Extracto
Las mutaciones activantes del
BRAF
gen conducen a la activación constitutiva de la vía MAPK. A pesar de que muchos cánceres humanos llevan el
BRAF
gen mutado, esta mutación no se ha caracterizado en los cánceres caninos. A medida que los cánceres humanos y caninos comparten alteraciones moleculares, la hipótesis de que
BRAF
mutaciones genéticas también existen en los cánceres caninos. Para probar esta hipótesis, hemos secuenciado el exón 15 del
BRAF
, mutación de punto caliente del gen, en 667 tumores primarios caninos y 38 tejidos de control. El análisis de secuenciación reveló que un solo nucleótido T a A en el nucleótido 1349 transversion ocurrió en 64 tumores primarios (9,6%), con frecuencia particularmente alta en el carcinoma de próstata (20/25, 80%) y el carcinoma urotelial (30/45, 67%) . Esta mutación da como resultado la sustitución de aminoácido de ácido glutámico por valina en el codón 450 (V450E) de canino
BRAF
, correspondiente a la más común
BRAF
mutación en el cáncer humano, V600E. La conservación evolutiva de la
BRAF V600E
mutación pone de relieve la importancia de la activación de la vía MAPK en la neoplasia y puede ofrecer oportunidades para el diagnóstico molecular y terapias dirigidas para los perros que llevan
BRAF
cánceres -mutated.
Visto: Mochizuki H, K Kennedy, Shapiro SG, Breen M (2015) BRAF mutaciones en los cánceres caninos. PLoS ONE 10 (6): e0129534. doi: 10.1371 /journal.pone.0129534
Editor Académico: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 6 Abril 2015; Aceptado: 11-may de 2015; Publicado: June 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Mochizuki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU) Fondo Genómica del cáncer (MB): perfil
Conflicto de intereses:. los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
Las proteínas Raf son evolutivos de serina /treonina quinasas conservadas que regulan los procesos celulares fundamentales, incluyendo el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia. La familia de la RAF se compone de tres miembros: ARAF, BRAF y FARC. Todas las proteínas de la RAF se activan por RAS y, posteriormente, activan MEK, iniciando la cascada de transducción de señales de la vía MAPK. la activación constitutiva de la vía MAPK causada por mutaciones oncogénicas de
RAF
genes resultado en la proliferación y diferenciación anormal. Entre las tres formas de
RAF
genes,
BRAF
gen está mutado con mayor frecuencia en el cáncer humano [1-3]
Los más comunes. (& Gt; 90%) mutación somática de la humana
BRAF
gen es un T-a-a transversion en el exón 15 en el nucleótido 1799 (c.1799T & gt; a), dando como resultado la sustitución de aminoácido de valina a ácido glutámico en el codón 600 ( V600E) [2]. La mutación V600E se produce dentro del segmento de activación del gen e imita la fosforilación, elevando drásticamente la actividad quinasa y la activación de la señal aguas abajo [3,4]. Esta mutación de activación ha sido reportado en el melanoma (~ 60%) [4,5], cáncer de tiroides (20-40%) [6-9], leucemia de células peludas (~ 100%) [10] y muchos otros tipos de cáncer con de frecuencia variable. Junto con mutaciones frecuentes de
RAS
genes, la presencia de
BRAF
mutaciones en una amplia variedad de cánceres humanos pone de relieve la importancia de la activación de la vía MAPK como una vía molecular común oncogénico.
Perros desarrollar cánceres espontáneos con muchas similitudes con los cánceres humanos, incluyendo la ubicación anatómica, aspecto histológico y la respuesta terapéutica. El cáncer en perros comparte no sólo comportamientos biológicos con los seres humanos, sino también anormalidades moleculares [11,12]. Desde la activación
BRAF
mutaciones están presentes en una amplia variedad de cáncer humano, la hipótesis de que
BRAF
mutaciones de genes están implicados de manera similar en los cánceres caninos, que conduce a la hiperactivación de la vía de MAPK y la transformación celular. Para probar esta hipótesis, que exhibió la presencia de
BRAF
exón 15 mutaciones en una cohorte de 667 muestras de tumor canino patológicamente confirmado, que comprende una serie de tumores hematopoyéticos (n = 245), sarcomas (n = 160) , carcinomas (n = 115), tumor melanocítico (n = 72), así como otro tipo de cáncer, menos comunes (n = 75).
Materiales y Métodos
muestras de tumor fresco y fijadas con formalina de diversos tumores sólidos caninos, y muestras de sangre EDTA de los casos de leucemia canina, se presentaron de perros de compañía propiedad del cliente (con el consentimiento propietario informado) por prácticas veterinarias privadas en los Estados Unidos como parte de los procedimientos de diagnóstico de rutina (sin CICUAL necesario). especímenes de tumores adicionales fueron reclutados a través de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU) Estudios Clínicos Core, cada uno con el consentimiento informado propietario, y tras un NCSU IACUC protocolo aprobado (número de autorización 13-022-O), que cubría el procedimiento utilizado para obtener las muestras y su posterior utilización para aplicaciones de investigación. Hematoxilina y eosina diapositivas de las muestras incluidas en parafina fijado en formol (FFPE) fueron revisados por un patólogo veterinario certificado por el consejo y confirmaron neoplásica en todo menos en muestras de leucemia. diagnósticos de leucemia se basaron en la evaluación citológica y un examen de immunophenotypical de las células leucémicas por un patólogo clínico certificado por el consejo
.
ADN genómico se aisló de los tejidos /muestras de sangre fresca o tejidos FFPE. Un total de 667 muestras de tumor se incluyeron en este estudio. Los detalles de la población de la muestra se muestran en las Tablas 1 y 2. Se aisló el ADN utilizando un kit de extracción de ADN QIAamp FFPE (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) o un Sangre DNeasy Tissue Kit y (Qiagen). Espectrofotometría (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE) y la electroforesis en gel de agarosa se utilizaron para determinar la cantidad y la integridad del ADN. Para los controles no neoplásicas (n = 38), se aisló el ADN del epitelio de la vejiga canina de 30 perros y glándulas de la próstata de 8 perros, obtenido mediante la necropsia sin evidencia de cambios neoplásicos en la evaluación histopatológica.
Exon 15 de la humana
BRAF
gen se conserva evolutivamente entre los perros y los seres humanos (figura 1). Por lo tanto, la amplificación por PCR se realizó para amplificar un fragmento de ADN de 391 pb que abarca el canino genómico
BRAF
secuencia correspondiente a humano
BRAF
exón gen 15 (CanFam3.1, cromosoma canino (CFA) 16 : 8,296,227-8,296,345). El siguiente par de cebadores fue diseñado usando el software Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/): adelante, AAGCAGGTCACATATGCCAAA (CFA 16: 8,296,007-8,296,027); revertir, ATTTTTGGACCCTGAGGTGC (CFA 16: 8,296,378-8,296,397). Cada reacción de PCR contenía 10-20 ng de ADN genómico, 250 nM de cebador directo e inverso y 1 x Kit Taq ROJO Master Mix (Genesee Scientific, San Diego, CA, EE.UU.). ciclos de PCR consisten en desnaturalización inicial de 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s con un paso de elongación final a 95 ° C durante 5 min. productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se sometieron a análisis de secuenciación de Sanger dirigida con el avance y /o cebadores inverso. El análisis de secuencia se realizó en el Laboratorio de Investigación del Genoma de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (http://research.ncsu.edu/gsl/). Los datos de secuenciación se analizaron utilizando software 4Peaks (http://nucleobytes.com/index.php/4peaks) y se compararon con la secuencia de referencia (XM_005629550.1) utilizando CLC Secuencia Viewer versión 7 (bio CLC, Aarthus, Dinamarca).
Las secuencias están muy conservadas entre humanos y perros, incluyendo valina en el codón 600 en BRAF humana (subrayado) y en el codón 450 en BRAF canina.
La prueba exacta de Fisher se realizó para examinar la diferencia de
BRAF
frecuencias de mutación entre grupos estratificados por sexo, estado de castración, la edad o las razas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con la versión de software JMP Pro 11 (SAS Institute, Cary, NC). Los valores de P & lt; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados y Discusión
Para investigar la presencia de
BRAF
mutaciones, la secuencia
BRAF
exón del gen 15 en 667 tumores primarios muestras y 38 muestras de tejido de control. El análisis de secuenciación reveló una T a A en el nucleótido 1349 transversión (c.1349T & gt; A, referencia: XM_005629550.1) que se produjo en 64 tumores primarios, lo que resulta en la sustitución de aminoácido de valina a ácido glutámico en el codón 450 (V450E) (Fig 2). Este cambio de aminoácidos corresponde a la mutación V600E humano (Fig 1). existe una variación significativa en la frecuencia de la mutación V450E en todos los cánceres caninos: 0% en los tumores hematopoyéticos y sarcomas a 67% y 80% de carcinoma urotelial (UC) y el carcinoma de próstata (PC), respectivamente (Tabla 3). En todos los mutantes V600E, electroferogramas indicaron la presencia de ambas secuencias mutantes y de tipo salvaje, lo que sugiere la heterocigosidad mutación. No hubo diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de mutación entre los diferentes grupos de castración de estado, edad o razas en la Universidad de California y las muestras de PC y entre el estado mutacional y de género en las muestras de la UC. Los detalles de signalments de perros con CU y el PC se muestran en la Tabla S1.
secuencia de tipo salvaje (A) obtenido a partir de un ADN de control de la glándula prostática. (B) secuencia mutada mezclado con secuencia de tipo salvaje obtenido de un carcinoma de próstata. La flecha indica la sustitución de T a A-nucleótidos resultante en el cambio de valina en el codón 450 en ácido glutámico.
Además de la mutación V450E, una transición de T a C en nucleótidos 1305 (c.1305T & gt; C, mutación silenciosa) se observó en una muestra de carcinoma de células escamosas oral. Se observó una eliminación intrónica de T (c.1292-189delT) en uno de cada uno de las muestras de sarcoma de tejido y de melanoma suaves. Todas las demás muestras tumorales y de control mantienen la secuencia genómica de tipo salvaje para
BRAF
exón 15.
La activación constitutiva de la señalización de MAPK mediante la activación de mutaciones de
BRAF gratis (~ 60%) o
NRAS
(~ 15%) genes juega un papel importante en la patogénesis de melanoma humano [4,5,11,12]. Del mismo modo, la activación constitutiva de la vía MAPK está implicada en el melanoma canino [13,14], aunque
RAS
genes fueron poca frecuencia mutado [14-16]. En este estudio, sin embargo, sólo el 6% de los melanomas (dos de la mucosa y un melanoma cutáneo) y el 17% de los melanocitomas albergaban el
BRAF V450E
mutación. Esta mutación no se identificó en estudios previos de melanoma canino [13,17], probablemente debido a la baja frecuencia de la
BRAF
mutación en el melanoma canino. En el melanoma humano, la presencia de
BRAF
mutación se asocia con la exposición de la piel a la luz UV, y melanomas en sitios de la mucosa o la piel expuestas no-UV-rara vez poseen la mutación [18,19]. Como el melanoma canino se produce principalmente en la mucosa oral y con poca frecuencia en las uñas y la piel de piel expuestas no-UV, el hecho de que
BRAF está mutado
con poca frecuencia en el melanoma canino es consistente con los hallazgos en homólogos humanos.
Curiosamente, canino UC mostró mucho más alta frecuencia de la
BRAF
mutación que se informa que en los tumores humanos UC [20]. Las mutaciones en los genes aguas arriba de la vía MAPK, incluyendo
HRAS
,
KRAS
y
FGFR3
genes (todos los cuales son moléculas de aguas arriba de BRAF en vía MAPK), se encontraron en & gt; 82% de UC papilar humano, lo que sugiere que la activación de la vía es un factor determinante principal de la subclase de UC humana [21,22]. Aunque las moléculas mutadas en la vía pueden ser diferentes entre humana y canina UC, la alta frecuencia de
BRAF
mutación en canino UC sugiere que la desregulación de la vía MAPK puede jugar un papel importante en la patogénesis de la enfermedad.
canina PC se caracteriza por una elevada capacidad de invasión potencial metastásico y locales, pero los factores que contribuyen al comportamiento biológico agresivo aún no se conocen [23]. Aunque
BRAF V600E
mutaciones son poco frecuentes en los seres humanos [24-26], la evidencia acumulada sugiere que la vía MAPK desempeña un papel importante en el desarrollo y progresión de PC humano, especialmente en tumores metastásicos [27]. Las mutaciones somáticas de los
RAS
genes y copiar ganancias número de
BRAF
y
CRAF
genes se observan en PC humana en las frecuencias de ~ 10, 30% y 15%, respectivamente [24-27]. Estas alteraciones genómicas conducen a la activación y /o el aumento de expresiones de proteínas Raf, lo que resulta en la activación de la señalización aguas abajo y el aumento de las propiedades metastásicas [26-28]. Además, translocaciones cromosómicas recurrentes que implica
RAS
y
RAF
genes, que dan lugar a la fusión de genes oncogénicos, fueron descubiertos recientemente en un subconjunto (~ 5%) de los casos de PC humanos [29,30] .
Una característica única de PC canino es que la mayoría de los tumores surgen de manera independiente de los andrógenos, con un mayor riesgo en perros castrados [23]. Por otra parte, la terapia de privación hormonal es un pilar para el tratamiento de PC humano, como andrógenos desempeña un papel crítico en la patogénesis. La mayoría de PC humano, sin embargo, el progreso de un cáncer más agresivo, hormona-refractario (resistente a la castración) durante el curso clínico. La activación de la señalización /MAPK BRAF hace que las células tumorales PC humano menos dependiente de andrógenos para la proliferación
in vivo
y
in vitro
, contribuyendo a la hormona refractario fenotipo [31]. La alta incidencia de la
BRAF
la mutación y la naturaleza agresiva de PC canina puede reflejar el hecho de que la mayoría de PC canino desarrollan independientemente de la estimulación androgénica. Estas similitudes clínicas y moleculares pueden hacer canina PC servir como un modelo de cáncer de los animales de forma espontánea que ocurren relevante para PC humana refractario a las hormonas.
reciente avance en la tecnología molecular nos permitió detectar células tumorales circulantes en muestras líquidas tales como periférico sangre. La detección de
BRAF
mutaciones puede ser utilizado como un medio para diagnosticar y controlar la carga tumoral en muestras líquidas, tales como sangre u orina, sin necesidad de biopsia de tumores (llamado como biopsia líquida, revisado en [32,33] ). Aunque el examen histopatológico de una biopsia del tumor es el estándar de oro para el diagnóstico de la UC canina y PC, las localizaciones anatómicas de estos tumores a menudo hacen que sea difícil obtener suficiente cantidad de tejidos para diagnosticar. Además, los clínicos y los propietarios pueden ser disuadidos de elegir este estudio diagnóstico debido a los costos y los procedimientos invasivos asociados con la biopsia. Por lo tanto, el acceso a un medio no invasivo de diagnóstico de estos cánceres es una necesidad no satisfecha. El alto
BRAF
tasa de mutación en estos tumores hace que la mutación BRAF V450E un marcador potencial de diagnóstico para el cáncer afectadas.
La identificación de
BRAF
mutación en los cánceres caninos plantea las posibilidades que la terapia de orientación vía MAPK activada constitutivamente puede proporcionar un beneficio clínico para los portadores del
BRAF V450E
mutación, especialmente los pacientes con CU y PC. Recientemente, vemurafenib y dabrafenib, inhibidores de BRAF selectivas, la mejora de los resultados clínicos en pacientes con melanoma en comparación con la quimioterapia convencional [34,35]. Estos inhibidores BRAF también han demostrado el potencial terapéutico en otras neoplasias albergar
BRAF
mutaciones [36-38]. Actualmente, las opciones de tratamiento para perros con CU y PC son de eficacia limitada. Dada la eficacia de la terapia BRAF /MAPK orientada en los cánceres humanos, la BRAF y las vías de MAPK pueden ser prometedoras dianas terapéuticas para estos tipos de cáncer canino. Las evaluaciones de los
in vitro
y
in vivo
efectos de los inhibidores de BRAF en los perros tienen una garantía de la aplicación clínica del inhibidor de BRAF para perros portadores de cáncer de mutado con
BRAF
.
en conclusión, hemos identificado el
BRAF V450E
mutación en los cánceres caninos con varias frecuencias. Frecuentes
BRAF mutación en
canina UC y PC subraya un posible papel de la vía de señalización MAPK en la patogénesis de estos tumores y puede ofrecer aplicaciones diagnósticas y terapéuticas para perros teniendo
BRAF
mutaciones.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Signalments de los perros diagnosticados con carcinoma prostático urotelial y en el presente estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129534.s001 gratis (XLSX)