Extracto
Se ha evidenciado la isotiocianato (ITC) sulforafano (SFN) a niveles bajos (1-5 m) para promover la proliferación celular a 120-143% de los controles en una serie de líneas de células humanas, mientras que a niveles altos (10-40 M) inhibió la proliferación celular tales. Se observaron respuestas similares de dosis para la migración celular, es decir SFN a 2,5 M aumento de la migración celular en las células T24 del cáncer de vejiga al 128%, mientras que los niveles altos inhibieron la migración celular. Esta acción hormetic también se encontró en un ensayo de angiogénesis donde SFN en 2,5 M formación de tubo endotelial promovido (118% del control), mientras que a 10-20 M causó una inhibición significativa. El mecanismo exacto por el cual SFN influye en la promoción del crecimiento celular y la migración no se conoce, pero probablemente implica la activación de la autofagia, ya que un inhibidor de la autofagia, 3-metiladenina, abolió el efecto de la SFN sobre la migración celular. Por otra parte, las dosis bajas de SFN ofrecen un efecto protector contra los radicales libres de la muerte mediada por células, un efecto que fue mejorada por co-tratamiento con selenio. Estos resultados sugieren que SFN puede prevenir o promover el crecimiento de células tumorales en función de la dosis y de la naturaleza de las células diana. En las células normales, la promoción del crecimiento celular puede ser de beneficio, pero en células de cáncer transformadas o puede ser un factor de riesgo indeseable. En resumen, las TIC tienen un efecto bifásico sobre el crecimiento celular y la migración. Los beneficios y riesgos de las TIC no sólo están determinadas por las dosis, pero se ven afectados por las interacciones con Se y el efecto que se mida
Visto:. Bao Y, W Wang, Zhou Z, C Sun (2014) y Beneficios los riesgos de los efectos de hormético los isotiocianatos de la dieta en la prevención del cáncer. PLoS ONE 9 (12): e114764. doi: 10.1371 /journal.pone.0114764
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 1, 2014; Aceptado: 13 Noviembre 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Bao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF Nº 81.128.011) y un premio de la Prevención del Cáncer Research Trust, Reino Reino. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El término "hormesis" se utiliza a menudo por los toxicólogos para referirse a una "dosis-respuesta bifásica a un agente ambiental que se caracteriza por la estimulación de baja dosis y alta dosis de inhibidor o efecto tóxico '[1], [2]. El concepto de hormesis es la relación dosis-respuesta más fundamental en la biomédica, la nutrición y ciencias toxicológicos [1]. En una revisión exhaustiva, Calabrese proporcionó evidencia de que más de un centenar de agentes antitumorales aumentaron la proliferación de células tumorales humanas a dosis bajas de una manera totalmente consistente con la relación dosis-respuesta hormético [2]. Una de las características interesantes de este tipo de dosis-respuesta fue que se produjo en la mayoría de tipos de células tumorales y son independientes de los órganos. Los resultados recientes sugieren que algunos fitoquímicos exhiben respuestas a la dosis bifásica en las células con dosis bajas activación de vías de señalización que dan lugar a una mayor expresión de genes que codifican proteínas citoprotectores y enzimas antioxidantes [3]. Los compuestos dietéticos hormetic identificados hasta la fecha incluyen resveratrol, galato de epigalocatequina (EGCG), la curcumina, quercetina, la alicina, la capsaicina, el ácido carnósico y el sulforafano (SFN) [4] - [8]. Desde una perspectiva evolutiva, las propiedades nocivas de fitoquímicos tienen un importante papel protector para disuadir a los insectos y los hongos de las plantas dañinas. Sin embargo, las dosis relativamente pequeñas de fitoquímicos ingeridos por los seres humanos que consumen estas plantas no son tóxicos y en su lugar inducen respuestas de estrés celular leves. Este fenómeno ha sido ampliamente descrito como "hormesis" o dosis-respuesta adaptativa en los campos de la biología y la medicina [4], [9], [10].
El isotiocianato (ITC), SFN (4-methylsulfinylbutylisothiocyanate ), fue aislado por primera vez de la consumida comúnmente verdura crucífera, el brócoli y es uno de los más potentes inductores de origen natural de la proteína asociada a la ECH Kelch tipo 1 (Keap1) Factor NUCLEAR eritroide 2 relacionada con el factor 2 (Nrf2) -antioxidant elementos de respuesta (ARE) vía [11]. La inducción de Nrf2 protege a las células normales de radicales libres estrés oxidativo mediado a través de la regulación positiva de genes quimioprotectores, y la acción de SFN se basa en su capacidad para inducir una reductasa Nrf2 impulsada quinona enzima (NQO1) [12]. En los 20 años posteriores a su descubrimiento, los efectos protectores de SFN se han demostrado en varios sistemas de cultivo de células y modelos animales, con el resultado de que SFN es con mucho el más ampliamente estudiado ITC de verduras crucíferas. Los mecanismos anti-cancerígenos de las TIC también han sido bien documentados, incluyendo la regulación de enzimas de fase II de desintoxicación, anti-inflamación, la promoción de la detención del ciclo celular y la apoptosis [13] - [17]. Durante la última década, Keap1-Nrf2-ARE se ha considerado como una vía crítica anti-cáncer en la quimioprevención [18] - [20]. Sin embargo, más recientemente, ha habido algunos informes deletéreos de Nrf2, incluyendo la promoción del crecimiento de células tumorales y la quimiorresistencia [21] - [25]. Con el fin de sobrevivir, las células cancerosas pueden secuestrar la vía Nrf2, que regula al alza una batería de enzimas antioxidantes, manteniendo así un equilibrio redox favorables para la adquisición de propiedades malignas [26]. La sobreexpresión de Nrf2 podría aumentar la proliferación celular y causar resistencia a los productos quimioterapéuticos en algunos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón y páncreas humano [27], [28]. Unas investigaciones anteriores han demostrado que exhibe una SFN efectos dependientes de la dosis sobre la proliferación celular en líneas celulares tumorales cultivadas y las células normales, incluyendo células madre mesenquimales humanas [29] - [31]. En el presente estudio, mostramos que la SFN exhibió una respuesta a la dosis hormético sobre el crecimiento celular, la migración y la angiogénesis. Si el efecto hormetic es beneficiosa o perjudicial depende del punto final seleccionado y /o la naturaleza de las células (normal o tumor). Aunque la hormesis término es empleado por toxicólogos para describir una respuesta a la dosis en forma de campana, que se caracteriza por un efecto beneficioso a dosis bajas y una actividad tóxica (o inhibidor) en dosis altas, esta expresión de beneficio dosis baja podría no ser cierto para el efecto de las TIC en la quimioprevención del cáncer. Desde hormesis muestra poca selectividad, los efectos biológicos de ITC sobre las células normales y las células tumorales serán diferentes. Desde esta perspectiva, un efecto de dosis bajas de las TIC en la promoción de la proliferación de células tumorales y la migración en modelos animales debe evaluarse con prudencia. Por lo tanto, una estrategia precisa que tiene como objetivo optimizar los efectos beneficiosos y minimizar el riesgo de las TIC debe ser desarrollado con cuidado en relación con la prevención y el tratamiento del cáncer.
Resultados
Efectos de las TIC sobre el crecimiento celular
Debido a la naturaleza de la respuesta a la dosis hormetic, no hay selectividad de las TIC sobre el crecimiento celular, por lo que es probable que las TIC pueden promover el crecimiento de células tumorales a dosis bajas. En varios
in vitro
estudios de cultivo celular, se ha demostrado que las concentraciones bajas de SFN para promover el crecimiento de las células tumorales, pero no se proporcionaron discusión detallada o sugerencias para estudios de seguimiento para investigar los mecanismos de [32] - [34 ]. A bajas concentraciones, las ECI se ha demostrado que induce la proliferación y /o proteger las células contra un agente tóxico, H
2O
2, en células Caco-2 [30] y en los hepatocitos [29]. Higo. 1A muestra los efectos de la SFN sobre el crecimiento celular, con dosis más bajas (1-5 M) que promueven el crecimiento de células (20 a 43% mayor que la de control) y dosis altas (10 a 40 m) que inhiben el crecimiento celular en una serie de células tumorales líneas, a saber, T24 del cáncer de vejiga, hepatoma HepG2, y cáncer de colon Caco-2. No se encontraron efectos de respuesta a dosis similares en líneas de células normales, incluyendo hepatocitos inmortalizado HHL-5, CCD841 epiteliales de colon y líneas celulares CCD-1092SK fibroblastos de la piel (fig. 1B).
Cuando las células crecieron hasta 70-80% de confluencia, un rango de dosis de SFN (0-160 mM) se añadieron al medio de cultivo de células durante 24-48 h. Las células de control se trataron con DMSO (0,1%), y la viabilidad celular se determinó por el ensayo de proliferación celular MTT (viabilidad celular CCD-1092SK se determinó mediante WST-1 ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante [88]). Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de al menos 5 repeticiones. La significación estadística desde el control, * p & lt; 0,05, ** p o & lt; 0,01. A: resultados de T24 del cáncer de vejiga, hepatoma HepG2, y células de cáncer de colon Caco-2. B:. Los resultados de los hepatocitos inmortalizado HHL-5, CCD841 epiteliales de colon, y las líneas celulares de fibroblastos de la piel CCD-1092SK
Efectos de SFN sobre la migración celular
Fig. 2A muestra una respuesta a la dosis en forma de campana de SFN en la migración de células de cáncer de vejiga T24. SFN a 2,5 y 3,75 M incrementó la migración de las células tumorales a 128 y un 133% en comparación con los controles correspondientes. Tal migración celular inducida por SFN se asocia con la capacidad de SFN para activar la autofagia. Cuando un inhibidor de la autofagia, 3-metiladenina (3-MA), se utilizó alivió SFN (2,5 M) la migración celular inducida por 128-26% aunque tiene menos efecto inhibidor sobre tratamientos SFN en 5 o 10 mM (Fig. 2B ). Por otra parte, 3-MA también disminuyó la migración de células no SFN tratada a 12% del control
A:. Después de inanición durante la noche, las células T24 de cáncer de vejiga fueron tratados con SFN a las concentraciones indicadas durante 24 h, migración celular se midió mediante un ensayo de migración celular usando los insertos de cultivo celular ThinCert (Greiner Bio-One Ltd.). Cada barra representa la media ± desviación estándar de 3 repeticiones. B: Efecto de pre-tratamiento de la 3-MA sobre la migración celular. DMSO (0,1% se usó como un control). La significación estadística desde el control, * p & lt; 0,05, ** p o & lt; 0,01
TIC y la activación de Nrf2
SFN es un activador de Nrf2 a través de la que puede arriba. regular más de un centenar de genes protectores, incluyendo la mayoría de antioxidantes y enzimas quimiopreventivos [11], [35]. No hay duda de que la regulación de la vía Nrf2-ARE es beneficioso en las células normales, es decir, la activación de Nrf2 y sus enzimas citoprotectores impulsados puede ser protector contra el daño oxidativo y se ha sugerido que la activación de la vía de señalización Nrf2 puede pues ser una estrategia prometedora en la prevención del cáncer [36]. Sin embargo, las TIC no tienen selectividad hacia cualquiera de las células normales o tumorales con respecto a la activación de Nrf2. Nrf2 puede ser secuestrada por las células tumorales [26], y un informe reciente sugiere que Nrf2 es un protooncogén que modula el crecimiento de las células tumorales [37]. En las células transformadas, Nrf2 puede promover el crecimiento celular o causa la quimio-resistencia [38]. En este estudio, SFN (2,5 a 10 mM) indujo niveles similares de translocación de Nrf2 al núcleo de los hepatocitos humanos normales HHL-5 (4.1 a 7.1 veces), y HepG2 de hepatoma (4.1 a 5.9 veces) células (Fig. 3) .
Nrf2 se detectó en extractos nucleares de las células expuestas a SFN (0, 2,5, 5 y 10 mM) durante 24 h, usando un ensayo de transferencia Western. Las células de control se trataron con DMSO (0,1%). A: hepatocitos humanos inmortalizada HHL-5; B:. Heptoma células HepG2 humana
Papel protector de baja dosis de tratamiento contra el daño oxidativo ITC
En los campos de la biología y la medicina, la hormesis se define como una respuesta adaptativa de las células y organismos a un estrés moderado. A estrés leve induce la activación de vías de señalización tales como Nrf2, NF-kB, Sirtuinas, FOXO, el factor inducible por hipoxia (HIF) lo que conduce a cambios intrínsecos (por ejemplo, la inducción de enzimas antioxidantes) que puede conferir resistencia al estrés más severo [4 ], [6]. Higo. 4A y 4B muestran que el pretratamiento de las células HHL-5 y MCF-7 con 5 M SFN ofreció protección contra H
2O
2 inducida por la muerte celular, es decir, la viabilidad celular se incrementó 36,6 a 63,9%; y desde el 50,3% a la de 400 el 83,7 M H
2O
2 tratamientos, respectivamente. Por otra parte, el efecto protector del tratamiento previo con SFN (2 M) en H
2O
2 inducida por la muerte celular podría ser mejorado por el cotratamiento con el selenio (Se) en HHL-5 células (Fig. 4C), es decir H
2O
2 disminución de la viabilidad celular a 34,8% en HHL-5 células, pero cuando las células se pre-trataron con SFN (2 M), o se (0,1 M) durante 24 h, la viabilidad de las células aumentó a 41,7 y 51%, respectivamente, y co-tratamiento SFN y Se aumentó la viabilidad celular a 65,5%. Este efecto protector puede estar implicado en cualquiera de quimioprotección o quimiorresistencia, dependiendo de la naturaleza de las células.
Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos. Cuando llegaron a 70-80% de confluencia, las células se trataron previamente con SFN (5 M) durante 24 h (HHL-5, A) o 48 h (MCF-7, B). El medio de cultivo celular fue reemplazado con H
2O
2 a las concentraciones indicadas durante 24 h. C: HHL-5 células se trataron previamente con SFN (2 M) y Se (0,1 M) durante 24 h antes de la exposición a H
2O
2 (400 M) durante otras 24 h. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTT. La significación estadística de los controles correspondientes: * p & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
efectos bifásicos de SFN sobre la angiogénesis
La angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos) es crucial en el desarrollo y la propagación de una variedad de cánceres humanos. Es, por lo tanto, es importante examinar los efectos anti-angiogénicos de potenciales agentes anti-cáncer. Por el contrario, insuficiente suministro de sangre al corazón y otros tejidos, como resultado de insuficiente nuevo crecimiento de vasos sanguíneos, es una característica de muchas enfermedades cardiovasculares. SFN se ha demostrado que inhibe la angiogénesis en altas concentraciones [39]. En este estudio, SFN a 2,5 M de formación de tubos ascendido a 118% del control, es decir, la longitud total del tubo fue mm
2 en el control y 5,65 mm /mm
2 en SFN (2,5 M), las células 4,78 mm /tratados (Fig. 5). SFN en 5 M mostró una promoción menos significativo (111% en relación con el control), mientras que 10 y 20 mM SFN inhibió la formación de tubos de manera significativa (disminución de 61 y 20% del control, respectivamente). SFN en dosis baja promovió la formación de una membrana basal continua alrededor de tubos endoteliales; mientras que a altas dosis de SFN, se encontró que las membranas basales fragmentados (Fig. 5A). Estos datos sugieren que para la anti-angiogénesis una dosis relativamente alta de SFN se debe utilizar ya que una dosis más baja puede promover la angiogénesis. Sin embargo, el efecto estimulante de dosis bajas sobre la nueva formación de vasos sanguíneos podría ser beneficiosa en pacientes con enfermedades cardiovasculares
.
medio de cultivo suplementado con SFN (0-40 mM) se añadió a la parte superior de geles de colágeno 3-D y luego se cambian cada 24 h con frescos SFN añadió. geles de 3-D se fijaron en día 5, inmunotinción con CD31 (rojo) y colágeno de tipo IV (verde), y de contraste con DAPI (azul). (A): bajo aumento fotos fueron tomadas de cinco campos aleatorios de cada muestra y se calculan para tubo de longitud media. (B) Las imágenes representativas se muestran en la triple tinción con mayor aumento. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 5) (C). * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 en comparación con el control no tratado
Discusión
hormético efecto de las TIC en el crecimiento celular, la migración y la angiogénesis
Las concentraciones de zona hormetic (aproximadamente 1. -5 M) de las TIC que se agregan en el cultivo celular fácilmente podría lograrse en el plasma humano después del consumo de una comida rica en verduras crucíferas, o a partir de extractos o suplementos [40] - [44]. La Tabla 1 muestra los niveles plasmáticos de ITC medidos en varios estudios en humanos (véase también la referencia [45]). SFN se deriva de la acción de la enzima endógena, la mirosinasa en la glucosinolato, glucorafanina que se encuentra en las verduras crucíferas. El contenido de glucosinolatos de Brassica común están disponibles en una base de datos desarrollada por McNaughton y Marks [46]. El valor más alto de glucosinolatos era de berro (389 mg /100 g de peso fresco), mientras que el valor más bajo fue de col china (20 mg /100 g de peso fresco), aunque el tipo cultivar y las condiciones de crecimiento, tanto la influencia de estas cifras. Brócoli contiene 61,7 mg /100 g (19,3 a 127,5 mg glucoraphinin /100 g) [46], que es equivalente a 141,3 mol SFN /100 g (44,2 a 292,1 mmol /100 g de peso fresco) si la conversión es 100% eficiente. las condiciones de procesamiento de alimentos y utensilios de cocina son factores cruciales para influir en la actividad de la mirosinasa, y la posterior formación de las TIC [47]. La principal influencia en la subsiguiente producción de las TIC
in vivo
es cómo se han cocinado los vegetales del género Brassica [48]. Amplios estudios de SFN han proporcionado pruebas convincentes de que el SFN es un agente quimiopreventivo [49], [50]; y los mecanismos de su acción consiste en la inducción de enzimas de fase II, la detención del ciclo celular y la apoptosis [16], [51].
En general, los resultados de estudios epidemiológicos sobre la asociación entre la ingesta de vegetales y el riesgo de cáncer son incompatibles. Un elevado consumo de verduras crucíferas ha, sin embargo, ha demostrado que disminuye el riesgo de varios tipos de cáncer, incluidos los de colon y pulmón [52], [53]. Si los efectos de las TIC hormetic están involucrados en el crecimiento del cáncer, el impacto biológico general de verdura crucífera sobre el riesgo de cáncer se vuelve mucho más complicado. Sin embargo, si una dosis baja de las TIC promueve el crecimiento de células de cáncer que puede ayudar a explicar por qué los estudios epidemiológicos no muestran una asociación consistente entre el consumo de verdura crucífera y el riesgo de cáncer. Por lo tanto, es crucial para entender los mecanismos de acción de los efectos hormetic de las TIC. En
in vitro
cultivos de células, los mecanismos por los que las dosis bajas de SFN promueven el crecimiento celular pueden estar relacionados con el efecto SFN tiene sobre la activación de las moléculas estimuladoras del crecimiento (tales como HER2, RAS, RAF, MEK, ERK , PI3K, AKT y mTOR), las vías de transducción de señales, tales como NF-kB, FOXO, HIF, Nrf2, la autofagia y receptores [54] - [56].
la autofagia implica la formación de vesículas de doble membraned ( autofagosomas), que encapsulan el citoplasma y orgánulos y se fusionan con los lisosomas, lo que lleva a la degradación del contenido de la vesícula [57]. SFN se sabe que es un inductor de la autofagia [58], pero no está claro cómo la inducción de la autofagia se asocia con la supresión de la migración celular. Otros posibles objetivos de SFN pueden incluir las metaloproteinasas de matriz (MMP), microtúbulos, colágenos y las integrinas, survivina y con dedos de zinc vinculante caja E homeobox 1 (ZEB1) [59]. Un estudio muy reciente sugiere que la activación de la autofagia se asocia con la quimiorresistencia y que la histona desacetilasa (HDAC) 10 protege a las células de neuroblastoma de agentes citotóxicos por la mediación de la autofagia [55]. Este trabajo indica que el co-tratamiento con inhibidor HDAC10 y un fármaco quimioterapéutico (doxorrubicina) es una forma prometedora para mejorar la respuesta al tratamiento. Otro estudio sugiere que la activación Notch es en gran parte prescindible para la inhibición mediada por SFN de la migración celular en los cánceres de próstata humanos [60], y esto podría ser una ventaja terapéutica como la activación Notch es común en los cánceres de próstata humanos. Los altos niveles constitutivos de Nrf2 producen en muchos tumores, mientras que la sobreexpresión de Nrf2 en células de cáncer de los protege de los efectos citotóxicos de las terapias contra el cáncer, lo que resulta en la quimiorresistencia [22], [61]. Existen interacciones entre las TIC y se en la regulación de la tiorredoxina reductasa (TR-1) y glutatión peroxidasa 2 (GPx2) [30], y es evidente que las TIC y la se exhiben una gran cantidad de efectos de objetivos múltiples en la quimioprevención del cáncer. Curiosamente, Se promueve también la migración y la invasión de las células PC3 cáncer de próstata [62].
Evaluación del efecto de las TIC hormético
El consumo de verduras crucíferas, no sólo aportarían las TIC, sino también contribuir otra nutrientes y fitoquímicos, incluidos los tocoferoles, flavonoides, ascorbato y SE. Estos componentes podrían contrarrestar /interactuar con los prooxidantes /actividades antioxidantes de las TIC. Sobre la base de la naturaleza hormético de las TIC, el consumo de una cantidad de verduras crucíferas que proporcionan un nivel hormético de las TIC en el plasma podría ser un factor de riesgo para aquellos que han transformado las células en el cuerpo. Un diagrama esquemático para el análisis de los beneficios y riesgos de las TIC en la dieta se propone en la Fig. 6. Para todos los compuestos dietéticos y sustancias tóxicas, "la dosis hace el veneno" [simplificado la redacción de "todas las cosas son veneno, y nada es sin el veneno; sólo la dosis permite que algo no ser venenosa "(Paracelso, 1493-1541)]. Para ITC dietéticos, no debería ser un "nivel sin efecto" antes de la detección de ningún efecto biológico. De hecho, el nivel de las TIC en el plasma de la mayoría de la población es probable que sea mucho menor que sub-M y puede no ejercer ningún efecto biológico sobre las células. Sin embargo, tras el consumo elevado, como en los ensayos que figuran en la Tabla 1, o para las personas que toman suplementos, el plasma niveles ITC podrían alcanzar las concentraciones de zona hormetic. Las características típicas de la zona hormético (dosis A-C) incluye concentraciones bajas y altas concentraciones estimulantes efectos inhibidores. Para SFN, la zona hormético se encuentra para ser 1-5 M en el
in vitro
experimentos de cultivo celular, aunque la dosis de efectos encontrados
in vitro
experimentos no deben extrapolarse directamente a los seres humanos . Es posible que la zona hormético y el efecto adverso no observado (NOAEL, dosis C) en los seres humanos es significativamente diferente. Con el fin de maximizar el efecto beneficioso y minimizar el riesgo, tanto los factores genéticos y las interacciones entre componentes de la dieta deben ser considerados. Por ejemplo, los polimorfismos genéticos de transferasas de glutatión (GSTs) afectan el metabolismo de SFN y el riesgo de cáncer [63]. Por otro lado, la suplementación con verduras crucíferas aumento de la actividad GSTA1 /2, siendo el efecto más marcado en /hombres GSTT1 nulo GSTM1 nulo [64]. Aunque en la actualidad hay pocos estudios epidemiológicos que emplean genotipado, la investigación de esta naturaleza se incrementará en el futuro y es probable que los nutrigenética proporcionarán una base para la medicina personalizada y la nutrición. Las interacciones entre los fitoquímicos bioactivos y nutrientes pueden contribuir a los beneficios y riesgos de las TIC en función del estado de salud de los individuos en general. Las inducciones de Nrf2 y enzimas antioxidantes tales como TR-1 también podría ser de beneficio o riesgo en función de la naturaleza de las células diana (normal
vs
tumor)
.
Para todos los tipos de células , intervalo de dosis 0-A es seguro. En la mayoría de las dietas, la ingesta de fitoquímicos hormetic es probable que caigan dentro de este rango seguro. Para las células normales, la dosis de B podría ser utilizado promover la formación de nuevos vasos sanguíneos o promover la cicatrización de heridas; dosis & gt; C son tóxicos. Para las células tumorales, las dosis entre A y C deben ser evitados; y las dosis & gt; C a D podrían ser utilizados para la quimioterapia
¿Dónde estamos ahora.? ¿Cómo podemos maximizar los beneficios y minimizar los riesgos?
Hace treinta años, los investigadores se centraron en las posibles propiedades tóxicas (generadores de bocio) de productos de degradación de glucosinolatos [65]. En 1992, el sulforafano fue aislado de brócoli y estudios anti-cancerígenos se basa en su actividad potente en la inducción de enzimas de fase II [12], [66]. Durante la última década, se han reportado muchos inductores Nrf2 incluyendo ITC, resveratrol, catequina, quercetina cucurmin, y [67], [68] con tanto quimiopreventivo y actividades oncogénicas [69] - [71]. Recientemente, dos inhibidores de Nrf2, brusatol (de las semillas de
Brucea sumatrana
) y trigonelline (de café) fueron reportados para mejorar la eficacia de la terapia contra el cáncer [72], [73]. Por otra parte, Nrf2 caída se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor, aumentar la eficacia de la quimioterapia en el cáncer cervical [74], e inhibir la angiogénesis de las células endoteliales micro-vascular cardiacos de rata en condiciones de hipoxia [75]. Por lo tanto, es evidente que el papel de Nrf2 en el desarrollo del cáncer es un tema de controversia y Nrf2 activadores tales como SFN y otras TIC pueden contribuir tanto beneficios como riesgos en el desarrollo del cáncer.
La comprensión de la compleja y plétora naturalezas divergentes de las TIC y otros activadores Nrf2 dietéticos y sus respuestas a las dosis hormetic, combinados con un diagnóstico preciso (estadio del cáncer), y el análisis genético pueden, en un futuro no muy lejano, iniciar el significativo potencial que la medicina personalizada puede tener. Las nuevas técnicas de diagnóstico que explotan las nanopartículas de oro pueden detectar masas tumorales tan pequeño como 5 mm en el hígado [76]. Las nanopartículas de oro con un recubrimiento de polielectrolito pueden hacer que los tumores más pequeños visible a través de imágenes de dispersión de rayos X, lo que permite un diagnóstico más temprano. Una vez que los tumores pueden ser diagnosticados en una etapa tan temprana, un enfoque terapéutico potencial podría ser la nanoencapsulación de fitoquímicos que combaten el cáncer o medicamentos a través de la entrega supervisada y dirigida [77]. Pero, se debe recordar que las TIC a altas concentraciones también son tóxicos hacia las células normales. Los efectos adversos han sido reportados en
in vitro
estudios en el uso de 10-30 M SFN, incluyendo la inducción de ADN, ARN y el daño mitocondrial [78] - [80]. Por otra parte, también hubo un caso de toxicidad hepática en un individuo que consume 800 ml de sopa de brócoli al día durante 4 semanas [81]. Los bajos niveles de TIC pueden generar especies reactivas de oxígeno (ROS), y activar Nrf2-SON para activar enzimas antioxidantes. A pesar de los altos niveles de ROS pueden dañar proteínas, lípidos y ADN en las células, los bajos niveles de ROS pueden desempeñar un papel importante en la defensa inmunológica, acción antibacteriana, el tono vascular, y la transducción de señales [82]. Recientemente, James Watson hipótesis de que la diabetes, demencias, enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer están vinculados a un fallo de generar suficiente ROS [83]. El reto es definir el equilibrio entre la generación de ROS y la capacidad antioxidante en cada tipo de células. Para ITC dietéticos, es importante para definir el rango óptimo de la ingesta para promover la salud. Sin embargo, se necesitan más estudios en humanos para establecer las dosis óptimas de seguridad personalizado, y perfiles de eficacia a través de biomarcadores más sensibles.
Materiales y Métodos
Materiales
El sulforafano se adquirió de Enzo Ciencias de la vida (Reino Unido). selenito de sodio, dimetilsulfóxido (DMSO), peróxido de hidrógeno, el reactivo de Bradford, bromuro methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y todos los otros materiales y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Reino Unido). Policlonal de conejo anticuerpos primarios a Nrf2, Sam68 y peroxidasa de rábano (HRP) de cabra conjugado con IgG anti-conejo como anticuerpos secundarios se obtuvieron todos de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Alemania). Anti-colágeno IV y CD31 anti-humano /PECAM-1 se adquirieron de Millipore y BD Biosciences (UK), respectivamente. Los anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 y Cy2 fueron adquiridos de Jackson Immuno Research (UK). Mini-completa inhibidor de proteinasa y reactivo WST-1 se adquirieron de Roche Applied Sciences (Reino Unido). Electroforesis y materiales de transferencia Western fueron suministradas por Bio-Rad (UK). El kit de aumento de quimioluminiscencia (ECL) se adquirió de GE Healthcare (Reino Unido).
Cultivo de células
hepatocitos humanos inmortalizadas (definidos como HHL-5) fueron amablemente suministrada por el Dr. Arvind Patel, de Investigación Médica (MRC) Unidad de Virología del Consejo (Glasgow, Reino Unido) [84]. Todas las demás líneas celulares se adquirieron de ATCC. Las células se cultivaron de forma rutinaria en DMEM suplementado con suero fetal bovino (10%), glutamina 2 mM, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) en 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C.
la proliferación celular ensayo
el ensayo MTT proliferación celular se emplea para detectar la toxicidad del SFN (1-160 mM) en células cultivadas. Cuando las células estaban en aproximadamente el 70-80% de confluencia, las células se expusieron a diversas concentraciones de SFN para diferentes momentos usando DMSO (0,1%) como control. Después de todos los tratamientos, se retiró el medio, 5 mg /ml se añadió MTT y se incubó a 37 ° C durante 1 h para permitir que el MTT a ser metabolizado. A continuación, el formazán producido se resuspendió en 100 DMSO l por pocillo. La absorbancia final en los pocillos se registró usando un lector de microplacas (BMG Labtech Ltd, UK) a una longitud de onda de 550 nm y una longitud de onda de referencia de 650 nm.
La migración de células de ensayo
La migración celular se cuantificó usando un cultivo de células ThinCert inserta ensayo de migración celular (Greiner Bio-One Ltd.). Después de inanición durante la noche en medio libre de suero, las células se trataron con varias concentraciones de SFN durante 24 h, las células que migran a través de una membrana de PET se marcaron fluorescentemente con calceína-AM y se cuantificaron mediante un lector de microplacas (BMG Labtech Ltd, Reino Unido) con una longitud de onda de excitación de 485 nm y de emisión de longitud de onda de 525 nm.
la extracción de proteínas y Western blot
Para las proteínas totales, HHL-5 células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, se recogieron por raspado en 20 mM Tris-HCl (pH 8), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% Nonidet P40 (NP-40) que contiene-mini completa inhibidor de proteinasa. Las suspensiones de células se colocaron en un baño de hielo durante 20 min y luego se centrifuga a 12.000 g durante 15 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína determinada por el ensayo de unión de colorante-Blue G Brilliant Bradford de utilizar BSA como estándar. Para la proteína nuclear, la extracción se llevó a cabo mediante el uso de un extracto de Kit Nuclear (Active Motif, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los extractos de proteínas se calentaron a 95 ° C durante 5 min en tampón de carga y se carga en geles de 10% SDS-poliacrilamida, junto con un marcador de peso molecular. Después de la electroforesis y la transferencia de rutina, la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) se bloqueó con 5% de leche sin grasa en PBST (0,05% de Tween 20) durante 1 h y se incubaron con un anticuerpo primario específico en 5% de leche en PBST durante 1 h. La membrana se lavó tres veces por 45 min con PBST y después se incubó con el anticuerpo secundario diluido con 5% de leche en PBST durante 1 h. Después de tres lavados adicionales de 45 min con PBST, la unión del anticuerpo se determinó usando un kit ECL (GE Healthcare, Reino Unido) y la densitometría se midió por Fluor Chem Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
angiogénesis ensayo - la formación del tubo en un modelo 3-D
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y pericitos (PVC) fueron co-cultivadas en gel de colágeno tipo I como se describe anteriormente [85]. Se añadió SFN (0-40 mM) al medio (parte superior del gel de colágeno 3-D) y el medio se cambió cada 24 h con fresco SFN añadió. En el día 5, las muestras fueron fijadas, a inmunotinción con CD31 y colágeno tipo IV y de contraste con DAPI. Magnificación imágenes fueron tomadas de cinco campos aleatorios de cada muestra y duración media del tubo medida.
Estadísticas
Los datos se representan como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos fueron examinadas usando una sola vía prueba de ANOVA, o la prueba t de Student. Un
p
valor & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa.