Extracto
Follistatina (FST), una proteína que regula la foliculogénesis, se encuentra en concentraciones relativamente altas en los tejidos ováricos femeninos. FST actúa como un antagonista de la activina, que a menudo se encuentra elevado en el carcinoma de ovario humano, y por lo tanto puede servir como un objetivo potencial para la intervención terapéutica contra el cáncer de ovario. El gen de susceptibilidad al cáncer de mama 1
(BRCA1
) es un conocido gen supresor tumoral en el cáncer de mama humano; sin embargo, su papel en el cáncer de ovario no se entiende bien. Se realizó el análisis de microarrays en la línea celular de carcinoma de ovario humano SKOV3 que sobreexpresan de forma estable de tipo salvaje BRCA1 y en comparación con los clones transfectados con vector vacío correspondientes. Se encontró que la expresión estable de BRCA1 no sólo estimula la secreción de FST sino que también inhibe simultáneamente la expresión de la activina. Para determinar la importancia fisiológica de este fenómeno, se investigó adicionalmente el efecto de BRCA1 celular sobre la secreción de FST en inmortalizada epitelial superficial del ovario células (IOSE) obtuvieron a partir de ovarios humanos normales o los ovarios de una paciente con cáncer de ovario que lleva una mutación en
BRCA1
gen. Knock-down de
BRCA1 Hoteles en células normales IOSE demuestra la baja regulación de la secreción de FST junto con la sobre regulación de la expresión simultánea activina. Por otra parte, knock-down de
FST Hoteles en líneas celulares IOSE así como la línea celular SKOV3 demostraron una reducción significativa la proliferación celular y la disminución de la migración de células en comparación con los controles respectivos. Por lo tanto, estos resultados sugieren una función novedosa para BRCA1 como un regulador de la expresión FST y la función en las células de ovario humano
Visto:. Karve TM, Preet A, R Sneed, Salamanca C, Li X, Xu J, et Alabama. (2012) regula la función de los genes BRCA1 Follistatina del cáncer de ovario y células epiteliales de ovario superficie humana. PLoS ONE 7 (6): e37697. doi: 10.1371 /journal.pone.0037697
Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de julio de 2011; Aceptado: April 26, 2012; Publicado: 1 de junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Karve et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Tapas Saha está agradecido a la Sociedad Americana del cáncer (GRI#97-152-16-2), Centro de Fisher para el Centro de cáncer familiar, Lombardi Comprehensive Cancer Center de la Universidad de Georgetown para el apoyo financiero. Este trabajo fue apoyado, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones 1U56CA101429-01 (al Dr. Pedro Escudo, Deepak Kumar y el primo Dr. Carolyn). Eliot M. Rosen ha sido apoyada, en parte, por subvenciones de investigación del Servicio de Salud Pública (R01-CA150646), Susan G. Komen for the Cure (KG110580), La vida en rosa, y el programa de la Universidad de Clase Mundial financiado por el Ministerio de Educación , Ciencia y Tecnología a través de la Fundación de Investigación Nacional de Corea (R31-10069). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es uno de los cánceres ginecológicos líderes en los Estados Unidos con 22.280 nuevos casos estimados y 15.500 muertes en 2012 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/ovarian, analizándose febrero 2012). Las altas tasas de mortalidad por cáncer de ovario se atribuyen principalmente a la etapa tardía diagnóstico de la enfermedad; casi el 60-65% de los casos de cáncer de ovario se diagnostica cuando el cáncer ya se ha diseminado más allá de los confines del tejido ovárico. La detección temprana de cáncer de ovario se muestra aumentar significativamente la esperanza de vida del paciente a tan alto como 85% [1]. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar biomarcadores que pueden ser útiles en la detección de cáncer de ovario en las primeras etapas de la enfermedad. mayoría de los cánceres de ovario se producen dentro de la superficie del epitelio de ovario (OSE) y por lo tanto investigaciones usando OSE células derivadas de ambos pacientes normales de cáncer de ovario individual y son críticos para elucidar la etiología del cáncer de ovario humano. mutaciones genéticas Curiosamente, sólo el 5-10% de las mujeres con cáncer de ovario son tumores hereditarios en los genes supresores de tumores tales como
BRCA1
y
BRCA2
que los predispone a cáncer de mama y de ovario [2], [ ,,,0],3], [4]. Además, un estudio de ligamiento genético cohorte consta de 214 de cáncer de mama y en periodo de ovario familias con cáncer combinadas, reveló que 90% de los pacientes mutaciones albergaba en su
BRCA1
[5] gen. Por otra parte,
BRCA1
mutación (s) a las mujeres portadoras tienen aproximadamente 15 veces mayor riesgo de desarrollar cáncer de ovario en comparación con sus contrapartes femeninas no portadores [6], [7].
Follistatina ( FST), una glicoproteína de cadena simple autocrina, se expresa en casi todos los tejidos humanos, tales como riñón, cerebro, útero, de mama y con la mayor concentración se encuentra en el tejido de ovario humano [8]. Madura, existe forma secretada de la proteína FST en tres isoformas; de longitud completa, intermedio y más corto que consiste en 315, 303 y 288 aminoácidos, respectivamente [9]. FST, inicialmente aislado a partir de fluido folicular se encontró para interactuar con la activina, un miembro de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) superfamilia. Activina se ha demostrado que regulan la proliferación celular, la diferenciación, la angiogénesis, así como la apoptosis, y por lo tanto puede ser posiblemente implicados en la regulación de crecimiento de tumor de ovario [10]. Los niveles elevados de activina se detectan no sólo en la mayoría de los tumores de ovario epitelial de origen, sino también en las muestras de suero recogidas de los pacientes con cáncer de ovario epitelial. Se cree que los altos niveles de activina ser responsable de promover el progreso de la enfermedad y son predictivos de peor pronóstico de la enfermedad para pacientes con cáncer de ovario [10]. FST se une a activina de manera antagónica y la expresión elevada de FST celular puede lleva a la función citoprotección en pacientes con cáncer de ovario. Un estudio reciente ha demostrado que la transfección transitoria con el tipo salvaje (wt)
FST
ha demostrado inhibir la metástasis en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas [11]. En contraste, un número significativamente mayor (P & lt; 0,05) concentraciones de FST han sido reportados en pacientes con cáncer de ovario en comparación con voluntarios sanos de la misma edad
Los miembros de la TGF-ß superfamilia han demostrado que modulan el crecimiento de. células epiteliales de ovario humano normal
in vitro
[12], [13]. Por lo tanto, las mutaciones en los receptores de TGF-ß o sus señalización intracelular moléculas tales como proteínas Smad se han implicado en el desarrollo de varios tipos de cáncer [14], [15], [16], [17], [18] incluyendo el cáncer de ovario humano [19], [20], [21]. Otro miembro de la superfamilia de TGF-ß, la inhibina, es un antagonista funcional de la activina y se ha demostrado que modulan el crecimiento de células epiteliales de ovario humano normal [22], [23]. Inhibinas, producidas por las gónadas humanos, desempeñan un papel fundamental en la atenuación de señalización regulada por el sistema de activina en gonodal humana [22]. La inhibina es activado por la presencia de un co-factor, beta-glucano, que a su vez compite con activina para unirse con los receptores de activina (aurículas y ActRIIB), antagonizando de este modo regulado Activina cascada de señalización [24]. Además, la inhibina total se ha sugerido como un marcador sérico potencial para el cáncer de ovario humano epitelial-origen. Además, la proteína de genes relacionados con la folistatina (FLRG), que muestra una fuerte homología con FST, y se ha demostrado que interactúan y bloquear la función de los ligandos de la superfamilia de TGF-ß incluyendo activina, proteína morfogenética ósea (BMP) -2, BMP-6 , BMP-7, y GDF-8. FLRG se expresa principalmente en el corazón, pulmón, riñón y placenta y puede ser estimulada por TGF-ß, Activina y Smad proteínas [25]. FLRG expresión se informó a ser muy variable en varias líneas y tejidos de cáncer. Un estudio reciente mostró que la baja regulación de FLRG inhibe el crecimiento del tumor de mama humano [26].
Varios estudios han propuesto que las estrategias terapéuticas dirigidas específicamente, los mediadores moleculares que regulan negativamente los niveles de expresión endógenos Activina pueden ralentizar o inhibir la progresión del cáncer [27]. Por lo tanto, un posible papel de la FST como un antagonista de la activina en la patogénesis del cáncer de ovario requiere más investigación. En este estudio, hemos utilizado inmortalizados epitelio superficial del ovario (IOSE) células de ovario humano normal (IOSE 7576 y IOSE 397) y de un paciente con cáncer de ovario
BRCA1
mutación, IOSE 592 septies, para investigar el papel de los genes BRCA1 en la mediación de la secreción de FST en estas células. También se construyeron varios clones BRCA1 estables en la línea celular de adenocarcinoma de ovario SKOV3 que ectópica expresar la proteína BRCA1 (
es decir.
BRCA1 SKOV3). Inicialmente se realizó un análisis de microarrays utilizando BRCA1 SKOV3 clon y controlar clon neo para identificar biomarcadores tempranos de cáncer de ovario. A continuación, se validó los resultados mediante el análisis de PCR en tiempo real y encontramos que
FST
y
SMAD6
fueron reguladas en BRCA1 SKOV3 clon#19, así como en toda la célula IOSE líneas. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida o disminución de los niveles de la secreción de FST en células de ovario pueden servir potencialmente como un marcador para la carcinogénesis de ovario humano.
Métodos
Los vectores de expresión y reactivos
la de tipo salvaje (wt) plásmido de expresión de BRCA1 se creó mediante la clonación de los genes BRCA1 ADNc en el vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando diseñada artificialmente 5 '
Hind III y
3'
No
I sitios [28]. Dimetilsulfóxido (DMSO), ß-mercaptoetanol, y todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
línea celular se obtuvo de SKOV3 la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FCS), aminoácidos no esenciales (100 mM), L-glutamina (5 mM), estreptomicina (100 mg /ml) y penicilina (100 U /ml) (todos de Lonza, Inc., Walkersville, MD). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 y sub-cultivaron dos veces por semana, utilizando tripsina (Lonza) [29]. Estable clones BRCA1-SKOV3, así como vacío en vectores transfectadas (neo) clones estables se generaron a través de la transfección con los vectores pertinentes seguido de la selección con geneticina (Invitrogen). Las células
Inmortalizado Epitelio de ovario de superficie (IOSE)
las líneas celulares inmortalizadas (IOSE 7576, IOSE 397 y 592 septies IOSE) fue amable regalo de Dr.Nelly Auersperg del tejido ovárico canadiense Bank (Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá). Brevemente, las células epiteliales de la superficie del ovario se rasparon de tejido de la superficie de ovario humano y se cultivaron en 01:01 mezcla de medio 199 (Invitrogen) y MCDB 105 (Sigma) suplementado con 10% FBS, NaHCO3 (2,2 g /L), L-Glutamina ( 5 mM), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (todos de Invitrogen). Los cultivos de bajo paso de las células del epitelio superficial del ovario humanas aisladas fueron luego inmortalizados por transfección con partículas virales antígeno grande de SV40-T [30]. se observaron las características morfológicas y el patrón de crecimiento de líneas de células IOSE para imitar las células epiteliales de la superficie del ovario en las matrices extracelulares. Además, las células IOSE exhiben una fuerte semejanza morfológica con las primeras células neoplásicas de ovario en los seres humanos y por lo tanto sirven como un excelente modelo para los
in vitro
estudios se centraron en la carcinogénesis de ovario humano [30], [31].
Affymetrix microarrays de oligonucleótidos
Affymetrix microarrays se realizaron análisis en las instalaciones del núcleo Lombardi Cancer Center Genómica y Recursos compartidos Epigenomics de la Universidad de Georgetown. aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, hibridaciones de chips de genes, y análisis de datos se realizaron como se describe anteriormente [32]. El vector vacío y el clon BRCA1 estable en células SKOV3 que se utiliza para generar los datos de microarrays que se describen a fondo en nuestro manuscrito anterior [32]. Los chips de genes utilizados para estos experimentos fueron Genoma Humano U133 Plus 2,0 Array. Todos los datos de microarrays fue MIAME (mínima información sobre un experimento de microarrays) conformes y los datos en bruto ha sido depositado en la Expresión Génica Omnibus base de datos (GEO) como se describe en nuestro manuscrito anterior [32]. El número de acceso para esta presentación es GSE30296. La agrupación jerárquica de los genes seleccionados se realizó como antes [32].
transitoria transfections
Las células en crecimiento SKOV3 fueron transfectadas durante la noche con los vectores de expresión indicados (4-6 g de plásmido de ADN por pocillo de una placa de 6 pocillos o 20 a 25 g por placa de 100 mm) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe anteriormente [29], [33]. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS 1X seguido de incubación con medio de cultivo fresco para un máximo de 24-48 horas para la expresión génica.
Tratamientos de ARN interferente pequeño (SI)
De forma asincrónica células proliferantes eran pre-tratados con siRNA específico de gen (100 nM durante 72 horas) usando SIPORT amina (Ambion, Foster City, CA). La eficiencia de derribo se confirmó mediante inmunotransferencia para la proteína (s) objetivo. siRNAs siguientes se utilizaron en este estudio: Control de siRNA [en-blanco
más
para no siRNA dirigidos (Cat#D-001810-01, Dharmacon, Chicago, IL)]; FST siRNA se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; BRCA1 siRNA [charco de dos ARNsi sintetizado encargo de Dharmacon (secuencias 5 '→ 3' y CAGCTACCCTTCCATCATA CTAGAAATCTGTTGCTATG)]. Tanto FST y BRCA1 siRNA fueron blanco contra la ORF de los genes respectivos
semi-cuantitativa de la transcriptasa reversa -. Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)
semi-cuantitativos RT-PCR ensayos eran realizado como se ha descrito antes [29]. Brevemente, se trataron las células como se indicó anteriormente y el ARN total se extrajo usando el kit de RNasa Fácil Mini (Qiagen, Valencia, CA). Las alícuotas de ARN total (50 ng) fueron a transcripción inversa utilizando 50 unidades de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) en un volumen de reacción de 20 l. la amplificación por PCR semi-cuantitativa se realizó utilizando alícuota de 1 l de cada muestra del cDNA transcrito, usando inicio caliente Taq polimerasa (Denville, South Plainfield, NJ). ADN se desnaturalizó primero durante 5 min a 95 ° C, y luego amplificado utilizando ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 segundos a la temperatura de hibridación específica, y 1 min a 72 ° C, con final de 10 min de incubación a 72 ° C . El número de ciclo se ajustó de modo que todas las reacciones estaban dentro del rango lineal de amplificación producto de PCR. El delantero y cebadores usados, temperaturas de recocido y tamaños esperados de los productos de la PCR inversa se muestran en la Tabla 1. cuantitativa análisis de la media de al menos tres experimentos independientes se representa junto con el error estándar de las mediciones (± SEM).
cuantitativo en tiempo real PCR (Q-PCR)
la Q-PCR se llevó a cabo por el sistema ABI PRISM 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando SYBR Green PCR Master mezcla de reactivos (Applied Biosystems) en un volumen de reacción de 25 l. 10 ng de cDNA muestras con cebadores específicos de genes apropiados se utilizaron para cada análisis de PCR. valores de umbral de ciclo se ajustan automáticamente, y se determinaron los cambios veces para cada par de cebadores específicos de genes. cebadores Q-PCR se enumeran en la Tabla 1 y se obtuvieron a partir de Tiempo Real cebadores, LLC., Elkin Parques, PA.
Western Blot
Las células fueron tratadas como se indica y se prepararon lisados de células enteras como se describe anteriormente [34]. Brevemente, las células post-tratamiento se lavaron con 1X PBS y se lisaron usando un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón (Roche, Indianapolis, IN) suplementado con completa Mini, tableta de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA-(Roche) en hielo durante 10 min. Las células lisadas se sacudieron a 4 ° C durante 20 min, seguido de centrifugación a 12.000 xg durante 20 min. Las alícuotas de proteínas (50 g) en 4X LDS (dodecil sulfato de litio) tampón de muestra (Invitrogen) se analizaron en los geles prefabricados de 4-12% Bis-Tris (BT) (Invitrogen). Las proteínas fraccionadas se transfirieron a continuación a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA) y se bloquearon durante una hora en 5% de leche sin grasa en 1X PBS-Tween 20. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios indicados, y posteriormente con específico de la especie peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario (Santa Cruz). proteínas borrados se visualizaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia (Santa Cruz). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: BRCA1 (C-20, Santa Cruz, 1:200); FST (K-19, Santa Cruz, 1:100); Actina (C-11, Santa Cruz, 1:400), y la activina (ab89307, Abcam, Cambridge MA, 1:1000).
Follistatina Ensayo
La detección cuantitativa de los niveles celulares era FST lleva a cabo usando el kit Quantikine Human FST Immunoassay (R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, MN) que emplea el método cuantitativo inmunoensayo enzimático sándwich (ELISA). Brevemente, se realizó una curva estándar para cuantificar la cantidad de FST en el medio de cultivo de células y lisados utilizando estándares FST conocidos incluidos en el kit. Las células se trataron como se indica, y el medio de las células tratadas se diluyó 10 veces para el ensayo. Ambos patrones y las muestras diluidas se pipeta en los pozos pre-recubiertas con anticuerpo monoclonal FST. El anticuerpo inmovilizado se deja que se una a FST presente en las muestras, seguido de la incubación de un anticuerpo monoclonal ligado a enzimas específico para FST en cada pocillo. Una solución de sustrato se añadió a los pocillos después de la incubación que conduce a un desarrollo de color en proporción a la cantidad de FST unido durante la etapa de reacción inicial. La intensidad del color se mide en dos longitudes de onda (450-540 nm). La cantidad de FST en cada indicó muestras representadas como media ± SEM.
La migración de células de ensayo
La migración celular se ensayó usando CytoSelect 96 pocillos Kit de migración de células, 8 m, fluorométrico (Biolabs celulares, Inc. de San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante, que se basa en el método de cámara de Boyden. Brevemente, las células se suspendieron tratado /sin tratar en un medio de cultivo libre de suero y luego se colocaron en placas en la cámara de membrana superior de la placa de la migración celular. La cámara de membrana que contiene las células después se pusieron en la parte superior de la bandeja de alimentación para facilitar la migración celular a través de la membrana. La quimio-atrayente utilizado en la bandeja de alimentación era medio de cultivo celular completo que contenía 10% de FCS. El montaje completo se incubó a 37 ° C incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Las células migraron de cada muestra se recogió de la bandeja de alimentación; se lisaron usando un tampón de lisis que consiste en CyQuannt colorante fluorescente GR, y la fluorescencia total de las células migradas se cuantificó usando un lector de microplacas de fluorescencia Victor 1420 (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Waltham, MA) a doble longitud de onda (480-520 nm ). Las unidades de fluorescencia observados (FU) son directamente proporcionales al número de células migradas; mayor es la fluorescencia observada más alta es la migración celular. Una curva estándar se construyó para cada línea celular usando una densidad celular incrementales según las instrucciones del fabricante, y los datos obtenidos a partir de la curva estándar de cada línea celular (tratado /sin tratar) se representan como media ± SEM.
Cell Ensayo de proliferación de
kit flujo FITC BrdU de BD Pharmingen (San Jose, CA) se utilizó para llevar a cabo los ensayos de proliferación celular con las líneas celulares IOSE según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 10 M de BrdU de células en fase logarítmica de forma asíncrona cada vez mayor de una hora a pulso las células. Las células fueron fijadas y permeabilizadas utilizando BD Cytofix /Cytoperm tampón (proporcionado en el kit), y posteriormente tratados con DNasa para exponer BrdU. a continuación, se utilizó anticuerpo FITC para detectar BrdU, y luego las células se sometieron a un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA) y los parámetros se fijan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. FACS análisis se realiza en la citometría de flujo y celulares de recursos compartidos Clasificación del Centro de Cáncer Lombardi de la Universidad de Georgetown. Los datos obtenidos fueron representados como medios ± SEM de las células BrdU ciento etiquetados.
El análisis estadístico
Los datos fueron analizados estadísticamente por "Un análisis de la varianza (ANOVA) a través de la prueba de Tukey, la cual es una comparación por pares de las respuestas medias a los diferentes grupos de tratamiento usando el software estadístico SigmaStat (Ver 3 para windows). Un valor de P & lt; 0,05 o menos fue considerado significativo para todos los experimentos
Resultados
La expresión estable del gen BRCA1 en la línea celular SKOV3
A diferencia de cáncer de mama, no hay bien. directrices -Establecido enlazan
BRCA1
mutaciones y la predisposición del individuo a desarrollar cáncer de ovario. A continuación, se utilizó la línea celular de cáncer de ovario humano (SKOV3) como una línea celular de cáncer de ovario padres y generó varios clones estables que expresan ectópica wtBRCA1 (BRCA1 SKOV3) y su vacío de vectores de fondo, pcDNA3 (Neo). Como se ve en la Figura 1A,#4,#18, y#19 clones de BRCA1-SKOV3 demostró un aumento significativo en la expresión de BRCA1 (P & lt; 0,05) en comparación con las células SKOV3 parental, así como correspondientes clones Neo. El análisis densitométrico de tres transferencias de Western independientes se muestra en la Figura 1B como medias ± error estándar de las mediciones (SEM). Por lo tanto, la generación de líneas de células sub SKOV3 con BRCA1 expresión estable podría ayudar aún más en la comprensión del efecto de BRCA1 en el carcinoma de ovario humano.
(A) Varias líneas estables fueron creados usando la sobreexpresión de los genes BRCA1 y su vector de fondo, pcDNA3 en células de carcinoma de ovario SKOV3. Los niveles de expresión de BRCA1 se muestran en todos los clones de células. Los padres indica que sólo las células SKOV3 no transfectadas. El análisis densitométrico de las inmunotransferencias tres independientes se da en (B). Las barras de error son SEM. * Representa P & lt; 0,05 (en comparación con los padres)
La expresión génica diferencial debido a la sobreexpresión de los genes BRCA1 SKOV3
Sobre la base de la expresión de BRCA1 de#19 clon del BRCA1 SKOV3 (. de aquí en adelante referido como fue seleccionado BRCA1 SKOV3 clon#19) y se combina con el nº 3 de clon Neo (de aquí en adelante como Neo clon#3) para el análisis de microarrays de Affymetrix. ARN a partir de tres pases de cultivo separados de los genes BRCA1-SKOV3 clon#19 células y el clon#3 Neo células fue aislado y sometido al análisis de microarrays (véase métodos para más detalles). A continuación, se construyó una agrupación jerárquica de la expresión de genes que fueron significativamente (P & lt; 0,05) alterado en las 19 células BRCA1-SKOV3 clon#y en comparación con el clon#3 Neo células. Hemos observado más de 10 veces sobre regulación de 274 genes y más de 4 veces baja regulación de 279 genes BRCA1-SKOV3 clon#19 células en comparación con el clon Neo#3 (véase el cuadro S1, así como correspondiente mapa de calor en la Figura S1 ). Usando estos datos de microarrays, análisis Ingenuity Pathway reveló que la sobreexpresión de los genes BRCA1 en las células SKOV3 (BRCA1 SKOV3 clon#19) modula varias señalización de importancia crítica y las vías metabólicas (ver Tabla S2 de los genes regulados y el cuadro S3 para las reguladas por los genes en BRCA1 SKOV3 clonar#19). La lista de genes se redujo aún más hasta 40 genes seleccionados en base a alrededor de 3 veces de cambio en los niveles de expresión en comparación con el control, y con valores significativos de p (P & lt; 0,05). Se encontró que los grupos seleccionados de genes ser principalmente responsable para el crecimiento celular, la progresión del ciclo celular y la respuesta al estrés oxidativo, que eran de interés primario para el estudio actual. La agrupación jerárquica se rehizo el uso de estos datos seleccionado 40 genes de hasta reguladas (rojo) o hacia abajo de los genes regulados (verde) debido a la sobreexpresión de los genes BRCA1 wtBRCA1-SKOV3 clon celular#19 (Figura 2). Los resultantes dos grupos de genes, junto con su factor de cambio y el valor p se proporcionan en el panel derecho de la Figura 2.
Un mapa de calor que muestra cambios significativos en un grupo de genes seleccionados debido a la sobreexpresión de wtBRCA1 en SKOV3 células de carcinoma de ovario. Se realizaron tres análisis de microarrays independientes. Se detectaron dos grupos, uno debido a la baja regulación de los genes (verde) y otra debido a la sobre regulación de los genes (rojo). Doblez valores de cambio y de p de los genes en los grupos se dan a la derecha
FST, un antagonista de la activina, es responsable del desarrollo ovárico precoz.; sin embargo, no se sabe mucho acerca de la regulación celular de FST en el tejido ovárico humano. Elevado nivel de FST en células de ovario humano se sugieren como un agente citoprotector contra la carcinogénesis ovárica. Hemos observado 51,6 veces mayor expresión de FST en BRCA1-SKOV3 clon#19 en comparación con el clon#3 Neo células. También se encontró inhibina ser significativamente (P & lt; 0,05) de las células BRCA1-SKOV3 hasta reguladas (11,6 veces) en. Varios estudios han sugerido el papel potencial de la inhibina como un biomarcador de cáncer de ovario de origen epitelial [35]. Unos pocos estudios que proponen la inhibina como un marcador de suero en la carcinogénesis de ovario reveló que los niveles de inhibina están elevados en aproximadamente el 70-80% de los pacientes con cáncer de ovario de tipo mucinoso, y en 15 a 35% de los no mucinoso tipo epiteliales casos de cáncer de ovario [36] , [37]. Los estudios han demostrado, además, que en las mujeres post-menopáusicas, la inhibina total puede ser combinado con CA-125 para el diagnóstico eficiente de la carcinogénesis epitelial de ovario [35].
Además, se halló que varios otros miembros de TGF β familia como el TGF-beta 2, TGF-ßR1, TGF-ßR3 y un inhibidor de la SMAD, SMAD6, fueron también hasta reguladas en BRCA1 SKOV3 clon#19 (Figura 2). Por lo tanto, el enfoque de la agrupación jerárquica no sólo pudo confirmar el número de posibles marcadores conocidos previamente en el cáncer de ovario, pero también revelan varias otras dianas moleculares putativos que puedan ser de interés para el diseño de tratamiento específico para el cáncer de ovario humano.
Validación de Affymetrix microarrays resultados por semi-cuantitativos RT-PCR
Hemos utilizado RT-PCR para validar los resultados obtenidos del análisis de microarrays. Tres clones individuales para cada estables las líneas celulares BRCA1 SKOV3 Neo y se utilizaron para llevar a cabo semi-cuantitativos de RT-PCR. Se encontró una correlación significativa (P & lt; 0,05) entre los microarrays y RT-PCR. La figura 3A muestra ARNm expresiones representativas de los genes indicados en todos los grupos de células. La Figura 3B demuestra estimación cuantitativa de las expresiones de ARNm de todos los genes objeto de la investigación sobre la base de al menos tres experimentos independientes. En todos los casos, la expresión de ARNm de FST fue significativamente (P & lt; 0,05) más alta en clones BRCA1-SKOV3 en comparación con clones Neo, validar los resultados observados en el análisis de microarrays, aunque es necesario tener en cuenta que el grado de pliegue de cambio es variable ; posiblemente debido a la diferencia en la sensibilidad de estas dos técnicas. BRCA1 SKOV3 clon#19 demostró máxima sobre regulación de los genes BRCA1 entre las líneas celulares estables; por lo tanto, todos los futuros experimentos se realizaron usando este clon, como se muestra arriba, y se comparó con el clon#3 Neo. Además, RT-PCR también confirmó la sobre regulación de SMAD6 en el BRCA1 SKOV3 clon#19 (Figura 3A). Además, se investigó el efecto de la expresión transitoria de BRCA1 en las células SKOV3 parental. Los resultados mostrados en la figura 3C son consistentes con los resultados observados en la Figura 3A y 3B. expresión FST mRNA se encontró que era significativamente (P & lt; 0,05) elevada en BRCA1 sobreexpresa células SKOV3 en comparación con el vector de fondo transfectadas (pcDNA3), así como las células SKOV3 parental. Además, las expresiones de ARNm de SMAD6 también eran elevados en las células que sobreexpresan wtBRCA1 (Figura 3C). Densitometría de la expresión de los genes de interés a partir de al menos tres experimentos independientes se presentan en la figura 3D.
(A) La proliferación de clones estables de ambos Neo (pcDNA3-SKOV3) y wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) se cosecharon para el ensayo de RT-PCR semi-cuantitativa como se describe en "Métodos". Las bandas correspondientes a los respectivos genes se indican a la derecha. (B) Las bandas de PCR de tres experimentos independientes de cada genes indicados se cuantificaron por densitometría y los niveles de mRNA se normalizaron a la actina. células (C) La proliferación SKOV3 se transfectaron transitoriamente, ya sea con wtBRCA1 o vector pcDNA3 fondo y los ARN aislado fue ensayada por semi-cuantitativos RT-PCR. Los resultados se cuantificaron como anteriormente y representados por diagrama de barras (D). Las barras de error son SEM. * P & lt;. 0,05 (en relación con cada uno de los controles)
BRCA1 regula la secreción de FST en células de carcinoma de ovario SKOV3
FST es secretada por el líquido folicular ovárica en la región extracelular, y es esencial para el desarrollo temprano de ovario [38].
In vitro
experimento con células de ovario cultivadas exhiben niveles diferenciales de secreción de FST en el medio de cultivo en función de tratamientos con células y condiciones de cultivo. Por lo tanto, un medio diluido sirve una buena fuente para medir la secreción y expresión de la FST en un tipo celular particular. Figura 4A muestra una curva estándar obtenida con la proteína purificada FST, que se utilizó para cuantificar la cantidad de secretada FST en las muestras bajo investigación. Nuestros resultados demuestran que la expresión de BRCA1 en las células SKOV3 muestra aproximadamente 2 veces más alta secretada FST cuando se compara con células transfectadas con pCDNA3 (Figura 4B). Además, se realizó un ensayo de FST cuantitativa similar usando células SKOV3 donde en BRCA1 fue derribado por siRNA-BRCA1 específica. Figura 4C mostró% de disminución de al menos 50 en la expresión FST en células knock-down BRCA1 en comparación con las células tratadas con el control de siRNA. A continuación, se realizó el mismo ensayo FST con los clones de células BRCA1 estables en las células SKOV3 como se describió anteriormente. BRCA1 SKOV3 clon#19 mostró un aumento de la secreción de las células de clon FST neo#3, como se esperaba (Figura 4D). Por otra parte, también hemos investigado los niveles secretados de FST en las líneas estables tras la baja regulación de los genes BRCA1 en el mismo. Down-regulación de BRCA1 en cualquiera clon Neo#3 (Figura 4E) o BRCA1-SKOV3 el clon#19 (Figura 4F) significativamente (P & lt; 0,05) inhibió la secreción de FST en medio de cultivo celular en comparación con sus respectivos controles. los niveles de expresión de la proteína de BRCA1 en todas las muestras anteriores se muestran en la Figura 4G. Los datos obtenidos de este ensayo FST cuantitativa sugiere que la inducción de los niveles de BRCA1 celulares a su vez estimula la secreción de FST extracelular en células de cáncer de ovario humano.
(A) Curva de calibración se generó con FST purificada humana como se indica en los "Métodos" , que se usó para cuantificar concentraciones desconocidas FST en las muestras indicadas. células SKOV3 se transfectaron como antes, ya sea para la sobreexpresión BRCA1 (B) o para la subexpresión BRCA1 (C), y los ensayos de FST (véase métodos) se realizaron con el medio de cultivo diluido. El mismo ensayo FST se realizó con los clones estables desde el punto (D), así como con las células estables donde la expresión de los genes BRCA1 fue atropellado por BRCA1-siRNA (E-F). Las barras de error son SEM. * P & lt; 0,05 (en relación con cada uno de control).