Extracto
Antecedentes
sobre- expresión de Aurora quinasas promueve la tumorigénesis de las células. El objetivo de este estudio fue determinar el perfil preclínico de un nuevo inhibidor de quinasa pan-Aurora, BPR1K653, como candidato para la terapia contra el cáncer. Dado que la expresión de la bomba de eflujo de fármaco, MDR1, reduce la eficacia de diversos compuestos quimioterapéuticos en los cánceres humanos, este estudio también dirigido a determinar si la potencia de BPR1K653 podría verse afectada por la expresión de MDR1 en las células cancerosas.
principales conclusiones
BPR1K653 inhibe específicamente la actividad de Aurora-a y Aurora-B quinasa a bajas concentraciones de nano-molar
in vitro
. La actividad anti-proliferativa de BPR1K653 se evaluó en diferentes líneas celulares de cáncer humano. Los resultados del ensayo clonogénico mostraron que BPR1K653 fue potente en la selección de una variedad de líneas celulares de cáncer independientemente del origen del tejido, el estado de p53, o la expresión de MDR1. A nivel celular, BPR1K653 inducida endo-replicación y posterior apoptosis tanto en células de cáncer de MDR1-negativos y MDR1-positivos. Es importante destacar que, mostró una potente actividad contra el crecimiento de tumores de xenoinjertos del carcinoma cervical humano KB y células KB-VIN10 MDR1-positivas derivadas de KB en ratones desnudos. Finalmente, BPR1K653 también exhibió propiedades farmacocinéticas favorables en ratas.
Conclusiones y Importancia
BPR1K653 es un nuevo compuesto anti-cáncer potente, y su potencia no se ve afectada por la expresión de la resistencia a múltiples fármacos proteínas, MDR1, en las células cancerosas. Por lo tanto, BPR1K653 es un compuesto anti-cáncer prometedor que tiene potencial para el tratamiento de diversos tumores malignos, particularmente para pacientes con resistencia a los medicamentos relacionados con MDR1-después de los tratamientos quimioterapéuticos prolongados
Visto:. Cheung CHA, Lin WH, Hsu JT -A, horas TC, Yeh los conocimientos tradicionales, Ko S, et al. (2011) BPR1K653, una novela de Aurora quinasa Inhibidor, muestra una potente actividad antiproliferativa en MDR1 (P-gp170) mediada por las células del cáncer resistente a múltiples fármacos. PLoS ONE 6 (8): e23485. doi: 10.1371 /journal.pone.0023485
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2011; Aceptado: 18 Julio 2011; Publicado: 24 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Cheung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia (NSC99-2323-B-400-006, NSC99-2323-B-400-007, NSC99-2120-M-006-005), Departamento de Salud (DOH99-TD-C -111 a 004), y los Institutos nacionales de Investigación en Salud (CA-099-PP-02), Taiwán ROC Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mitosis es un paso clave en el ciclo celular que está estrechamente regulada por muchas proteínas. La expresión anormal o la activación de estas proteínas reguladoras podrían resultar en mitosis aberrante, lo que lleva al desarrollo de cánceres [1], [2]. A nivel molecular, las quinasas Aurora (Aurora-A, Aurora-B y Aurora-C) son serina /treonina quinasas que funcionan como reguladores clave de la mitosis. En condiciones fisiológicas normales, que son esenciales para el ensamblaje del huso, la maduración del centrosoma, la segregación cromosómica y citocinesis [3], [4]. En condiciones patológicas, se ha demostrado que Aurora quinasas están sobre-expresado en diversos cánceres humanos y también desempeñado un papel importante en el proceso de tumorigénesis [5], [6], [7], [8]. Por ejemplo, Aurora-A quinasa se sobre-expresa en adenocarcinomas gastrointestinales superiores [6]. Además, una correlación entre los niveles de expresión de Aurora-A y la progresión del tumor se ha demostrado en pacientes con carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas [9]. Por otra parte, Aurora-B quinasa es con frecuencia sobre-expresa en gliomas de NSCLC y malignos primarios, en particular los glioblastomas [10], [11]. Desde la sobre expresión de Aurora-A y Aurora-B se asocia con frecuencia con la tumorigénesis, estas moléculas han sido objeto de la terapia del cáncer. El primer inhibidor de quinasa Aurora pan-prueba-de-concepto, VX-680 (MK-0457, Tozasertib), fue desarrollado en 2004 por Vertex Pharmaceuticals (en colaboración con Merck) con el objetivo de dirigirse a las células cancerosas. Este inhibidor específico se ha mostrado eficaz en la orientación de las células cancerosas tanto
e in vitro
in vivo
, y ha recibido la aprobación de la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) para entrar en ensayos clínicos [12 ], [13], [14]. Desde entonces, los esfuerzos continuos han sido realizados por diferentes compañías farmacéuticas en busca de posibles inhibidores de quinasa Aurora que presentan mejor perfil terapéutico y especificidad como en comparación con el primer inhibidor de la producción, VX680 [15], [16], [17], [18] , [19], [20], [21], [22], [23].
a pesar de los primeros éxitos del desarrollo de varios inhibidores de la quinasa Aurora, estudios recientes revelan que la eficacia de muchos de éstos desarrollaron y los inhibidores probados clínicamente, incluyendo VX680, PHA-739358 y AZD1152, pueden ser afectados por la expresión de la proteína de resistencia a múltiples fármacos MDR1 (P-gp170) en las células del cáncer [24], [25]. De hecho, la sobre expresión de MDR1 también interfiere con una amplia gama de diferentes agentes quimioterapéuticos [2], [26], [27], [28], [29]. Para ejemplos, la expresión de la bomba de eflujo de fármaco-membrana trans, MDR1, reduce la sensibilidad de las células cancerosas a paclitaxel, vincristina (agentes anti-microtúbulos), doxorrubicina (agente de intercalación de ADN), mitoxantrona, VP-16 (inhibidores de la topoisomerasa II) y imatinib (inhibidor de la tirosina quinasa) [28], [30], [31], [32], [33], [34]. Por lo tanto, ha habido un gran interés en la identificación de nuevos compuestos contra el cáncer que puedan superar la resistencia relacionada MDR1 y también muestran mejores perfiles farmacológicos.
En este estudio, se ha desarrollado un nuevo pan-Aurora inhibidor de la quinasa titulado BPR1K653 y se evaluó su potencia contra diversas MDR1-negativas y MDR1-positivas las células cancerosas. Los resultados del presente estudio muestran que a diferencia de los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente, BPR1K653 es eficaz para atacar a las células cancerosas tanto MDR1-negativas y positivas a
in vitro
y
in vivo
. Por otra parte, BPR1K653 exhibe propiedades farmacocinéticas favorables
in vivo
.
Resultados
BPR1K653 es un potente y selectivo inhibidor de pan-Aurora quinasa
En vitro
ensayo de inhibición de quinasa reveló que BPR1K653 (Figura 1A) inhibió la actividad de Aurora-A y -B quinasa con una CI
50 valor de 124 nM y 45 nM, respectivamente (Figura 1B y Tabla 1). Después se evaluó la selectividad de BPR1K653 contra diferentes quinasas. BPR1K653 exhibió menos potencia (es decir, IC
50 & gt; 10 M) en la inhibición de la actividad de ALK, CHK1, cMet, EGFR, FLT3, VEGFR1 y VEGFR2 en comparación con Aurora-A y Aurora-B quinasa (Tabla 1). También se examinó la actividad celular de BPR1K653. La activación de Aurora-A quinasa requiere una auto-fosforilación en el residuo de Thr288, mientras que la fosforilación del residuo Thr232 es un mecanismo esencial regulador de Aurora-B activación [35], [36]. Aquí, el análisis de transferencia Western reveló que la cantidad de fósforo-Aurora-A, -B y -C quinasa presente en las células cancerosas HCT116 tratados con una Aurora pan-inhibidor de la quinasa, VX680 (control positivo), se redujo de una manera dependiente de la concentración (Figura 1C). Reducción de fósforo-histona H3 (Ser10), un sustrato directo de Aurora-B quinasa, se utiliza ampliamente como un indicador de inhibición de la quinasa Aurora en las células. Aquí, VX680 también reduce la cantidad de fósforo-histona H3 (Ser10) presente en las células como esperar (Figura 1C). De acuerdo con estos hallazgos, BPR1K653 indujo una disminución dependiente de la concentración en fósforo-Aurora-A, -B y -C quinasa en células HCT116. células HCT116 tratados con BPR1K653 también mostraron una disminución dependiente de la concentración en fósforo-histona H3 (Figura 1C).
(A) Estructura química del compuesto anti-cáncer BPR1K653. (B) BPR1K653 inhibió la actividad tanto de Aurora-A y Aurora-B quinasa según lo revelado por el
in vitro
ensayo de inhibición de quinasa in. las células cancerosas HCT116 (C) se trataron con diversas concentraciones de BPR1K653 y el pan-Aurora VX680 inhibidor de quinasa disponible en el mercado, y la expresión de varias proteínas se analizaron por transferencia Western. Tubulina se utilizó como control interno.
BPR1K653 inhibe la proliferación de varias líneas celulares de cáncer humano, independientemente de sus orígenes tisulares y estado de p53
Para determinar si podría inhibir BPR1K653 la proliferación de células, un panel de 11 líneas celulares de cáncer diferentes se trató con BPR1K653. Para la comparación, las células se trataron también con dos inhibidores de la quinasa Aurora bien caracterizados, VX680, y PHA739358. Se ha demostrado que la pérdida de función de p53 induce resistencia a múltiples fármacos en algunos tipos de cáncer [37]. Aquí, los resultados del ensayo clonogénico revelaron que BPR1K653 fue eficaz (es decir, IC
50 & lt; 0,5 M) frente a diversos tipos de células cancerosas, incluyendo de pulmón (A549), oral (Hone-1 y OECM-1) cervical (KB) , de colon (HT29), vejiga (NTUB1) y la leucemia /linfoma (MV4-11 y IM9), independientemente de su estado de p53 (Tabla 2). Por otra parte, la potencia de BPR1K653 ha demostrado ser superior a la de VX680 y PHA739358 en la mayoría de las líneas celulares de cáncer analizadas (Tabla 2). El IC
50 valores de VX680 y PHA739358 en varias líneas celulares de cáncer (excepto en las células OECM-1) fueron 2-10 pliegues superiores a las de BPR1K653. El IC
50 años de VX680 y BPR1K653 eran iguales en las células OECM-1. En conjunto, nuestros resultados demostraron que BPR1K653 es capaz de inhibir la proliferación de varios tipos de células de cáncer independientemente de su origen de tejido y el estado de p53.
BPR1K653 es igualmente potente en la inhibición del crecimiento de la múltiple proteína de resistencia a las drogas (MDR1) que expresan las células cancerosas
ha sido ampliamente demostrado que la sobre-expresión de MDR1 (P-gp, bomba de eflujo de fármaco) induce resistencia a los medicamentos a varios agentes quimioterapéuticos. Para determinar si la potencia de BPR1K653 se suprime por expresión de MDR1 en las células cancerosas, líneas celulares resistentes a múltiples fármacos tres MDR1 cáncer que expresa, KB-VIN10, KB-S15 y NTU0.017 [2], [38], [39], [ ,,,0],40], fueron tratados con BPR1K653. Como se muestra en la Tabla 3, la IC
50 valor de BPR1K653 a KB-VIN10 y KB-S15 fue similar a las de las células KB MDR1-negativas de los padres. El IC
50 de BPR1K653 a KB-VIN10, KB-S15 y KB fueron 14 nM, 11 nM y 12 nM, respectivamente. Además, el IC
50 valor de BPR1K653 a las células que expresan MDR1 NTU0.017 también fue similar a la de las células NTUB1 MDR1-negativo parentales (tabla 3). Estudios previos revelaron que los inhibidores de la quinasa Aurora, VX680 y PHA739358, son sustratos de MDR1 [24], [25]. Consistentemente, todas nuestras líneas celulares de cáncer de MDR1 que expresan probados mostraron resistencia cruzada a VX680 y PHA739358 (Tabla 3). Además, el nivel de expresión de MDR1 correlacionada con el nivel de resistencia VX680 /PHA-739358 en las células cancerosas KB-S15 (Figura 2) KB-VIN10 y. A fin de determinar si la potencia de VX680 y PHA739358 en KB-VIN10, KB-S15 y NTU0.017 células fueron realmente afectada por la expresión de MDR1, las células fueron co-tratadas con el modulador de MDR1 (regulador negativo), verapamil, y la célula se determinó la viabilidad. Aquí, se demostró que el tratamiento verapamil (10 M) para ser capaz de restaurar /mejorar la sensibilidad tanto a VX680 y PHA739358 en todas las células cancerosas que expresan MDR1 ensayados (Tabla 3). Sin embargo, el tratamiento verapamil no podría aumentar aún más la sensibilidad a BPR1K653 tanto en las células de cáncer de MDR-negativos y MDR1-expresión (datos no mostrados). Por otro lado, se ha demostrado que un derivado KB línea de VP-16 resistente de células de cáncer, KB-7D, la sobre-expresa otro tipo de la proteína de eflujo de múltiples fármacos dependiente de ATP, MPR1 [41]. Curiosamente, el IC
50 valor de BPR1K653 a KB-7D también fue similar a la de las células KB MRP1-negativo parentales (tabla 3).
mRNA total se extrajo de las células, y RT-PCR se realizó para detectar la expresión de MDR1 en las células KB, KB-VIN10 y KB-S15. GAPDH se utilizó como control interno.
BPR1K653 induce endo-replicación en tanto las células cancerosas MDR1-negativas y positivas a
Se realizaron otros experimentos para confirmar las conclusiones anteriores de que la eficacia de BPR1K653 no se ve afectada por la expresión de MDR1 en las células. La inhibición de Aurora quinasas induce endo-reduplicación de las células, lo que indica por la formación de poliploidía [14]. Aquí, los resultados de la microscopía de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo mostraron claramente que BPR1K653 indujo la formación de poliploidía (poblaciones & gt; 4N) en células KB (Figura 3A y B, y la Figura S1A). Las células KB-VIN10 MDR1 que expresan tratados con las mismas concentraciones de BPR1K653 como se habían aplicado a células KB también indujeron la formación de poliploidía (Figura 3A y C, y la Figura S1A). Por el contrario, VX680 solamente indujo la formación de poliploidía en las células KB, pero no en las células KB-VIN10 en las mismas concentraciones de tratamiento (Figura 3A, B y C). Sin embargo, la formación de la población poliploidía se demostró en células KB-VIN10 co-tratado con 10 M de la MDR-inhibidor, verapamil, y VX680 (Figura 3C). Estos resultados son consistentes con los hallazgos del ensayo clonogénico anteriormente que la expresión de MDR1 en células de cáncer afecta a la eficacia de VX680 pero no de BPR1K653.
(A, B y C) se trataron células KB y KB-VIN10 con BPR1K653 y VX680 durante 48 h. (A) Núcleo se tiñeron de color azul con colorante Hoechst y los microtúbulos se marcaron rojo con el anticuerpo anti-tubulina-etiquetados Fluor® Alexa. Las células (B y C) se incubaron con yoduro de propidio y se analizaron posteriormente por citometría de flujo. células (D y E) Piedra de afilar-1 se trataron con BPR1K653 durante 48 h. (D) Núcleo se tiñeron de color azul con el colorante Hoechst. (E) Las células se incubaron con yoduro de propidio y se analizaron posteriormente por citometría de flujo.
Para determinar si BPR1K653 también induce endo-replicación en líneas celulares de cáncer distintos de KB y su derivado, HONE-1 células fueron tratados con BPR1K653 y contenidos celulares se analizaron mediante microscopia y citometría de flujo. Tanto microscopía de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis mostraron claramente que BPR1K653 promovió la formación de poliploidía (poblaciones & gt; 4N). En las células de afilar-1 de una manera dependiente de la concentración (Figura 3D y E)
BPR1K653 reduce la histona H3 fosforilación y la expresión de ciclina B1 en células de cáncer de -positivos MDR1-negativas y
análisis de transferencia Western se realizó para confirmar que la eficacia de BPR1K653 no se ve afectada por la expresión de MDR1 en las células cancerosas. Histona H3 es un sustrato directo de Aurora-B quinasa, y las células endo-replicantes generalmente muestran una reducción de la expresión de la ciclina B1. En este experimento, la inhibición de la fosforilación de la histona H3 y baja regulación de la expresión de ciclina B1 se muestra en ambas células KB y KB-VIN10 tratados con las mismas concentraciones, 12 (IC
50), 24 (2 × IC
50) y 36 nM (3 × IC
50) de BPR1K653 de una manera dependiente de la concentración (Figura 4A y B). De acuerdo con estos resultados, el tratamiento VX680 (es decir, 170 nM y 255 nM) también inhibió la fosforilación de la histona H3 y la expresión de ciclina B1 en células KB (Figura 4A). Sin embargo, el tratamiento VX680 misma no podía inducir los cambios moleculares por encima de las células KB-VIN10 MDR1-expresión. tratamiento con verapamilo (10 mM) se demostró para restaurar la sensibilidad a la VX680 en células KB-VIN10, como se indica por una reducción en la fosforilación y expresión de ciclina B1 Histona H3 (Figura 4B).
(A) células KB fueron tratados con BPR1K653 y VX680 durante 48 h y la expresión de varias proteínas se determinaron por análisis de transferencia Western. Se muestran las intensidades de banda relativas. (B) células KB-VIN10 se trataron con BPR1K653 o VX680 con /sin verapamil durante 48 h, y la expresión de varias proteínas se determinó por análisis de transferencia Western. Se muestran las intensidades de banda relativas. las células (C) HONE-1 se trataron con BPR1K653 durante 48 h, y la expresión de varias proteínas se determinó por análisis de transferencia Western. Actina se utilizó como control interno.
Para determinar si BPR1K653 también reduce la fosforilación y la ciclina B1 expresión de histona H3 en líneas celulares de cáncer distintos de KB y su derivado, las células HONE-1 se trató con BPR1K653 y proteínas intracelulares se analizaron por transferencia Western. Western blot demostró claramente que tanto la fosforilación de la histona H3 y la expresión de la ciclina B1 se redujeron en las células de afilar-1 tratados con BPR1K653 (Figura 4C).
BPR1K653 induce la apoptosis en tanto MDR1-negativo y -positivo cáncer células
estudios previos revelaron que la orientación Aurora quinasas induce células endo-replicación y la posterior apoptosis celular [14]. Para determinar si BPR1K653 es capaz de inducir apoptosis tanto en células MDR1-positivos y cáncer -negativo, células KB y KB-VIN10 fueron tratados con BPR1K653 y propiedades apoptóticas fueron analizados por Anexina-V y en tiempo real la actividad de caspasa-3 /-7 imágenes y ensayos de TUNEL. Aquí, tanto en volumen citoplásmico y el tamaño del núcleo se incrementaron en las células KB y KB-VIN10 tratados con BPR1K653, lo que indica que BPR1K653 inducida por células endo-replicación como se esperaba (Figura 5A y C, y la Figura S1A). La translocación de la molécula de fosfatidilserina del centro de la valva de la membrana celular a la membrana externa indica la ocurrencia de apoptosis temprana. Los resultados del ensayo de Anexina-V mostraron que BPR1K653 induce la translocación de la molécula de fosfatidilserina en ambas células KB y KB-VIN10, como indica por la etiqueta fluorescente verde (Figura 5A). BPR1K653 también indujo la caspasa-3 /-7 actividad y la fragmentación del ADN tanto en células KB y KB-VIN10 en las mismas condiciones de tratamiento (Figura 5B, C, D, y la Figura S1A). Por el contrario, VX680 solamente induce la translocación de la molécula de fosfatidilserina, caspasa-3 /-7 actividad y fragmentación del ADN en células KB y no en las células KB-VIN10 MDR1-expresión (Figura 5A, B, C y D). Por otra parte, la escisión de PARP se muestra sólo en las células KB-VIN10 MDR1 que expresan tratados con BPR1K653 o VX680 /verapamil (co-tratamiento), y no con VX680 solo, tal como se revela por el análisis de transferencia Western (Figura 5E).
(a, B y C) y KB KB-VIN10 células se sembraron en portaobjetos de 8 pocillos de cámara durante la noche. Las células (A) se trataron con BPR1K653 o VX680 durante 48 h. La translocación de la molécula de fosfatidilserina en las células se analizó por el ensayo de Anexina-V-FLUOS y las células fueron vistos usando un microscopio activado por UV. la morfología general de las células se visualizó por microscopía de contraste de fase. (B) Las células se trataron con BPR1K653 o VX680 durante 60 h y MagicRed ™ -DEVD en tiempo real se utilizó la caspasa-3 /-7 kit Actividad (inmunoquímicos Technologies LLC) para detectar la activación de la caspasa-3 /-7 en las células , como se indica por la emisión fluorescente de color rojo. Núcleo fue teñida con azul de contador por Hoechst 33342, y las células se ve en tiempo real usando un microscopio invertido permitido a los rayos UV. (C y D) Detección de células con fragmentación de ADN mediante el ensayo TUNEL. células KB y KB-VIN10 se trataron con BPR1K653 o VX680 de 72 h. fragmentaciones de ADN fueron analizados utilizando el TMR-roja
In Situ
kit de detección de muerte celular. Núcleo con la fragmentación del ADN se tiñó de color rojo. Núcleo fue teñida con azul de contador por DAPI. Las células se analizaron mediante un microscopio activado por UV. (C) fotos representativas fueron mostrados. Se contaron (D) Las células marcadas, y el porcentaje de células apoptóticas se calculó de la siguiente manera: Cantidad total de la etiqueta fluorescente roja (ADN fragmentado) Cantidad total disponible núcleo del núcleo de la etiqueta fluorescente azul disponibles × 100 ÷. Los experimentos se repitieron dos veces. (E) BPR1K653 induce la escisión de PARP en células de cáncer KB-VIN10. Las células KB-VIN10 fueron tratados con BPR1K653 (2 × IC
50 de KB) o VX680 (2 × IC
50 de KB) con /sin verapamilo durante 72 h. La escisión de PARP se determinó por análisis de transferencia Western. Actina se utilizó como control interno.
BPR1K653 apoptosis también inducida en células Hone-1, como se indica por la inducción de la actividad caspae-3 /-7
in vitro
(Figura S1B).
BPR1K653 suprime el crecimiento de xenoinjertos de ambos MDR1-negativos y cáncer -positivo humanos
in vivo
a pesar de los resultados anteriores mostraron que BPR1K653 exhibe potente contra el cáncer efecto
in vitro
, se realizaron experimentos para determinar si BPR1K653 también es capaz de inhibir la actividad de las quinasas Aurora y el crecimiento de los tumores MDR1-negativo /positivo
in vivo
. células KB se cultivaron como
s.c..
tumores en ratones desnudos. Cuando xenoinjertos KB bien establecidos eran palpables con el tamaño del tumor de ~ 75 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de control y tratamiento de vehículo de cinco animales cada uno. Los ratones tratados recibieron 15 mg /kg de BPR1K653 o 30 mg /kg de VX680
i.p..
Durante 5 días /semana durante 2 semanas consecutivas. Los resultados del análisis de inmuno-histoquímica de las secciones de tejido de tumores mostraron que la administración de BPR1K653 redujo la cantidad de células positivas de fósforo-histona H3 presentes en los tejidos tumorales en comparación con el control (10% vs 60%) (Figura 6A). También se observó una disminución en la tasa de crecimiento tumoral en ratones tratados con BPR1K653 o VX680 5 días /semana durante 2 semanas consecutivas. Hubo una disminución ~73% en el volumen del tumor en el día 30 en los animales tratados con BPR1K653 (P & lt; 0,05). Además, hubo una disminución ~68% en el volumen de tumor en el día 30 en los animales tratados con VX680 (P & lt; 0,05; Figura 6B). BPR1K653 fue bien tolerado en la dosis de 15 mg /kg, sin signos de toxicidad en el modelo de tumor de xenoinjerto KB como la pérdida de peso corporal después del tratamiento fue de menos de 10% en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo control (Figura 6C ). Para determinar si la inhibición del crecimiento tumoral en ratones tratados con BPR1K653 estaba relacionado con los aumentos de las poblaciones celulares de cáncer de apoptosis, los tumores se retiraron quirúrgicamente de los ratones secciones 12 días post-tratamiento y de tejido se analizaron por el ensayo TUNEL. Los resultados del ensayo TUNEL mostraron que la cantidad de células apoptóticas presentes en el tejido tumoral de los ratones tratados con BPR1K653 fue significativamente mayor que los de los ratones de control (55% frente a 7%) (Figura 6D). Esto es consistente con el resultado de la
in vitro
experimento anterior que BPR1K652 es capaz de inducir a las células de cáncer de apoptosis.
(A, B, C y D) ratones desnudos portadores de carcinoma cervical humano KB xenoinjertos fueron tratados con control de vehículo (⧫), 30 mg /kg VX680 durante 5 días /semana durante 2 semanas (en los días 6-10 y 13-17; ▴) o 15 mg /kg BPR0L075 durante 5 días /semana durante 2 semanas (en los días 6-10 y 13-17; •). (A) BPR1K653 tratamiento redujo la cantidad de las células positivas de fósforo-histona H3 presentes en los tejidos tumorales. análisis inmunohistoquímicos de la expresión de fósforo-histona H3 en secciones de tejido tumoral de 24 h después de la segunda administración BPR1K653. Núcleo se tiñe de azul /violeta por hematoxilina y fósforo-histona H3 fue etiquetada en color marrón. Se contaron las células marcadas, y el porcentaje de las células positivas de fósforo-histona H3 presentes en los tejidos tumorales se calculó de la siguiente manera: Cantidad total de células con color marrón etiquetados ÷ cantidad total de células disponibles × 100. El experimento se repitió dos veces. Una diferencia estadísticamente significativa en la cantidad de células positivas de fósforo-histona H3 presentes en los tejidos tumorales en los ratones tratados con control versus BPR1K653 se denota por "*". * P & lt; 0,05. (B) La medición del volumen del tumor. Una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño del tumor en ratones tratados con control versus BPR1K653 y VX680 se denota por "*". * P & lt; 0,05. (C) Medición de peso animal. análisis (D) TUNEL de las secciones de tejido tumoral de 12 días de tratamiento post-BPR1K653. secciones de tejido de tumor se analizaron por el FITC
In Situ
kit de detección de muerte celular y microscopía de fluorescencia. Tejido tratado con DNasa se utilizó como control positivo. núcleo etiqueta de fluorescencia verde indica que la inducción de la fragmentación del ADN. El experimento se repitió dos veces. se muestra el análisis cuantitativo. Una diferencia estadísticamente significativa en la cantidad de células apoptóticas presentes en los tejidos tumorales en los ratones tratados con control versus BPR1K653 se denota por "*". * P & lt; 0,05. (E y F) ratones desnudos portadores de la P-gp170 /MDR-expresión de xenoinjerto KB-VIN10 se trató con control de vehículo (⧫), 30 mg /kg VX680 durante 5 días /semana durante 3 semanas (en los días 12-16, 19 -23 y 26-30; ▴) o 15 mg /kg BPR0L075 durante 5 días /semana durante 3 semanas (en los días 12-16, 19-23 y 26-30; •). (E) La medición del volumen del tumor. Una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño del tumor en ratones tratados con control versus BPR1K653 y VX680 se denota por "*". * P & lt; 0,05. (F) La medición de peso animal. Los datos son la media ± desviación estándar del volumen del tumor (mm
3) en cada punto de tiempo (n = 5; * P & lt; 0,05).
En particular, BPR1K653 también es tan eficaz hacia MDR1- expresando xenoinjerto de tumor como lo es en las células que expresan MDR1 cultivadas. Aquí, se utilizó KB-VIN10 xenoinjerto de tumor para evaluar la eficacia de BPR1K653 contra tumor MDR1-expresión de
in vivo
. Debido a las propiedades de crecimiento lento de KB-VIN10, los ratones tratados recibieron ya sea 15 mg /kg de BPR1K653 o 30 mg /kg de VX680
ip
durante 5 días /semana durante 3 semanas consecutivas en lugar de 2 semanas como en ratones KB-implantado. En comparación con los ratones de control, el crecimiento de tumor KB-VIN10 se inhibió significativamente en los ratones tratados con 15 mg /kg de BPR1K653. Hubo una disminución ~ 50% en el volumen del tumor en el día 42 en los animales tratados con BPR1K653 (P & lt; 0,05). Por el contrario, VX680 no mostró efecto significativo inhibidora del crecimiento de tumores en ratones trasplantados con células KB-VIN10 (Figura 6E). Por otra parte, BPR1K653 fue bien tolerado en la dosis de 15 mg /kg (5 días /semana durante 3 semanas consecutivas) sin signos de toxicidad en el modelo de tumor de xenoinjerto de KB-VIN10 como la pérdida de peso corporal después del tratamiento fue menos de 10 % en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo control (Figura 6F). Por lo tanto, ejerce BPR1K653 eficacia anti-tumoral potente hacia ambos xenoinjertos de tumores de MDR-TB-negativos y que expresan.
Farmacocinética de BPR1K653 en ratas
Por último, se accedió a los estudios farmacocinéticos de BPR1K653 más de un 24 h período para examinar las concentraciones plasmáticas de BPR1K653 después de una única administración intravenosa (Tabla 4). Después de una administración única de BPR1K653 a una dosis de 5 mg /kg a ratas, BPR1K653 alcanzó una concentración plasmática máxima de 10 micras (5,463 ng /ml) en 2 min después de la dosificación, y la concentración plasmática BPR1K653 estimado se mantuvo a una concentración de 3,9 nM (2,1 ng /ml) 24 h después de la dosificación. La vida media plasmática, aclaramiento corporal total y volumen de distribución en el estado estacionario (Vss) fue de 3,9 ± 0,7 h, 49,3 ± 10,6 ml /min /kg y 10,6 ± 5,1 L /kg, respectivamente.
Discusión
Aurora se han convertido en los principales reguladores de la mitosis y la evidencia indica anormalidades en la expresión y actividad están estrechamente relacionados con el desarrollo y la progresión de diversos tipos de cáncer. En este estudio, hemos desarrollado un nuevo pan-Aurora inhibidor de la quinasa BPR1K653 y demostró aún más su eficacia en llegar a los diversos tipos de cánceres
in vitro
. Nuestros estudios de rayos X co-cristalografía permeables habían demostrado las interacciones físicas entre el compuesto precursor de BPR1K653 y Aurora quinasas [42], y la corriente
in vitro
quinasa estudio de inhibición en ha confirmado la especificidad objetivo de BPR1K653. En consonancia con los cambios moleculares observados en células tratadas con Aurora-B quinasa oligos siRNA específicos y con diferentes inhibidores de la quinasa Aurora pan-como VX680 y SNS-314 [14], [43], [44], el tratamiento BPR1K653 también induce endo- replicación de las células y reduce la cantidad de fosforilados histona H3 presente en las células. Además, BPR1K653 es capaz de inducir apoptosis de células de cáncer pero no la autofagia (Figura S2), que es el resultado común en las células tratadas con inhibidores de la Aurora quinasa [43]. Curiosamente, BPR1K653 está activo en todo el p53 de tipo salvaje probado /-negativo /líneas celulares de cáncer -mutant a bajas concentraciones de nano-molar (IC
50 & lt; 20 nM), a pesar de la capacidad limitada de otra cacerola-Aurora inhibidor de quinasa VX680 para inducir la endo-replicación y apoptosis posterior se ha demostrado en células de cáncer con la función normal de p53 dependiente de post-mitótico puesto de control en otro estudio [14]. Tomados en conjunto, BPR1K653 está inhibiendo selectivamente Aurora quinasas, ya diferencia de VX680, es capaz de dirigirse a diferentes tipos de células cancerosas, independientemente de su estado de p53.
La resistencia a fármacos es un problema común en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas, y la eficacia de muchos fármacos quimioterapéuticos está limitada por el hecho de que son sustratos para la bomba de eflujo MDR1 (P-gp170). Por ejemplo, el inhibidor de quinasa Aurora AZD1152 /AZD1152-HQPA (Barasertib) demostró ser el sustrato de MDR1 [24]. Por otra parte, nuestros inhibidores de la Aurora quinasa de referencia, VX680 (Tozasertib) y PHA-739358 (Danusertib), fueron previamente se muestra ineficaz en la orientación de la MDR1 que expresan SA-Dx5 (resistente a la doxorrubicina), MB-231-PTX y H460-PTX (paclitaxel resistentes a las células cancerosas) por otros investigadores [25]. En este estudio, BPR1K653 ha demostrado ser igualmente eficaz contra dos líneas KB derivados de MDR1-positivo de células cancerosas (KB-VIN10 y KB-S15) y una línea celular de cáncer de MDR1 positivo NTUB1-dervided (NTU0.017)
in vitro. Esta función es diferente de las de los inhibidores de la quinasa Aurora bien caracterizados, VX680 y PHA-739358, ya que nuestras células cancerosas MDR1-positivos probados son más resistentes a estos agentes quimioterapéuticos que sus células MDR1-negativas de los padres. De hecho, co-incubación del inhibidor MDR1, verapamil, ha demostrado ser eficaz en la re-sensibilizar a las células cancerosas que expresan MDR1 tanto VX680 y PHA-739358, mientras que el mismo tratamiento no pudo mejorar la sensibilidad a la BPR1K653 en ninguno MDR1- negativa (KB y NTUB1) ni las células que expresan MDR1 (KB-VIN10, KB-S15 y NTU0.017). Es importante destacar que, BPR1K653 también es eficaz en la inhibición del crecimiento de ambas células de cáncer de MDR1-negativo kb y MDR1-expresión de KB-VIN10
in vivo
, más el apoyo a la hipótesis de que la sobre expresión de la MDR1 bomba de eflujo de fármaco común podría no interfiere con la eficacia de BPR1K653 en la orientación de las células cancerosas. Puesto que los compuestos quimioterapéuticos como el paclitaxel, vincristina (agentes anti-microtúbulos), doxorrubicina (agente de intercalación de ADN), la tretinoína (
-trans-retinoico
ácido), mitoxantrona, VP-16 (inhibidores de la topoisomerasa II) e imatinib (