Extracto
Bezielle (BZL101) es un fármaco oral candidato que ha demostrado una eficacia prometedora y excelente seguridad de los ensayos clínicos de fase temprana para avanzados cáncer de mama. Bezielle es un extracto acuoso de la hierba
Scutellaria barbata
. Hemos informado anteriormente de que Bezielle era selectivamente citotóxica para las células cancerosas sin afectar las células no transformadas. En tumor, pero no en células no transformadas, Bezielle generación inducida de ROS y el daño del ADN grave seguido de la hiperactivación de PARP, el agotamiento de la ATP celular y NAD, y la inhibición de la glicólisis. Mostramos aquí que las mitocondrias de células tumorales son la principal fuente de especies reactivas de oxígeno inducidas por Bezielle. El tratamiento con Bezielle induce niveles progresivamente más altos de superóxido mitocondrial, así como de tipo peróxido de ROS. La inhibición de la respiración mitocondrial impide la generación de ambos tipos de ROS y protege las células de la muerte inducida por Bezielle. Además de la glucólisis, Bezielle inhibe la fosforilación oxidativa en las células tumorales y agota la capacidad de reserva mitocondrial células de la capacidad de producir ATP privar. Las células tumorales que carecen de mitocondrias funcionales mantienen la actividad glucolítica en presencia de Bezielle que apoya la hipótesis de que las mitocondrias son el objetivo principal de Bezielle. Los efectos metabólicos de Bezielle hacia las células normales no son significativas, de acuerdo con los bajos niveles de daño oxidativo que Bezielle inflige sobre ellos. por lo tanto Bezielle es un fármaco que se dirige selectivamente a las mitocondrias de células de cáncer, y se distingue de otros tales fármacos por su capacidad para inducir no sólo la inhibición de la fosforilación oxidativa, sino también de la glucólisis. Este estudio proporciona una mejor comprensión del mecanismo de la citotoxicidad de Bezielle, y la base de su selectividad hacia las células cancerosas
Visto:. Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen I, Shtivelman E (2012 ) Bezielle metas de manera selectiva las mitocondrias de las células del cáncer para inhibir la glucólisis y la fosforilación oxidativa. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10.1371 /journal.pone.0030300
Editor: Marianne Koritzinsky, Red de Salud de la Universidad, Canada |
Recibido: 20 Julio, 2011; Aceptado: December 12, 2011; Publicado: 3 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada en su totalidad por Bionovo, Inc. Sin financiación externa se ha recibido para este estudio. El donante jugado un papel en la decisión de investigar Bezielle como un agente anti-cáncer, pero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses.: los autores reconocen que son empleados pagados y los titulares de valores de Bionovo, Inc, y que este estudio, en su totalidad, con el apoyo de fondos de Bionovo. Bezielle (BZL101) es propiedad de fármaco candidato botánico de Bionovo (FDA-IND: 59521) para el tratamiento de cáncer de mama metastásico. Patente de los Estados Unidos de Bionovo No. 7.700.136 cubre un método de tratamiento de cáncer de mama utilizando un extracto de Scutellaria Barbata. Esta patente también cubre el uso de formulación patentada BezielleR de Bionovo como monoterapia para el tratamiento de cáncer de mama. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Bezielle (BZL101, la FDA IND#59.521) es un extracto preparado a partir de las partes aéreas de hierba
Scutellaria barbata Windows que tiene propiedades anticancerígenas.
S. barbata
extracto se demostrado que tienen actividad citotóxica contra varias líneas de células tumorales
in vitro
[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] y la actividad antitumoral
in vivo
[11], [12], [13] en los modelos de renales, de próstata y carcinoma hepatocelular. Más importante aún, dos ensayos clínicos en fase inicial con Bezielle mostraron una eficacia prometedora y una excelente seguridad para el tratamiento del cáncer de mama avanzado [14], [15]. En los dieciséis pacientes de ensayos clínicos de fase Ia, todos los cuales pasaron por múltiples terapias de tratamiento antes de la inscripción fueron evaluables para la respuesta. Cuatro pacientes tenían enfermedad estable durante & gt; 90 días (25%) y 3/16 tenían SD para & gt; 180 días (19%). Cinco pacientes tenían regresión objetiva del tumor [15]. La posterior ensayo a pequeña escala de escalada con una formulación mejorada de Bezielle mostró una eficacia prometedora de manera similar [14]. La necesidad de nuevos fármacos para frenar la morbilidad y la mortalidad de los cánceres metastásicos no se puede exagerar. En particular, se necesitan con urgencia medicamentos disponibles por vía oral con una menor toxicidad. Bezielle satisface estas necesidades no satisfechas, y los estudios clínicos más amplios para proporcionar más datos definitivos respecto están previstas seguridad y eficacia.
Hemos informado anteriormente de que Bezielle mata selectivamente las células tumorales sin dañar las células no transformadas
in vitro
[8], [15]. Esta selectividad podría dar cuenta de su perfil de seguridad superior demostrado en los primeros ensayos clínicos en comparación con otros agentes citotóxicos aprobados. Hasta la fecha, los análisis de los efectos celulares de Bezielle han puesto de manifiesto que la base de la selectividad de Bezielle es la inducción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células tumorales que está fuertemente atenuada en las células normales. ROS inducida por Bezielle causar grandes daños en el ADN y la activación de hiper de PARP-1 en las células tumorales. De manera significativa, Bezielle inducida por un daño en el ADN modesta en células no transformadas que fue reparada y no implicara una hiperactivación de la PARP [8]. En células tumorales, la activación de PARP agota NAD + y ATP que se utilizan para sintetizar poli-ADP ribosa para PAR-ilación de un número de proteínas celulares implicados en la reparación del daño del ADN, el control y la regulación del ciclo celular [16] de la transcripción, [17] , [18]. El agotamiento de NAD + citosólico es más probable que la causa de la inhibición selectiva posterior de la glucólisis [19], [20], [21] que se observa en el tumor Bezielle tratadas pero no en las células normales [8]. La inhibición de la glicólisis, así como el colapso del estado redox (que se manifiesta en el agotamiento de NADPH y GSH en las células tumorales tratadas por Bezielle) son la causa probable de la muerte celular provocada por Bezielle. De hecho, nuestros resultados muestran que Bezielle induce la muerte principalmente necrótico [8] que se sabe que está asociado a la hiperactivación de PARP-1 [21], [22], [23]. Un análisis proteómicos y metabolómicos combinado detallada reciente de células de cáncer de mama tratadas con Bezielle reveló la inducción de daño estrés oxidativo seguido de redistribución de flujos metabólicos [24]. En concreto, tres familias de enzimas que participan en el mantenimiento del potencial redox se vieron afectados por Bezielle: glutatión y proteínas y peroxirredoxinas relacionados similares a la tiorredoxina. El subgrupo más grande de las proteínas afectadas por Bezielle eran los que participan en rutas metabólicas, incluyendo la glucólisis, ciclo de Krebs y el metabolismo de los ácidos grasos. Estos datos apoyan la hipótesis de que Bezielle afecta gravemente el metabolismo de las células tumorales a través de daño oxidativo.
En este estudio, hemos analizado aún más los mecanismos de muerte celular inducida Bezielle y su selectividad. Nos informan de que las mitocondrias son la diana celular primaria de Bezielle, y las consecuencias celulares anteriormente descritas de tratamiento con Bezielle son provocados por los efectos de este extracto botánico en las mitocondrias. Mediante el examen de los efectos metabólicos de Bezielle hemos encontrado que Bezielle inhibe no sólo la glucólisis, sino también la fosforilación oxidativa, comprometiendo así las dos vías de producción de energía celular.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
se preparó
extracto Bezielle como se describió anteriormente para el material de grado clínico [15]. En pocas palabras, la hierba cruda seca se molió a un polvo fino, añadido en una proporción 1:10 (peso a volumen) de agua para pre-calentado y cocido a fuego lento a 80 ° C durante 30 minutos. El sobrenadante fue separado de los sólidos insolubles por centrifugación a 5.000 rpm, y sujeto a una liofilización. El polvo resultante se disolvió en agua a 50 mg /ml y esterilizada por filtración antes de su uso.
difenileno yodonio (DPI), N-acetil-cisteína, apocinina, FCCP (p-trifluorometoxi carbonil cianuro fenil hidrazona), antimicina A y otros productos químicos se adquirieron de Sigma. indicadores fluorescentes de ROS CM-H
2DCFDA y MitoSOX Rojo eran de Molecular Probes /Invitrogen. Los anticuerpos frente a la par eran de Becton-Dickinson, a partir de NOX4 Epitomics, a la subunidad 2 del complejo IV mitocondrial de Mitosciences, a LC3 de Abgent, y para SQSTM de Señalización Celular.
Cultivo de células y tratamientos
Todas las líneas celulares se obtuvieron de la ATCC. MDAMB231 fueron propagadas en medio RPMI con 10% de FCS. MCF10A se propagaron en DME /F12 con 5% de FCS, 50 g /extracto de pituitaria ml, 10 mg /ml de insulina, 0,5 mg /ml de hidrocortisona y 0,02 g /ml EGF (Sigma). células Hs578T y SKBR3 se cultivaron en DMEM con 10% de FCS. Preparación del extracto acuoso de Bezielle se describió anteriormente [8]. Las células se trataron con Bezielle a 250 g /ml (peso en seco por unidad de volumen), a menos que se indique lo contrario en las Leyendas de las figuras, o con agua (etiquetados como "sin tratar" en todo el documento). Todos los tratamientos con Bezielle se realizaron en su totalidad piruvato carecen de medio de crecimiento.
Medición de la ROS
stocks frescas de ROS indicadores CM-H
2DCFDA y MitoSOX Red se prepararon en DMSO a una concentración de 0,5 mM y se diluyeron en medio de crecimiento caliente a la concentración de 2,5 mM. Se añadió el medio que contiene uno de los colorantes indicadores para las células. Después de incubar los cultivos con las sondas durante 20 minutos, las células se lavaron con PBS, se trataron con tripsina y se recogieron para el análisis por FACS. Fluorescencia de CM-H
2DCFDA se recogió en el canal FL1, y por MitoSOX rojo en el canal FL2. Cada experimento incluyó las células que no fueron sometidos a tratamiento con Bezielle. Los niveles de fluorescencia de estas células no tratadas fueron asignados un valor arbitrario de 1, y se muestra la fluorescencia de las células tratadas Bezielle en las figuras como "Las veces de aumento" sobre las células no tratadas
Lentivirus -. Mediada por siRNA y la expresión génica
en el silenciamiento NOX4, seis shRNA construye en el vector plásmido LKO fueron adquiridos de Applied Abrir /Thermo. Los virus se producen en células HEK293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se utiliza para transducir células, seguido de la selección en concentraciones predeterminadas de puromicina.
Las mediciones de la viabilidad celular, número de células y la apoptosis
La viabilidad celular se determinó usando CCK-8 kit (Dojindo). análisis de la muerte celular se realiza mediante la tinción con yoduro de Anexina V /propidio seguido de citometría de flujo. Las células se recogieron por tripsinización en sus medios de cultivo, se lavaron con PBS y se tiñeron con Anexina V-FITC (BioVision) y yoduro de propidio (PI), y se analizaron inmediatamente después de una incubación de 5 minutos usando el software CellQuest en el FACScan (Becton Dickinson). los niveles de ATP se cuantificaron con ATP bioluminiscencia kit de ensayo SA II (Roche Applied Science).
Cuantificación de glutatión reducido usando fluorescente sonda monobromobimano
Las células en placas de 96 pocillos se trataron como se desea, el medio de tratamiento fue eliminado y sustituido con un medio que contiene 8 M monobromobimano (MBB). La fluorescencia se leyó en un lector de placas con filtros fijados a la excitación de 360 nm y emisión a 460 nM.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa . Las membranas se transfirieron con anticuerpos a concentraciones recomendadas durante la noche a 4 ° C y los anticuerpos primarios unidos se detectaron usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa. Las transferencias se desarrollaron utilizando el kit de aumento de quimioluminiscencia SuperSignal (Pierce) y la imagen de Kodak Imager ISR2000.
Comet Assay
Comet ensayos se realizaron utilizando el kit de ensayo de cometa de Trevigen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron las células, se lavaron y se resuspendieron con PBS. Las células se combinaron con fundida, de agarosa de bajo punto de fusión a 37 ° C y con pipeta a las diapositivas Comet. La agarosa se dejó solidificar a 4 ° C durante 30 a 40 min, y se desliza se sumergieron en solución de lisis frío (Trevigen, Inc.) durante 30 min a 4 ° C. Los portaobjetos se sumergieron en solución alcalina siguiente recién preparado (NaOH 300 mM y EDTA 1 mM) durante 20 min y se sometieron a electroforesis en el mismo tampón alcalino a 15 V (0,5 V /cm) y 300 mA durante 25 min. Los portaobjetos se enjuagaron en agua y se fija en 70% de etanol durante 5 min. Después de secar al aire, los núcleos se tiñeron con SYBR verde (Trevigen, Inc.) y se observan bajo un microscopio de fluorescencia. Los porcentajes de células con cometas fueron cuantificados por dos observadores cegados a la identidad de los portaobjetos. Los núcleos también fueron fotografiados y analizados con el software de análisis de imágenes Tritek CometScore. momento de la cola de oliva, que se define como el producto de ADN porcentual en la cola y el desplazamiento entre la posición de los centros de medios de masas en las cabezas y las colas, se determinó durante al menos 40 células por muestra.
análisis metabólico con Seahorse XF96 extracelular flujo Analizador
Las células se cultivaron durante la noche en XF96 PET placas de 96 pocillos a números predeterminados experimentalmente (10 × 10
3 células por pocillo para MDAMB231 y 12 × 10
3 células por pocillo para MCF10A). flujos metabólicos fueron analizadas en el analizador Seahorse XF96 las instrucciones del fabricante, como se describe anteriormente [25]. Basal ECAR (índice de acidificación extracelular, en mph /min), OCR (tasas de consumo de oxígeno, en pmoles O
2 /min) y PPR (, normaliza la tasa de producción de protones en nmol H + /min) los valores se midieron durante 4 ciclos. Cada ciclo consistió en un tiempo de mezcla de medios de 3 minutos y un tiempo de 5 minutos mediciones. Después de medir los niveles basales de ECAR y OCR para 4 ciclos, el desacoplador FCCP mitocondrial a 1 mM se inyectó automáticamente en los pocillos experimentales con el fin de cuantificar la capacidad de respiración máxima, o de reserva mitocondrial. Después de un ciclo de mediciones de inhibidor mitocondrial complejo III antimicina A a 5 mM se inyectó en los pocillos experimentales, y otro ciclo de medición se llevó a cabo para verificar que el consumo de oxígeno era de origen mitocondrial. Cada punto experimental fue un promedio de 6 a 10 pozos obtenida en cada experimento, y los experimentos se repitieron al menos 3-4 veces. Los datos experimentales se consideran aceptables sólo cuando las variaciones en los valores de pH entre los ciclos de mezcla y medición eran menos de 0,05-0,1 unidades de pH. Esto aseguró que los datos ECAR no fueron alterados artificialmente por los cambios en los valores de pH, y de hecho paralelo de cerca los cambios en valores de RPP. Normalización de los valores obtenidos en los ensayos de XF96 se realizó mediante la cuantificación de ADN celular en placas experimentales con el ensayo CyQuant (Promega). Todos los datos se expresan como XF96 ECAR o OCR valores normalizados para el contenido de ADN.
Resultados
El papel de las mitocondrias en la inducción de ROS y la muerte celular por Bezielle
han informado anteriormente de que Bezielle es citotóxica selectiva a líneas celulares de cáncer de mama, pero no a las células no transformadas, tales como células mamarias inmortalizadas y fibroblastos primarios, que son relativamente resistentes a su efecto citotóxico [8]. Desde entonces, hemos probado la citotoxicidad de Bezielle en más de dos docenas de líneas celulares de cáncer y cuatro líneas celulares inmortalizadas diferentes y células primarias. Hemos observado que, en promedio, las células no transformadas son mucho menos sensibles a Bezielle que línea celular de cáncer (manuscrito en preparación). La figura 1A ilustra estas observaciones con líneas celulares de dos: línea de carcinoma de mama MDAMB231 e inmortalizado línea epiteliales MCF10A. Hemos observado que la sensibilidad a la Bezielle en general no se correlaciona directamente con la tasa de proliferación de las líneas celulares (datos no mostrados). Por lo tanto, la tasa de proliferación de las células no transformadas MCF10A es en realidad algo más alta que la de líneas celulares de cáncer MDAMB231, y es mucho más alta que la de otras líneas de células de cáncer de mama que son sensibles a Bezielle [8].
A. Bezielle induce la muerte celular en las células tumorales, pero es menos citotóxica hacia las células no transformadas mamarias. línea celular de cáncer de mama MDAMB231 y no transformada línea MCF10A se trataron con Bezielle a las concentraciones indicadas durante 24 horas, y la viabilidad celular se cuantificó usando el kit de ensayo de CCK-8. Los resultados son la media ± S. E. (N = 4). B. Las células fueron tratadas con Bezielle a 250 g /ml durante media hora o 6 horas, cargadas con las sondas sensibles ROS, y se analizaron mediante citometría de flujo para el verde (H
2DCFDA) o rojo (MitoSOX) de fluorescencia. Los resultados se expresan como veces de incremento de la fluorescencia en células tratadas en comparación con las células de sonda cargada no tratados. Los resultados son la media ± S. E. (N = 3). Las diferencias significativas entre MDAMB231 y MCF10A se indican (** P & lt; 0,01). El análisis de transferencia Western de las células C. MDAMBRho-0 seleccionadas en baja concentración de bromuro de etidio confirma la eliminación de la subunidad mitocondrial codificada 2 del complejo de la respiración IV, y por lo tanto la inhibición de la fosforilación oxidativa. D, Análisis de la inducción de ROS en células Rho-0 llevadas a cabo como se describe en el Análisis de BE de la inducción de muerte celular por Bezielle en las células Rho-0 llevadas a cabo como se describe en A. Las diferencias significativas entre los grupos indicados se indican (* P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01) guía empresas
La inducción de la muerte de las células cancerosas por Bezielle es una consecuencia directa de la inducción de ROS y estrés oxidativo, debido a la co-tratamiento con antioxidantes N-acetil-cisteína (NAC) o piruvato inhibe el daño del ADN y la muerte celular [8]. El objetivo fue identificar las fuentes celulares de los ROS inducida por Bezielle. Las líneas celulares fueron tratados con Bezielle para diferentes tiempos y se cargan con indicadores permeables a las células de ROS CM-H
2DCFDA que se vuelve fluorescente en respuesta al peróxido de tipo radicales de oxígeno [26], o MitoSOX Rojo, altamente selectivos para dismutasa mitocondrial [ ,,,0],27]. Hemos observado un aumento dependiente del tiempo gradual en ROS en líneas celulares de cáncer de mama MDAMB231 y SKBr3, pero no en las células MCF10A después del tratamiento con Bezielle (Figura S1). La Figura 1B ilustra los niveles de ROS en 30 minutos y 6 horas después del tratamiento. Los datos se expresan como veces de incremento de la fluorescencia sobre la observada en las células no tratadas cargadas con el indicador fluorescente. MDAMB231 produjo más de ROS que las células MCF10A ya después de los primeros 30 minutos de incubación con Bezielle, pero con el tiempo la diferencia en los niveles de ROS inducidas en la línea de dos células se hizo cada vez más pronunciada. A las seis horas de tratamiento tanto de peróxido y superóxido mitocondrial fueron aumentado en aproximadamente de cinco y seis veces, respectivamente, en MDAMB231 células. El aumento en los niveles de ROS en MCF10A era mucho más modesto, y apenas superior a dos veces sobre los niveles basales de ROS incluso después de 6 horas de tratamiento (Figura 1B). Es posible que la continua acumulación de ROS en las líneas de células tumorales es directamente relevante a su sensibilidad a Bezielle
Estos resultados plantean una pregunta sobre la naturaleza de los radicales de tipo peróxido inducidos por Bezielle:. A saber, induce tanto Bezielle peróxido y superóxido, peróxido de o es simplemente un producto de conversión de superóxido mitocondrial? Teniendo en cuenta que el superóxido es una especie de vida corta de oxígeno reactivo, los altos niveles de la misma observaron a las 6 horas es probable debido a la generación continua por las mitocondrias. Los correspondientemente altos niveles de tipo peróxido de ROS pueden ser resultantes de la conversión de superóxido a peróxido de superóxido dismutasa.
Para examinar el papel de dismutasa mitocondrial en la muerte celular inducida por Bezielle, hemos empleado un método bien probado de desactivación de la respiración mitocondrial mediante el cultivo de células en presencia de bromuro de etidio. Después del cultivo de las células en baja concentración de bromuro de etidio durante 6 semanas, estas células (MDAMB231Rho-0) han perdido la expresión de proteínas mitocondriales codificadas en el genoma mitocondrial como se ve en la Figura 1C, haciendo que las mitocondrias no funcionales. Esto también se confirmó mediante el examen de consumo de oxígeno mitocondrial de células MDAMB231 Rho-0, que se redujo en gran medida (ver más abajo, Fig. 6). Las células Rho-0 se trataron con Bezielle, y se examinaron para la inducción de ROS y la muerte celular. La figura 1D muestra que las células MDAMB231 Rho-0, como se esperaba, no generan dismutasa mitocondrial en respuesta a Bezielle, lo que confirma el papel del transporte electrónico mitocondrial en la inducción de ROS por Bezielle. Los niveles de peróxido generado en Bezielle tratados Rho-0 células se aumentaron algo a los 30 minutos de incubación, pero no mostraron ningún aumento adicional en el tiempo (Figura 1D), apoyando fuertemente nuestra sugerencia de que los altos niveles de peróxido puede ser en gran parte debido a la conversión de superóxido mitocondrial. Lo más importante, las células MDAMB231 Rho-0 fueron muy fuertemente protegidos de la muerte celular inducida por Bezielle (Figura 1E), sugiriendo el papel central de las mitocondrias en la muerte de las células tumorales tratadas con Bezielle.
potenciales de otras fuentes celulares de ROS inducida por Bezielle
los datos descritos anteriormente en gran medida implicar a la vista mitocondrial superóxido generado en Bezielle citotoxicidad. Sin embargo, mientras que la inducción de superóxido mitocondrial por Bezielle se evitó por completo en 0-Rho células, el CM-H
2DCFDA detectable tipo peróxido de ROS, como se mencionó anteriormente, no fueron completamente abolido (Figura 1D). Hemos considerado la posibilidad de que algunas otras enzimas celulares capaces de producir peróxido o extra-mitocondrial superóxido pueden contribuir al estrés oxidativo causado por Bezielle. Hemos utilizado varios inhibidores de enzimas celulares que producen ROS: yodonio difenileno (DPI) y apocinina para la inhibición de NADPH oxidasas; alopurinol para inhibir la xantina oxidasa, ácido nordihidroguaiarético (NDGA) para inhibir la LOX, y éster Nitro-L-arginina metil (L-NAME) para inhibir la óxido nítrico sintasa. MDAMB231 células fueron tratadas con Bezielle en presencia de cada uno de estos inhibidores, y el grado de muerte celular, así como la inducción de ROS se cuantificó en los ensayos relevantes. Ninguno de los inhibidores redujo los niveles de ROS en células tratadas con Bezielle con la excepción de DPI (no se muestra y la Figura 2A). Del mismo modo, con la excepción de DPI, ninguno mostró ningún efecto protector sobre la muerte celular (no mostrado).
A. MDAMB231 células se incubaron con Bezielle en ausencia o presencia de 0,75 M DPI durante 6 horas y se examinan para la producción de ROS. B. La muerte celular en MDAMB231cells tratados con Bezielle durante 24 horas en ausencia o presencia de 0,75 M DPI. Todos los resultados en A y B son la media ± S. E. (N = 3). se muestran entre los grupos indicados diferencia significativa (0,01 * P & lt; 0,05; **; P & lt). C, la muerte celular en células de carcinoma de mama SKBR3 tratadas con Bezielle durante 24 horas en ausencia o presencia de 0,75 M DPI. Los resultados son la media de dos experimentos.
La figura 2A muestra la inhibición tanto de tipo peróxido de ROS y la producción de superóxido mitocondrial por el DIP en las células tratadas con Bezielle. El fuerte inhibición observada de dismutasa mitocondrial por el DIP fue inesperado, ya que la inhibición de NADPH oxidasas (NOX) no debería tener un efecto profundo en la mitocondria, a pesar de que algunos estudios publicados sugieren la existencia de una estrecha relación entre la activación de Nox y la producción mitocondrial de superóxido [28], [29]. Sin embargo, DPI también se informó de que un potente inhibidor de la producción de superóxido mitocondrial probablemente a través de la inhibición no específica de oxidorreductasa NADH-ubiquinona en el complejo mitocondrial I [30].
No es sorprendente que la inhibición de la producción de ROS inducida Bezielle por el DIP tenido un efecto protector sobre la muerte celular inducida por Bezielle (Figura 2B). A pesar de que DPI solo era algo citotóxica para las células, se atenúa fuertemente la muerte celular inducida por Bezielle (Figura 1E). Para descartar la posibilidad de que los efectos del tratamiento DPI son una característica particular de células MDAMB231, hemos examinado los efectos de DPI sobre la muerte celular en una línea celular de carcinoma de mama adicionales SKBr3. Las células SKBR3 mostraron una protección aún más fuerte por el DIP de MDAMB231, lo que indica que el efecto protector de DPI hacia Bezielle no es un fenómeno aislado (Figura 2C).
Por lo cual hemos examinado si el NOX no fagocíticas sabe se expresa en los tumores de mama [29], [31], podrían estar involucrados en Bezielle citotoxicidad. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura S2. En resumen, a pesar de que NOX4 parece ser upregulated por Bezielle en las células tumorales, el silenciamiento parcial de su expresión en células MDAMB231 indicó que NOX4 produce ROS no juegan un papel significativo en la muerte celular inducida por Bezielle.
La pregunta, Sin embargo, aún quedaba sobre el mecanismo de la reducción mitocondrial de ROS por DPI. Hemos encontrado que DPI, incluso a la baja concentración usada aquí, inhibe la respiración mitocondrial (ver más abajo), y por lo tanto, en efecto, actúa como inhibidor de la fosforilación oxidativa, similar a la ablación de la función mitocondrial en células Rho-0.
la inducción de daño en el ADN
Bezielle induce daño oxidativo del ADN que es fundamental para su capacidad de matar selectivamente a las células del cáncer [8]. Hemos examinado cómo la falta de mitocondrias funcionales y tratamiento con DPI afecta a la inducción de daño en el ADN por Bezielle en MDAMB231 células. Las células tratadas con Bezielle se analizaron mediante el ensayo de cometa por dos parámetros de daño del ADN: por ciento de las células con el ADN dañado, y el momento de oliva (que refleja el grado de daño de ADN en células individuales). Como se ve en la Figura 3A, el tratamiento con Bezielle llevó a progresivamente creciente número de células con daño en el ADN de hasta 6 horas. Después de ese punto del tiempo, las células muertas con ADN parcialmente degradado o dañado severamente empezó a acumular, por lo que la cuantificación del cometa difícil. Análisis del momento cola de cometa (Figura 3B) reveló un fuerte aumento del daño al ADN por célula inducida por Bezielle con el tiempo. La cantidad creciente de daños en el ADN por célula de una manera dependiente del tiempo se correlaciona bien con el aumento observado en los niveles de ROS (Figura 2B).
A. MDAMB231 células de control (MM231), MDAMB231 Rho-0 variantes (Rho), o MDAMB231 células en presencia de DPI (+ DPI) fueron tratados con Bezielle durante los tiempos indicados y se sometieron a alcalino análisis de ensayo cometa. Los resultados se muestran como porcentajes de células que forman los cometas, media ± S.E. (N = 3). Las diferencias significativas (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01) entre los grupos de Rho-0 y de control, y entre DPI-tratadas y se muestran los grupos de control. B. mismos experimentos que en A, pero los resultados que se muestran son los momentos de oliva medios de las cometas inducidos por Bezielle en tres poblaciones de células. Al menos 50 cometas fueron analizados por cada punto de tiempo en cuatro experimentos independientes. No se observaron entre las células de control y tanto Rho y los grupos tratados con DPI; diferencias significativas (0.01 ** P & lt). C. Los porcentajes de células MCF10A que muestran daño en el ADN en diferentes momentos después de la incubación con Bezielle, los resultados son la media ± S.E. (N = 3). se muestran entre las células tratadas durante 30 minutos en comparación con ambos 2 y 6 horas diferencias significativas (0.01 * P & lt; 0,05;; ** P & lt). El análisis de transferencia Western de D. activación de PARP (PAR) en las celdas indicadas tratados con Bezielle durante 1 hora. También se muestran la falta de expresión de la proteína codificada mitocondrial (complejo IV subunidad II) en Rho-0 células, la expresión de la proteína mitocondrial VDAC codificada en el ADN nuclear, así como la β-actina como control de carga. células E. MDAMB231 y MDAMB231-Rho-0 se trataron las células con Bezielle durante los tiempos indicados y se analizaron para la presencia de proteínas ribosiladas-poli-ADP. β-actina sirve como control de carga.
En MDAMB231 Rho-0 células, menos de la mitad de las células en la población tratada mostró la presencia de daño en el DNA incluso después de 6 horas (Figura 3A), y el análisis de oliva momento detectado bajos niveles de daño del ADN por célula que no aumentó con el tiempo (Figura 3B). Presencia de DPI tenido un efecto limitado en el número de células con daño en el ADN, pero tenía un fuerte efecto inhibidor sobre el aumento de los daños en el ADN por célula con el tiempo. El efecto débil de los DPI en el número de células con daño en el ADN podría estar relacionado con el efecto protector más débil de DPI contra la muerte inducida Bezielle en comparación con la protección de Rho-0 células (Figura 1E y 2B).
Tenemos también analizado Bezielle daño del ADN inducido en las células MCF10A, y han observado que incluso en la presencia continua de Bezielle en el medio de crecimiento, el daño del ADN en estas células se redujo gradualmente con el tiempo (Figura 3C). Sugerimos que los niveles mucho más bajos de ROS inducidos en las células MCF10A (Figura 1B) condujeron a niveles limitados de daño en el ADN, que fue reparado con éxito. Esto podría explicar la reducción dependiente del tiempo en el daño del ADN en las células MCF10A.
Hemos documentado hiperactivación de PARP en las células tumorales tratadas con Bezielle, y su papel en la inducción de la muerte celular. Hemos examinado si la PARP se activó en MDAMB231 Rho-0 células o en células tratadas con DPI. Como se muestra en la figura 3D, PARP se vio fuertemente activado en MDAMB231 células. En Rho-0 células, la activación de PARP fue significativamente menos robusto. En las células tratadas con DPI, Bezielle activó PARP a niveles entre estos observado en control frente a Rho-0 células (Figura 3D). PAR-ilación de proteínas en células MDAMB231 continuos para horas después del inicio del tratamiento con Bezielle, pero en Rho-0 células la activación de PARP no sólo era mucho más débil, pero también de naturaleza transitoria (Figura 3E). En conjunto, los datos anteriores muestran que carecen de mitocondrias funcionales inhibió fuertemente la inducción de ROS, daño en el DNA, la activación de PARP y la muerte celular por Bezielle. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que las mitocondrias son la diana celular primaria de Bezielle.
Las células cancerosas tratadas con Bezielle se someten a un colapso del sistema de defensa oxidativa
análisis publicado previamente de los cambios inducidos por transcripcional en las células tumorales Bezielle [8] indica que el sistema redox del glutatión participa en la respuesta celular a Bezielle, una conclusión apoyada por los recientes análisis proteómicos y metabolómicos [24]. Por lo tanto, la expresión elevada de cistationina-beta-sintasa y cisteína glutamato GCLM modificador de ligasa se observaron en las células tumorales Bezielle tratadas pero no en células no transformadas. Por lo tanto, se examinaron los niveles de glutatión reducido (GSH) en las células tratadas con Bezielle. Los resultados de la Figura 4A muestran una disminución fuerte y rápida de GSH en células MDAMB231. Los niveles de GSH se redujeron ligeramente en MCF10A, pero la disminución de GSH fue relativamente leve y no sostenida. En tiempos de incubación más largos, GSH se agotó casi totalmente en MDAMB231 células (no se muestra). GSH es un importante antioxidante, y la conversión de GSH oxidado (GSSG) a GSH requiere NADPH. Por ello, hemos examinado los niveles de NADPH en las células tratadas con Bezielle. Incluso después de sólo 4 horas (Figura 4B) hubo un profundo agotamiento de NADPH en las células MDAMB231.