Extracto
Los adenovirus (Ads) con supresión de
E1b55K preferentemente
replican en el cáncer las células y se han utilizado en terapias contra el cáncer. Hemos demostrado anteriormente que la proteína Ad E1B55K está implicada en la inducción de la ciclina E para la replicación de AD, pero esta función no es necesaria E1B55K en las células cancerosas en las que se observa con frecuencia la desregulación de la ciclina E. En este estudio, se investigó la interacción de la ciclina E y CDK2 en células infectadas con Ad. la infección con Ad aumentó significativamente la gran forma de ciclina E (ciclina EL), promovido ciclina E /CDK2 y la formación del complejo CDK2 aumento de la fosforilación en el sitio de T160. CDK2 activado causó la fosforilación de pRb en el sitio S612. La represión de la actividad de CDK2 con la roscovitina inhibidor químico o con pequeños RNAs de interferencia específicos disminuyó significativamente la fosforilación de pRb, con la represión concomitante de la replicación viral. Nuestros resultados sugieren que la ciclina Ad inducida por E activa CDK2 que se dirige el represor transcripcional pRb para generar un entorno celular para la replicación productiva viral. Este estudio revela una nueva base molecular para la replicación oncolítico de
E1b
-eliminado Anuncios y ayudará en el desarrollo de nuevas estrategias para Ad virotherapies oncolíticos
Visto:. Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) Bases moleculares de la replicación viral selectiva en células de cáncer: La activación de CDK2 por inducida por adenovirus ciclina E. PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10.1371 /journal.pone.0057340
Editor: Yi Li, Wuhan Instituto de Bioingeniería, China
Recibido: 3 de octubre de 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 20 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01 CA129975 (de HSZ http://www.nih.gov/). APS es apoyado en parte por la Beca K. C. Huang de la Universidad de Louisville (http://louisville.edu/medschool/pharmacology). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los adenovirus humanos (ADS) son virus de ADN lineal de doble cadena que son capaces de infectar y replicarse en una amplia variedad de tipos de células
in vitro
y
in vivo
, incluyendo las células post-mitóticas. Después de la infección, las primeras proteínas virales interactúan con factores celulares para crear un entorno favorable para la replicación viral [1]. El anuncio
E1
región contiene dos conjuntos de genes,
E1a
y
E1b
, que están dedicados al control del ciclo celular, la inhibición de apoptosis, y la regulación de genes celulares y virales [ ,,,0],2]. Los anuncios con
E1
modificaciones que preferentemente se replican en las células de cáncer se han utilizado para la terapia génica del cáncer.
El viral
E1a
gen se expresa inmediatamente después de la infección. La función principal de
E1a
productos génicos es para regular la expresión de múltiples genes celulares y virales [1]. En lugar de unirse directamente a secuencias específicas de ADN en los elementos de regulación transcripcional, proteínas E1A interactuar con varios reguladores clave de la proliferación celular [3], [4]. Los factores celulares conocidas a las que se unen las proteínas E1A son productos del retinoblastoma (
Rb
) de genes y sus genes relacionados estructuralmente,
p107
y
p130
[5] , [6]. Secuestrando la proteína retinoblastoma (pRb), E1A activa proteínas E2F regulador de la transcripción. Los estudios han sugerido que el /complejo E2F pRb reprime activamente la transcripción de genes diana y media G
1 detención provocada por p19 (ARF), p53, p16INK4a, TGF beta, o el contacto celular [7] - [9]. Recientemente Pelka
et al.
(2011) indicaron que E1A se puede unir directamente a los complejos de E2F /DP mediante la interacción con DP-1, lo que resulta en la activación de la expresión del gen E2F-sensible independientemente de la unión a pRb [10] . Varios grupos han demostrado que la expresión de
E1a
gen provoca la acumulación de la proteína p53 y p53 dependiente de la apoptosis [11], [12], ya sea mediante la activación de la transcripción de p53 o la prevención de p53 de ser degradados por el proteasoma [11] - [14]
Ad E1B55K se ha demostrado en algunos estudios para contrarrestar la estabilización E1A inducida por p53 [11], [15].. proteína E1B55K puede inhibir las funciones de p53 a través de al menos tres mecanismos distintos. E1B55K informes, se une el extremo amino terminal de p53 [16], y esta unión puede reprimir la activación transcripcional de p53, como se sugiere en los ensayos de transcripción [17] y los estudios de transfección transitoria [18]. E1B55K también puede interferir con la función de p53 mediante la cooperación con la proteína E4orf6 viral para causar la degradación proteolítica de la proteína p53 [19] - [21]. Un estudio reciente ha demostrado que E1B55K funciones solamente como una ligasa SUMO1-p53 E3 que interactúa con cuerpos nucleares de leucemia promielocítica para inactivar p53 y estimular su exportación nuclear [22]. De esta manera, E1B55K bloquea la expresión de los genes regulados por p53 y, en consecuencia, contrarresta la apoptosis dependiente de p53 inducida por el E1A, lo que permite la replicación viral eficiente [16], [17].
anuncio
dl
1520 (ONYX-015) contiene una deleción de 827 pb y una mutación puntual la generación de un codón de parada prematuro en la secuencia de codificación de E1B55K, la prevención de la expresión del gen [23]. Originalmente se propuso que el
E1b55K
-eliminado anuncios podrían replicarse sólo en las células tumorales deficientes en p53, como la degradación mediada por E1B55K de la proteína p53 no era necesario en aquellas células del cáncer [24], [25].
E1b55K
-eliminado Anuncios oncolíticos han sido probados en ensayos clínicos en humanos y están siendo comercializados para el tratamiento del cáncer en China después de aprobado por la Administración de China Estatal de Alimentos y Medicamentos (SFDA) [26]. Sin embargo, la hipótesis original fue cuestionada por varios estudios que muestran que
E1b55K
-eliminado Anuncios son capaces de replicarse en las células, independientemente de su estado de p53 [27] - [30]. Otros estudios han demostrado que la acumulación de proteína p53, después de la infección con anuncios que porta mutado
E1b55K
genes que no son capaces de reprimir p53, no puede ni eficiente ni inducir apoptosis transcriptionally activar la expresión de genes sensible a p53 en infectado-Ad las células [31], [32]. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el bloqueo de la actividad de p53 por la proteína E1B55K es poco probable que sea el principal requisito para la replicación viral. El mecanismo (s) de
E1b55K
-eliminado la replicación viral en las células del cáncer aún no está establecido, a pesar de que los vectores que ya se han aplicado en la clínica para el tratamiento del cáncer humano [26].
anteriormente, hemos demostrado que Ad E1B55K está implicado en la inducción de los genes relacionados con el ciclo celular, incluyendo la ciclina e y CDC25A [33]. Ad E1B55K media la gran forma de la proteína ciclina E de inducción (ciclina EL) en las células infectadas con Ad [34]. Ciclina E y la gran forma de ciclina EL se generan a partir del splicing alternativo. La traducción de ciclina EL se inicia en un codón ATG situado en el exón 2 y ciclina E es del codón ATG en el exón 3 [35]. Se requiere que la función de E1B55K para ciclina EL inducción en las células normales, pero no se requiere en las células cancerosas con la ciclina E. desregulado El no poder inducir eficazmente ciclina expresión EL en las células normales, la replicación de
E1b55K
-eliminado Anuncios oncolíticos está restringido. Sin embargo,
E1b55K
-eliminado Anuncios oncolíticos pueden inducir eficazmente ciclina EL en las células cancerosas y llevar a cabo la replicación suficiente oncolítico. Hemos propuesto que la ciclina E desregulación en las células cancerosas puede ser una importante base molecular para la replicación oncolítico selectivo de
E1b55K
-eliminado Anuncios [34].
ciclina E regula la progresión del ciclo celular, la replicación del ADN [36], [37], y la duplicación del centrosoma [38], [39]. La expresión de ciclina E está estrictamente controlada en las células normales. El nivel de ciclina E se eleva a finales de G
1 fase, picos en el G
1 /S fase para promover la entrada en fase S, y disminuye a partir de entonces [35], [40]. La desregulación de la ciclina E se detecta con frecuencia en muchos tipos de cáncer, como la amplificación del gen de ciclina E [41], la sobreexpresión de ciclina E mRNA o los niveles de proteína [42], [43], disminución del volumen de negocios ciclina E [44], y la presencia formas de más activos de la ciclina E [45] - [47]. sobreexpresión constitutiva de la ciclina E ha demostrado inducir inestabilidad cromosómica y poner en peligro la progresión del ciclo celular normal [48], [49]. La hipótesis de que la expresión anormal de la ciclina E puede provocar tumores también ha sido apoyado por estudios en animales transgénicos [50] - [52].
Una de las funciones de la ciclina E es unirse y activar la quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2) [53]. El complejo de ciclina E /CDK2 fosforila sustratos tales como pRb y conduce a la activación transcripcional de genes aguas abajo. Los estudios también indican que la ciclina E tiene funciones CDK2-independiente [54], [55].
In vivo
estudios en animales indican variación entre los fenotipos de nula ciclina E (ciclina E1
- /- E2
- /-) ratones y nula CDK2 (CDK2
- /-) ratones . Los ratones que carecen de CDK2 son viables, con el desarrollo normal excepto desarrollo de células germinales defectuosa [56], [57]; sin embargo octavos de final de ciclina E1 y E2 genes en ratones causa letalidad embrionaria debido a la deficiencia en endoreplication de las células y megacariocitos [58] gigantes trofoblasto. Matsumoto
et al.
(2004) identificó un dominio de señal de localización centrosómicas (CLS) de ciclina E [59]. Este dominio permite CLS ciclina E para orientar el centrosoma y promover la entrada en la fase S de una manera CDK2-independiente. Además, Geng
et al.
(2007) demostró que una quinasa mutante deficiente (KD-E) de ciclina E es capaz de restaurar parcialmente la proteína de mantenimiento minichromosome (MCM) entrada en la fase de carga y S en células nulas ciclina E [54]. Por lo tanto, la ciclina E tiene CDK2-dependiente y funciones independientes de entrada en la fase S y la replicación del ADN. Una cuestión importante es si Ad-inducida ciclina E puede activar CDK2 y ciclina si la interacción E-CDK2 puede jugar un papel crucial en la replicación de AD. Esta cuestión es especialmente importante en el desarrollo de estrategias virotherapy oncolíticos.
Presentamos aquí que la ciclina E Ad-inducida se une y activa con CDK2 que se dirige la transcripción represor PRB, que a su vez puede regular la expresión de los genes celulares y virales . Los resultados sugieren que la interacción entre la ciclina Ad-inducida E y CDK2 es generar un entorno adecuado para la replicación productiva del anuncio.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
HEK 293 (ATCC no. CRL-1573), humano de fibroblastos de pulmón WI-38 (ATCC no. CCL-75), y de pulmón humano A549 cáncer (ATCC no. CCL-185) las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Americana Collection (Rockville, MD). WI-38 células se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) alfa GlutaMAX con 0,1 aminoácidos no esenciales mM y piruvato de sodio 1,0 mM. HEK 293 y A549 células fueron cultivadas en medio esencial mínimo alfa. Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina /estreptomicina (100 U /ml). Las células fueron cultivadas en un 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C. Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Gibco BRL (Bethesda, MD).
Los vectores adenovirales
de tipo salvaje adenovirus tipo 5 (Adwt, ATCC no. VR-5) se utilizó como una replicación -competent de control. AdCMV /GFP, un vector de Ad con E1 deleción que lleva una proteína fluorescente verde (GFP), se utilizó como un control defectuoso en la replicación. Adhz63, un vector de Ad oncolítico con la supresión de
E1b55K
región, fue construido por nuestro laboratorio [60].
La infección viral y la titulación
Las células fueron sembradas en 6- y placas a una densidad de 2,5 × 10
5 (células /pocillo) y se cultivaron en las condiciones indicadas. Posteriormente, las células fueron maqueta infectado o infectado con AdGFP, Adwt o Adhz63 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. citopático efecto (CPE) se observó en los puntos de tiempo diseñados y se fotografiaron con un microscopio invertido (Olympus CKX41). Se recogieron las células infectadas totales y los sobrenadantes de cultivo a las 48 h después de la infección (p.i.) y se lisan para liberar las partículas de virus con tres ciclos de congelación y descongelación. Los títulos virales se determinaron por el método de la unidad infecciosa como se ha descrito anteriormente [61], [62]. Brevemente, las células HEK 293 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10
3 (células /pocillo) y después se infectaron con 5 veces los virus diluidos en serie. CPE se registró y se obtuvo después de la incubación durante 7 días. El porcentaje de reducción en el título de virus se calcula por la fórmula,% de reducción = [(título de grupo de control - título de grupo experimental) /título de grupo de control]. × 100%
ADN Viral ensayo de síntesis de
Después de la infección viral, las células fueron recolectadas en diferentes puntos temporales. La síntesis de ADN viral se determinó con Southern blot; 1 g de ADN genómico aislado se digirió con la enzima de restricción
Pst
I y se analizaron con gel de agarosa al 1%, que se transblotted posteriormente a un Hybond-N + membrana (YA3609; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . La sonda se preparó mediante digestión de 0,5 mg pBHGE3 [63] con
Pst I y
etiquetado siguiendo el protocolo de Amersham AlkPhos etiquetado directo y sistemas de detección (RPN 3690; GE Healthcare, Piscataway, NJ). La transferencia se prehibridó durante 3 horas a 63 ° C. Los lavados de hibridación y de astringencia se realizaron a 55 ° C y seguido por la detección quimioluminiscente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
análisis de transferencia de Western
se recogieron las células infectadas en los puntos de tiempo indicados y se lisaron con CDK2 tampón de lisis (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl 5 mM
2, 0,5% Nonidet P-40, 0,1% de Brij 35, glicerofosfato de sodio 5 mM, vanadato de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM). Los análisis de transferencia de Western se realizaron como se describe anteriormente [64]. En resumen, 80 g de lisados de células se sometieron a electroforesis a través de 12% en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron de conejo E anti-ciclina (M-20), CDK4 (C-22), anti-ciclina D1 (DCS-6), PCNA (PC10), p21 de ratón (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de ratón anti-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (señalización celular, Danvers, MA), de conejo anti-fosforilados pRb (fosfo-pRb ) S612, y la actina (Sigma, St. Louis, MO), anti-fosfo-S795 pRb (New England Biolabs, Beverly, MA), y anti-fosfo-T821 pRb (Invitrogen, Carlsbad, CA). Actina se utilizó como control interno. Las membranas se incubaron con inmunoglobulina anti-ratón de G (IgG) o IgG anti-conejo de peroxidasa ligada específico de la especie de anticuerpo entero (GE Healthcare, Piscataway, NJ). detección quimioluminiscente se realizó con reactivos ECL de acuerdo con las recomendaciones del proveedor (GE Healthcare). La intensidad de la banda explorada se cuantificó por el software de Gel-Pro Analizador 4.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD) de acuerdo con el tutorial de los fabricantes. valor densitométrico de cada banda se expresó como la densidad óptica integrada (I.O.D.) y los resultados se normalizaron con la actina. Los valores finales representan las medias de variación porcentual relativa, a partir de al menos tres experimentos independientes, en comparación con el grupo de simulacro ± S.D. .. diferencia estadística se evaluó con la prueba t de Student. Un valor de p. & Lt; 0,05 se consideró significativo
inmunoprecipitación
Las células A549 se sembraron en placas de 150 mm a una densidad celular de 5 x 10
6 (células /placa) y luego-infectados de forma simulada o infectadas con AdGFP, Adwt o Adhz63 en una MOI de 5. a las 48 h pi, se recogieron las células y se lisaron con tampón de lisis CDK2 de acuerdo con el método descrito en las publicaciones anteriores [34], [65]. Los lisados celulares (500 g) se inmunoprecipitaron con ciclina E (HE111), el anticuerpo monoclonal de ratón (Santa Cruz), o anticuerpo anti-CDK2 (BD Transduction Laboratories) a 4 ° C durante 4 h, seguido de la adición de proteína A Sepharose CL- 4B (82.506; Sigma) e incubando durante la noche. Los inmunocomplejos se analizaron por Western blot con anticuerpos E y CDK2 anti-ciclina.
pequeños ARN de interferencia (siRNA) transfección
Los siRNA oligonucleótidos fueron sintetizados por Eurogentec (Fremont, CA). Tres ARNsi dúplex diferentes fueron diseñados para tratar la CDK2 en los nucleótidos 399 a 419 (# 1), 619 a 639 (# 2), y 691 a 711 (# 3) de acuerdo con la adhesión GenBank NM001798.2 (Centro Nacional de Información de Biotecnología GenBank) . Un dúplex de ARNsi de control negativo que contiene dos cadenas de 19 bases de ARN complementarias con voladizos 3'dTdT se obtuvo de Eurogentec (SR-CL000-005). Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 10
5 (células /pocillo) y luego se transfectaron con 200 dúplex nM CDK2 siRNA o un dúplex de siRNA de control no específica con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron a las 48 h después de la transfección. Ochenta g de lisados celulares se analizaron por Western blot con CDK2, pCDK2 T160, pRb, pRb fosforilada (p-PRB), ciclina E, proteínas de la cápside, y anticuerpos de actina.
Todos los experimentos anteriores, excepto cuando se indique específicamente, se repitieron al menos tres veces.
Resultados
ciclina e /CDK2 complejo formado en las células infectadas con adenovirus
Hemos establecido previamente el vínculo entre la ciclina e y la replicación de los adenovirus [33], [34]. Los datos mostrados en la Figura 1 recapitulate que Ad E1B55K participa en la inducción de la forma grande de la proteína ciclina E (ciclina EL), lo que contribuye a la replicación viral eficiente. Ciclina E y la ciclina EL se generan a partir de empalme alternativos con diferentes codones de inicio ATG en los exones 2 y 3 [35]. El terminal N de la ciclina inducida por el virus-EL es 15 aminoácidos más larga que la de la proteína ciclina E. proteína ciclina E se expresa constitutivamente en células de cáncer de pulmón humano A549 [34]. De tipo salvaje Ad5 (Adwt), con la intacta
E1b55K
región, inducida significativa ciclina EL de expresión en ambos de WI-38 células de fibroblastos de pulmón humano y células de cáncer de pulmón humano A549 (Fig. 1A, carriles 2 y 5 ), y causó efecto citopático eficiente (CPE) (Fig. 1B, paneles B y e). Ad vector Adhz63 con
E1b55K
-deletion [60] también inducida significativa ciclina EL en células A549 (Fig. 1A, carril 6) y causada CPE eficiente de las células (Fig. 1B, panel C). Sin embargo, el vector de no inducir ciclina EL sobreexpresión en células WI-38 (Fig. 1A, carril 3) y su CPE (Fig. 1B, el panel f). Para comparar la replicación de Adwt y Adhz63 en A549 y las células WI-38, se determinaron los títulos de estos dos virus. La replicación Adhz63 fue fuertemente reprimida en las células WI-38, que muestra sólo el 10% de la replicación relativa en comparación con Adwt (Fig. 1C). Cuando comparamos la replicación Adhz63 con la de Adwt en células A549, en consonancia con los resultados de CPE, se observó 80% de la replicación relativa de Adhz63. Por lo tanto, la replicación Adhz63 es más reprimida en las células WI-38 que en las células A549. El resultado es coherente con nuestra observación anterior de que la ciclina EL inducción en las células cancerosas está conectado con la replicación selectiva de
E1b55K
-eliminado Anuncios en células de cáncer [34].
WI-38 o A549 células fueron infectadas con AdGFP, Adwt o Adhz63 en una MOI de 5. Las células (a) se recogieron a las 48 h y luego se analizaron por Western blot. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para la ciclina E y actina. Actina se utilizó como control de carga. (B) CPE fue fotografiado a 72 h después de la infección (p.i.). Todo microscopía fue originalmente con un aumento de x100. (C) Los títulos virales se determinaron a 72 h p.i. con el método de la unidad infección. El valor indica la media de tres experimentos independientes, se muestra como el cambio porcentual medio relativo al grupo de control Adwt ± S. D. * P & lt;. 0,05 en comparación con el grupo Adwt, de Student
t-test
La ciclina E puede promover la entrada en la fase S y participar en la replicación del ADN a través de CDK2 dependientes [53] y las vías de CDK2-independiente [59]. Para estudiar si la función de ciclina E en la replicación del anuncio es CDK2 dependientes o independientes, primero tratamos de investigar el contacto físico entre CDK2 y ciclina EL en las células afectadas por el anuncio. A549 células de cáncer de pulmón eran maqueta infectado o infectado con AdGFP, Adwt o Adhz63. Para entender cómo
E1b
-eliminado Anuncios replican selectivamente en las células cancerosas, nos centramos en las células de cáncer de pulmón A549 en el que tanto Adwt y el
E1b
-eliminado Adhz63 puede inducir eficazmente ciclina EL y se replican. A las 48 h post-infección (p.i.), se recogieron y se lisaron las células. Hemos utilizado por primera anticuerpo anti-ciclina E para inmunoprecipitar la proteína ciclina E y analizaron los inmunocomplejos con Western blot. Los datos muestran que la proteína ciclina E se precipitó a partir de células tratadas mock o tratados con AdGFP de replicación defectuosa (controles negativos) no mostraron asociación significativa con la proteína CDK2 (Fig. 2A, carriles 1 y 2). Sin embargo, los inmunocomplejos de Adwt- y células A549 infectadas con Adhz63 contenían tanto la ciclina E y la ciclina EL con un aumento de la unión CDK2 (Fig. 2A, carriles 3 y 4). Para verificar esta unión de ciclina E /CDK2, que también se utiliza anticuerpo anti-CDK2 para tirar hacia abajo el complejo de proteínas y, a continuación examinamos el nivel de proteínas de ciclina E en el complejo ciclina E-CDK2. La proteína inmunoprecipitada CDK2 se incrementó en Adwt y células Adhz63-infectado con un precipitación concomitante de ciclina EL (Fig. 2B, carriles 3 y 4), especialmente para las células infectadas con Adwt (carril 3). Los resultados muestran que competente para la replicación Adwt y Adhz63 inducen ciclina EL expresión y aumentan la formación de ciclina EL complejo /CDK2 en células de cáncer A549, lo que indica que la ciclina EL inducida en las células infectadas con Ad asocia fuertemente con CDK2.
(a) de lisados de células A549 se inmunoprecipitaron con anticuerpo E anti-ciclina (dilución 1:50). Los inmunocomplejos se analizaron por Western blot con anticuerpos ciclina E y CDK2. (B) Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CDK2 y a inmunotransferencia para CDK2, ciclina E y la ciclina EL.
ciclina inducida por Adenovirus EL aumenta la fosforilación de CDK2
se activa
CDK2 por la fosforilación en el sitio de T160 y esta fosforilación aumenta su movilidad electroforética, dando como resultado bandas más rápido que migran [66]. Hemos investigado si la ciclina EL inducción y el aumento de la interacción entre la ciclina EL y CDK2 en células A549 después de la infección y Adwt Adhz63 pueden promover la fosforilación de CDK2 en el sitio T160 específica. El análisis de los lisados de células con transferencia Western demostró que la ciclina EL inducción condujo a un aumento de la CDK2 más rápido-migración, consistente con la proteína fosforilada-CDK2 (pCDK2) T160 (la forma activa de CDK2), especialmente a las 48 h p.i. (Fig. 3A, carriles 7 y 8). Verificamos la forma más rápida migración de CDK2 con fosfo-CDK2 anticuerpo (T160) (# 2561, La señalización celular). El análisis densitométrico de estas bandas demostró que la infección por Adwt causó un 1.3 a 2.7 veces aumento (P = 0,03) en el nivel de pCDK2 T160 y la infección Adhz63 provocó un 1,5 a un aumento de 1,9 veces (P = 0,0026) en comparación con el control simulado grupo a las 48 h pi (Fig. 3B, carriles 3 y 4). El resultado en la figura 3B es consistente con la de la figura 3A (carriles 7 y 8).
células A549 fueron falsamente infectadas o infectadas con AdGFP, Adwt o Adhz63 en una MOI de 5. Las células se recogieron en 24 h o 48 h pi y después se analizaron por Western blot. Los lisados celulares se inmunotransfirieron para (A) de ciclina E y CDK2; (B) pCDK2 T160; y (C) de ciclina D, CDK4 y PCNA. Actina se utilizó como control de carga. La intensidad de las bandas se cuantificó escaneada y los valores representan las medias de los porcentajes cambio relativo en comparación con el grupo de simulacro ± S. D. de tres experimentos por triplicado independientes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el grupo de control de simulacro, la prueba t de Student
Además de la ciclina E, ciclina D está también involucrado en la transición del G
1-S fase . Por lo tanto, también se examinó el nivel de ciclina D. Curiosamente, el nivel de ciclina D se redujo después de la infección viral. El análisis densitométrico de las bandas demostró que Adwt y Adhz63 infección a las 24 h se redujo la proteína ciclina D a los niveles de 11% (P = 0,0000025) y 71% (P = 0,001) de la infección simulada, respectivamente (Fig. 3C, calles 3 y 4). Los niveles de ciclina D en células infectadas con Adwt o Adhz63 se redujeron aún más a las 48 h a 3% (P = 0.00000043) y 8% (P = 0,00002), respectivamente (Fig. 3C, carriles 7 y 8). Mientras tanto, el nivel de CDK4 y el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) no cambió significativamente en ninguno de los grupos. CDK4 se regula y se activa mediante la ciclina D para procesar el G
1-S transición [67], [68]; PCNA, conocido para regular la replicación del ADN y la reparación del ADN, se asocia con múltiples complejos de ciclina /CDK en la progresión del ciclo celular [69], [70]. Los resultados muestran que los anuncios disminución en la producción de ciclina D y no afectó los niveles de CDK4. ciclina Por lo tanto, la infección con Ad específicamente inducida EL que activó CDK2 través de la fosforilación en su sitio T160, lo que sugiere un papel crítico de la ciclina CDK2 EL y en la replicación del anuncio.
Los adenovirus aumento de la fosforilación de pRb
La ciclina E- CDK2 fosforilada activado (pCDK2) es conocido para controlar el G
1-S transición por la fosforilación de los sustratos aguas abajo. Teniendo en cuenta que pRb es uno de los objetivos bien conocidos para pCDK2, examinamos si el aumento de pCDK2 activado altera la fosforilación de pRb en S612, que es un residuo preferido CDK2-fosforilación [71], [72]. Se encontró que el nivel de fosfo-pRb S612 se aumentó a 314% (P = 0,016) y 240% (P = 0,03) en las células infectadas con Adwt y Adhz63, respectivamente, a pesar de que el nivel de proteína de no fosforilado pRb se reduce ligeramente ( la Fig. 4A, carriles 3 y 4). No hemos podido detectar cualquier cambio significativo de p-pRb T821, otro residuo de fosforilación preferido CDK2 [71], [73], y el preferido CDK4-p-S795 pRb [74] (Fig. 4A). Los resultados sugieren la selección del sitio S612 en pRb por CDK2-activado anuncio de la fosforilación de proteínas.
Las células A549 se infectaron-simulada o infectadas con AdGFP, Adwt o Adhz63 y se recogieron a las 24 h o 48 h pi , seguido por análisis de transferencia Western. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para (A) PRB, fosfo-pRb (p-PRB) en S612, T821 y S795 o p21 (B) y p27. Actina se utilizó como control de carga. * P & lt; 0,05 en comparación con el grupo de control de simulacro, la prueba t de Student
Los adenovirus reprimir CDK inhibidores
También se observó que los niveles de proteína de p21 y p27 tanto disminuyen. en células A549 infectadas con Adwt y Adhz63, especialmente para p21 (Fig 4B). p21 y p27 son los inhibidores de CDK conocidos, que regulan negativamente la actividad de los complejos ciclina E /CDK2 para prevenir la progresión del ciclo celular [75]. El análisis densitométrico de estas bandas demostró que el nivel de proteína p21 se redujo a los niveles de 8% (P = 0,0000002) y 44% (P = 0,00066) del control simulado en las células A549 después de la infección con Adwt y Adhz63 a las 24 h, respectivamente (Fig. 4B, carriles 3 y 4). El nivel de p21 fue reprimida más en células A549 a las 48 h después de la infección con Adwt (2%, P = 0.00000034) y Adhz63 (6%, P = 0,0000007) (Fig. 4B, carriles 7 y 8). la infección con Ad también disminuyó los niveles de proteína p27 a 36% (Adwt, P = 0,0015) y 49% (Adhz63, P = 0.00043) a las 24 h; 16% (Adwt, P = 0,00012) y 37% (Adhz63, P = 0,0092) a las 48 h en células A549 (Fig. 4B). Los resultados sugieren que los anuncios de activar la CDK2 mediante la inducción de la ciclina EL y la represión de p21 y p27.
Interrupción de la ciclina CDK2 EL y la interacción reduce la replicación adenoviral
Para investigar más a fondo el papel de CDK2 en la replicación viral , se utilizó la roscovitina inhibidor químico CDK2 (Ros; CYC202) para interrumpir la ciclina CDK2 y la interacción eL. Ros es un derivado de purina que inhibe la actividad de CDK2 mediante la unión a su sitio activo [76]. Ros reduce la fosforilación de CDK2 [77] y para el aumento de la androstenediona inducida de CDK2 fosforilada activa [78]. Si se requiere la activación de CDK2 para la replicación viral, bloqueo de la actividad CDK2 debe reducirlo. La Figura 5A, que representa uno de los cuatro experimentos repetidos, muestra que con el aumento de Ros, CPE causada por la infección Adwt y Adhz63 era parcialmente inhibido. La Figura 5B muestra que el tratamiento con 5 M de Ros condujo a una reducción del 50% en Adwt título (P = 0,0002) y la reducción de 71% en Adhz63 título (P = 0,034) en comparación con el grupo de control de vehículo tratado con sulfóxido de dimetilo (DMSO , definida como 0 M Ros). El tratamiento con 10 mM Ros llevó a más reducciones de los títulos virales: reducción del 81% en Adwt (p = 0,00001) y la reducción del 87% en Adhz63 (P = 0,012). Los rendimientos virales reprimidos son consistentes con el fenómeno de CPE en la Figura 5A
.
Las células (A) se trataron con 0 mM (grupo de control de vehículo tratado con DMSO), 5 m, o 10 mM roscovitina, y maqueta infectadas o infectadas con AdGFP, Adwt o Adhz63 en una MOI de 5. Toda la microscopía es originalmente con una ampliación de x100 tomada a las 48 h pi (B) Los títulos virales se determinaron a 48 h p.i. con el método de la unidad infección. Los valores representan las medias ± S. D. de cuadruplicado independiente. * P & lt; 0,05 en comparación con la roscovitina 0 M, Estudiante de
t-test
A continuación, examinamos los niveles de ADN viral y las proteínas producidas en células afectadas por el tratamiento Ros.. La síntesis de ADN viral se determinó mediante transferencia de Southern sondada con el genoma Ad. El ADN lineal es Adwt 36Kb con total de 28
Pst
sitios de restricción. El fragmento más grande es de 4333 pb y el fragmento más pequeño es de sólo 12 pb. Los tamaños de los fragmentos de ADN representativas fueron marcados en la Figura 6. La síntesis de ADN viral de Adwt y Adhz63 a las 24 h p.i. se inhibió en presencia de 10 mM Ros (Fig. 6A, carriles 6 y 12). En consonancia, las proteínas de la cápside viral se inhibieron significativamente en presencia de 10 mM Ros (Fig. 6B, carriles 4 y 6). La inhibición de la actividad CDK2 con Ros reduce la fosforilación de pRb en el sitio de S612 en AdGFP, Adwt y las células tratadas con Adhz63 (Fig. 6C). Curiosamente, el tratamiento Ros reprimió notablemente la inducción de la proteína ciclina EL causada por Adwt y la infección Adhz63 (Fig. 6C, carriles 4 y 6). En resumen, estos datos muestran que la inhibición de CDK2 con Ros reprimió la fosforilación de pRb y la replicación viral inhibido.
(A) se recogieron las células A549 a las 0 h y 24 h p.i. la síntesis de ADN viral se determinó por transferencia de Southern. A las 24 h p.i., se recogieron las células y lisados celulares se inmunotransfirieron para (B) de tipo adenovirus 5 proteínas de la cápside, (C) de ciclina EL, p-pRb S612, y la actina. Actina se utilizó como control de carga. * P & lt;. 0,05 en comparación con el grupo de 0 M roscovitina tratados, la prueba t de Student
siRNA inhibición de CDK2 reprime la replicación adenoviral mediante la prevención de la fosforilación de pRb
Desde el inhibidor químico puede Ros también influyen otros CDK y quinasas [79], también se aplica la interferencia de ARN para silenciar específicamente la expresión de CDK2.