figura S5).
BMCC1 interactúa con AP-2 en células de cáncer de próstata
con el fin de profundizar en la función celular de BMCC1, que interactúan las proteínas se identificaron mediante purificación con resinas de afinidad BMCC1-GST. Hemos generado una serie de superposición de clones BMCC1-GST en pGEX que cubren el ADNc de longitud completa (Tabla S1). Las proteínas recombinantes se expresaron y se reticula a glutatión agarosa para generar una serie de matrices de afinidad para las proteínas que interactúan. resinas de fusión GST-BMCC1 reticulados se incubaron con lisado de LNCaP total de purificar interactores BMCC1. proteínas asociadas resina se eluyeron, resuelven y se visualizaron mediante teñido con plata de SDS-PAGE. BMCC1 GST fragmentos 1-2 y 4-10 se bajó una gama de proteínas identificadas con frecuencia como interactores no específicos o no funcionales. Estos incluyen eEF1γ, proteína ribosómica 40S, GRP75 y GRP78 (datos no mostrados). BMCC1 GST F3 (aminoácidos 575-904) precipitó bandas específicas a 50 kDa y 110 kDa (Figura 2A). El 50 kDa y 110 kDa bandas que interactúan se escindieron y se identifican por espectrometría de masas (MALDI MS /MS en un espectrómetro Bruker Ultraflex III). Un resumen de los datos de búsqueda de la mascota se muestra en la Tabla S2. Esto reveló que BMCC1-F3 interactúa con varios miembros del adaptador de proteínas relacionadas Complejo 2 (AP-2). El complejo AP-2 es un heterotetrámero asociado endosoma que consta de tres componentes diferentes constitutivos (AP-2S1, AP-2M1 y AP-2B1 /β-adaptin) y uno de los dos componentes mutuamente exclusivos (AP-2A1 o AP-2A2) [ ,,,0],21]. La interacción de proteínas 50 kDa BMCC1-F3 fue identificado como AP-2M1, basado en dos identificaciones independientes con un total de 8 péptidos no redundantes (Tabla S2). La banda de 110 kDa interactuar BMCC1 contenía una mezcla de tres de alto peso molecular AP-2 miembros del complejo: AP-2A1, 2A2-AP, y AP-2B1 (Tabla S2). AP-2B1 se identificó en dos muestras, con un total de 5 péptidos únicos. La homología entre la AP-2A1 y 2A2 hace AP-individuo único complejo de identificaciones (Figura S6). AP-2A1 se identificó en 3 muestras con un total de 6 péptidos que no corresponden a AP-2A2. AP-2A2 fue identificado en una muestra con un péptido no atribuible a la AP-2A1. En estas muestras, tres péptidos individuales podrían haber correspondido a cualquiera AP-2A1 o 2A2-AP y no pueden ser atribuidos con certeza a una o la otra debido a la identidad de la secuencia (Tabla S3). Sin computacionalmente dominios identificables pueden ser atribuidas a esta región, por lo que la interacción de mapeo funcional de BMCC1 ha identificado un nuevo motivo de interacción proteína-proteína. La interacción entre BMCC1 y el complejo AP-2 se confirmó por co-inmunoprecipitación. BMCC1 se inmunoprecipitó a partir de lisados de LNCaP y las proteínas que interactúan resultantes se eluyó y se analizó por transferencia Western (Figura 2B) que revela que endógeno BMCC1 interactúa con β-adaptin y AP-2A1 /2 (Figura 2B). La interacción entre endógena BMCC1 y el complejo AP-2 se fundamenta en BMCC1 inmunoprecipitación de lisados de células que habían sido BMCC1 agota con siRNA. Una banda de 340 kDa se detectó en el peso molecular de alta resolución de gel teñido con Coomassie (Figura 2C). Esta banda era de intensidad reducida en el inmunoprecipitado de BMCC1 agota las células en comparación con las células de control de siRNA. Aunque inmunoprecipitación no es un enfoque cuantitativo, esta reducción de la intensidad guiada selección de banda para su posterior análisis por MS. La identificación de esta banda como BMCC1 se confirmó por MALDI-TOF /TOF de péptidos trípticos de la porción de gel escindido. Es importante destacar que, el extremo péptido BMCC1 N-terminal TEFNYFTETR, no está presente en la isoforma truncada (BMCC1-3) informado por Machida et al. [7] fue identificado entre éstos (Tabla S4). Esto proporcionó
de novo
evidencia de expresión de la proteína en las células LNCaP BMCC1-1. El perfil de interacciones de BMCC1 fue examinado por Western Blot para estos inmunoprecipitados AP-2A1 /2 y β-adaptin. señales de acuerdo con el nivel reducido de proteína BMCC1 en el immunoprecipate siBMCC1, reducidos para AP-2A1 /2 y β-adaptin se detectaron en el precipitado de siBMCC1 lisado de lisado de control. Esto proporciona evidencia adicional de que estas proteínas interactúan específicamente con BMCC1 (Figura 2C).