Extracto
Nuevas estrategias que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) han llevado al desarrollo clínico de anticuerpos monoclonales, que el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (CCRm), pero sólo los subgrupos de pacientes con aumento de KRAS no mutado y copia del gen EGFR, responder a estos agentes. Además, la resistencia al bloqueo del EGFR se produjo inevitablemente, por lo que la terapia futuro difícil. bio-imágenes (BOI) Nuevos métodos pueden ayudar en la cuantificación de EGFR en cáncer colorrectal metastásico tejidos complementando así la metodología de inmunohistoquímica, para guiar el futuro tratamiento de estos pacientes. El objetivo del presente estudio fue explorar la utilidad de EGF cerca del infrarrojo marcado (EGF-NIR) para bio-imágenes del CRC utilizando
in vitro e
in vivo y modelos tumorales CRC ortotópico y
ex vivo
tejidos humanos CRC. Se describe la preparación y caracterización de EGF-NIR e investigamos de unión, utilizando BOI de un panel de modelos de cultivos celulares de CRC se asemejan a la heterogeneidad de los tejidos de CRC humanos. EGF-NIR fue específica y selectivamente obligado por EGFR células que expresan CRC, la intensidad de la señal de EGF-NIR a la proporción de fondo (SBR) refleja los niveles de EGFR, los experimentos de imagen de dosis-respuesta y transcurso en el tiempo en condiciones óptimas para la cuantificación de los niveles de EGFR por BOI. EGF-NIR de formación de imágenes de los ratones con HT-29 ortotópico tumor CRC indica que el EGF-NIR se elimina más lentamente del tumor y la más alta SBR entre tumor y el tejido normal adyacente se logró dos días después de la inyección. Además, imágenes de los tejidos disecados demostraron acumulación de EGF-NIR en el tumor y el hígado. EGF-NIR específicamente y fuertemente marcado EGFR tejidos CRC humanos positivos, mientras que adyacente tejido CRC y los tejidos negativos EGFR expresan señales NIR débiles. En este estudio se hace hincapié en el uso de EGF-NIR para los estudios preclínicos. En combinación con otros métodos, EGF-NIR podría proporcionar una herramienta específica bio-imágenes adicionales en la estandarización de las mediciones de la expresión de EGFR en los tejidos CRC
Visto:. Cohen G, S Lecht, Arien-Zakay H, K Ettinger , Amsalem O, Oron-Herman M, et al. (2012) Bio-Imaging de modelos de cáncer colorrectal mediante Factor de Crecimiento Epidérmico de Infrarrojo Cercano Etiquetada. PLoS ONE 7 (11): e48803. doi: 10.1371 /journal.pone.0048803
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 17 Junio, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 8 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Cohen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo informó aquí fue apoyada por Bio Medicina Fotónica (BMP) consorcio, Ministerio de Industria y Comercio israelí, programa Magnet. la gestión de dicho consorcio no tenía ningún papel en el diseño, la recogida de datos y análisis, o la preparación del manuscrito. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más comunes en las sociedades occidentales. La supervivencia a largo plazo de los pacientes diagnosticados-CRC se correlaciona con la etapa de la enfermedad en el diagnóstico. En las primeras etapas, así como en pacientes seleccionados con enfermedad avanzada, la cirugía es la principal modalidad de tratamiento [1]. Al menos el 40% de los pacientes con CCR desarrollará metástasis a distancia, ya sea sincrónica o metacrónicos, la mayoría de ellos sucumbirán a la enfermedad y morir [2]. Algunas de las características del fenotipo maligno de CRC se correlacionan con la sobreexpresión y la hiper-activación de receptores de tirosina quinasas tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que hacen que estos receptores objetivos atractivos para el tratamiento del cáncer [3]. En la mayoría de pacientes con CRC, la progresión de la mucosa colónica normal al cáncer implica una cascada definido de cambios moleculares, que se extiende por año [4]. polipectomía endoscópica ha demostrado reducir la mortalidad relacionada con la Convención [5]. Este procedimiento requiere fibro-óptica visualización colonoscopia del tejido CRC seguido por la evaluación histológica. Además los tejidos de CRC a menudo son evaluados por [7] y
in situ
hibridación [8] técnicas de RT-PCR [6], inmunohistoquímica, que mostró un mayor grado de discordancia entre las primarias y las metástasis de CCR conexas [ ,,,0],9].
EGFR se sobreexpresa con frecuencia en una variedad de tumores sólidos, del cerebro, de mama, pulmón, ovario y páncreas, y se asocia con un aumento de pronóstico potencial y pobres metastásico de CRC [10]. Los agentes biológicos que inhiben EGFR han demostrado actividad clínica como agentes únicos o en combinación con la quimioterapia, los más prometedores de estos agentes son cetuximab y panitumumab. Por desgracia, estos anticuerpos son clínicamente eficaces en sólo una minoría de los pacientes con CCR [11]. El éxito clínico de estas terapias con anticuerpos monoclonales es uniformemente limitada por el desarrollo de la resistencia adquirida a EGFR bloqueo [12]. Un mecanismo para la resistencia fue recientemente dilucidado: células resistentes cetuximab contienen una mutación de EGFR en el dominio extracelular (S492R) que deteriora cetuximab, pero no factor de crecimiento epidérmico (EGF) de unión [12]. Por lo tanto, ya que la respuesta a la terapia requiere la diana EGFR de estar presente, es necesario el desarrollo de métodos BOI para la detección cuantitativa de los niveles de proteína EGFR en CRC primaria y tejidos tumorales secundarias, con el fin de guiar el tratamiento de la persona seleccionada para EGFR dirigidos anticuerpo tratamiento y, en particular, aquellos que recaen mientras que en la orientación de EGFR terapias [13]. El advenimiento de EGFR anticuerpos, cetuximab y panitumumab ha allanado el camino a la medicina individualizada del cáncer colorrectal metastásico. Los datos actuales sugieren que la evaluación de KRAS y la mutación BRAF y la alteración de PI3K /PTEN podría ser útil para seleccionar a los pacientes que tienen pocas probabilidades de responder a los anticuerpos anti-EGFR. Se encontró que los tumores que responden CRC llevan tipo salvaje KRAS /bRAF y tienden a tener un modesto, aumentar el número de copias del gen EGFR, que se traduce en un aumento moderado en el nivel de EGFR. Por lo tanto, la detección del número de copias del gen EGFR y la evaluación cuantitativa del nivel de proteína EGFR es probable que mejorar la adaptación de cetuximab y panitumumab terapias para los pacientes con CCRm [12]. Sin embargo, las dificultades técnicas de la técnica de inmunohistoquímica, que se utiliza para evaluar la expresión del EGFR en tejidos fijados, pueden haber limitado la detección de aumento de nivel de la proteína EGFR pequeño hasta la fecha [11]. Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos sensibles de BOI nivel de proteína EGFR en cáncer colorrectal metastásico. gammagrafía EGFR, representa un método de este tipo que se basa en la unión, internalización, y la retención de los agentes de EGFR radiomarcados en compartimentos intracelulares y se ha demostrado con radiomarcado EGF y con un anticuerpo monoclonal radiomarcado dirigido contra EGFR [14]. Sin embargo, la desventaja de estos métodos es el uso de materiales radiactivos
Infrarrojo cercano (NIR) BOI óptica ofrece ventajas únicas para el diagnóstico de cáncer colorrectal metastásico:. Presentar una gran sensibilidad, que puede ser utilizado con diferentes etiquetas NIR y se puede proporcionar, en tiempo real dinámico
in vitro
y
in vivo
imágenes por medios no radiactivos [15]. NIR luz (700-1000 nm de longitud de onda) puede penetrar en el tejido, y ofrece un método potencialmente seguro, no invasivo de tumores que caracterizan [16]. En la mayoría de aplicaciones, NIR BOI se utiliza para ayudar a los agentes de contraste fluorescentes dirigidos que no sólo proporciona un mejor contraste, pero también, y más importante, revelan eventos moleculares específicos asociados con la iniciación del tumor y la progresión CRC [17]. Estudios recientes han establecido el uso de la segmentación mediada por Affibody de NIR agentes de contraste fluorescentes excitables para la detección de células malignas y tumores [18].
Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron desarrollar y caracterizar la novela
modelos in vitro
CRC CRC que se parecían a la heterogeneidad y para evaluar si es posible cuantificar el nivel de EGFR en
ex vivo
muestras frescas de tejido tumoral, CRC ortotópico en ratones y modelos desarrollados recientemente líneas celulares mediante el uso de EGF conjugado con IRDye 800CW (EGF-NIR) de la sonda. Hemos encontrado las condiciones óptimas para BOI del EGFR utilizando la sonda EGF-NIR en estos modelos, aplicables para endoscópica y la Odisea análisis de imágenes por infrarrojos. Por otra parte, mediante el uso de análisis de procesamiento de imágenes y el Western Blot se confirmó que la intensidad de la señal de EGF-NIR a la proporción de fondo refleja el nivel de proteína EGFR en los
y modelos in vitro y CRC
In situ
CRC humana tejidos investigados.
(a) esquema de reacción para la síntesis de EGF-NIR conjugado, la primera aminoácido asparagina en la terminal amino se indica como ASN1. (B) La separación de la mezcla de reacción de síntesis en la cromatografía de permeación de gel y de la muestra de EGF-NIR de permeación en gel en cromatografía de intercambio aniónico (C); EGF-NIR-línea completa (800 nm); gradiente de la línea quebrada-NaCl; la línea de puntos y rayas EGF no conjugada. (D) la separación HPLC de EGF-NIR purificó a partir de la cromatografía de intercambiador de aniones. la línea continua representa la absorbancia a 226 nm y la línea de puntos indica el gradiente. Insertar-12% El análisis por SDS-PAGE de 10 mg de EGF-NIR escaneada con Odyssey y EGF no modificado teñido con azul de Coomassie. (E) del espectro NIR de EGF-NIR [de excitación (línea gris) y emisión (línea de color negro)]; Insertar-800CW IRDye éster de NHS; (F) EGF-NIR indujo la fosforilación de Erk.
HT-29 células se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C (A) y 4 ° C (B) con 7 nM EGF-NIR en el presencia o ausencia de 100 nM EGF. También se realizaron experimentos de competición con 500 nM de cetuximab, TGF-α o NRG1. En experimentos de control se incubaron los cultivos con 7 nM NIR-Dye a evaluar etiquetado no específica de las células. La intensidad de las RIN a 800 nm se calculó en condiciones idénticas para todas las culturas y la media ± SD (n = 9) se presenta. inserciones superiores: exploraciones NIR; inserciones inferiores: microfotografías de contraste de fase de las culturas, * p & lt; 0,05 vs NIR-colorante; ** P & lt; 0,05 vs. EGF-NIR
HT-29 células se transfectaron durante 2 días con 5 nM anti-EGFR Silenciador seleccionar siRNA o ARN revueltos o se dejaron sin tratar (control).. Evaluación de la expresión de EGFR se realizó mediante En la célula NIR de formación de imágenes usando 7 nM EGF-NIR (barras negras) y transferencia Western (barras grises). Los valores son la media ± SD (n = 3). * P & lt;. 0,05 vs. revueltos o control
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
de colon humano líneas celulares de carcinoma HT-29, SW620, COLO205, A431 células escamosas epiteliales humanas de carcinoma y rata pequeña clon de células epiteliales del intestino IEC 6 fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se ajustaron para el crecimiento en Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10%, 2 mM L -glutamine y 10.000 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 ° C, 6% de CO
2 en un incubador humidificado. Todos los experimentos se llevaron a cabo en condiciones de GLP usando una habitación limpia de acuerdo con los requisitos ISO7 (10.000 partículas /m
3).
Preparación, purificación y caracterización de EGF-NIR
EGF NIR se sintetizó según LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EE.UU.) utilizando las instrucciones de éster de NHS IRDye 800CW (2-(3-{5-[7-(5-amino-1-carboxy-pentylcarbamoyl)-heptanoylamino]-1-carboxy-pentyl}ureido)-pentanedioic ácido) para la conjugación con EGF humano recombinante (Peprotech, Asia, Rehovot, Israel). Brevemente, EGF (32 nmol) se incubó con 5 equivalentes de éster IRDye 800CW NHS en 1 M K2HPO4, pH 9,0, durante 2 horas en la oscuridad a 20 ° C, con agitación. Después de la conjugación, se aplicó la mezcla de acoplamiento de reactivos libres y EGF-NIR para HiPrep 26/10 (Fine Sephadex G-25, partículas de tamaño de 90 micras) columna de desalación (GE Healthcare, Ciencias naturales, Buckinghamshire, Reino Unido) de un volumen de 55 ml (Vo = 15 ml). Esta columna se equilibró y eluyó a 10 ml /min con agua destilada utilizando instrumentos FPLC AKTA P900 (GE-Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Esto fue seguido por la recogida del pico excluido y ajustándolo a pH 8,0 mediante la adición de 1 ml de tampón de 0,02 M Tris HCl (pH 8,0). La solución se aplicó para la cromatografía de intercambio aniónico en Hitrap DEAE FF (DEAE Sepharose de flujo alto, GE Healthcare, ciencias de la vida, Buckinghamshire, Reino Unido) equilibrada con tampón 0,02 M Tris HCl (pH 8,0) a una velocidad de flujo de 1 ml /min y EGF -NIR se eluyó de la columna usando un gradiente de 1-100% de NaCl en el tampón de equilibrado. El purificada EGF-NIR fue dializado en 3000 cortó bolsas de diálisis (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE.UU.) durante 14 horas en oscuridad a 4 ° C frente a agua destilada. La solución destilada se liofilizó, y 0,1 mg de muestras secas de EGF-NIR disolvió en 1% de ácido trifluoroacético (TFA) fueron finalmente separados por HPLC usando una columna Sperisorb DDS2 (instrumentos LKB, Gaithersburg MD) utilizando dos gradientes lineales: el primer gradiente 10 a 35%, seguido de un segundo gradiente de 35-85% de acetonitrilo en TFA al 1%. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 4,7 ml /min (100 bar de presión). El funcionamiento completo continuó durante 45 min y el pico de EGF-NIR se estimó mediante la absorbancia óptica a 226 y 700 nm. Las concentraciones molares de los tintes y EGF se calcularon utilizando coeficientes de extinción molar de 270.000 M
-1cm
-1 para IRDye 800CW a 780 nm, y 18.000 M
-1cm
-1 para EGF. La absorbancia a 280 nm se utilizó para calcular la concentración de proteína EGF en función de su coeficiente de extinción molar. Se utilizó la absorbancia de longitud de onda dual para determinar colorante: proteína. emisión EGF-NIR se midió en PBS usando un espectrofluorímetro fluoro-Max 4 (JY Horiba, Edison, NJ, EE.UU.) con una lámpara de arco de xenón como fuente de excitación de 774 nm en cubeta de 1 cm, y a una velocidad de barrido de 80 nm /segundo. Para la validación, también se utilizó EGF-NIR de LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EE.UU.). EGF-NIR se presentó para el análisis en 12% SDS-PAGE en comparación con EGF nativo, no marcado. Las muestras de 10 mg proteínas se separaron y se visualizaron por tinción con azul de Coomassie y la emisión NIR se midió por el posicionamiento y escanear el gel en el infrarrojo Imager Odyssey® (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.).
Western Blot de EGFR y ERK fosforilación
Los niveles de EGFR en líneas celulares y tejidos CRC y la fosforilación de Erk, se estimaron a extracción con tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EE.UU.). La capacidad de EGF-NIR para estimular la fosforilación de ERK en células A431 se comparó con la de EGF no marcado. 2 × 10
6 células en 90% de confluencia en una placa de 6 pocillos se mueren de inanición de suero durante 2 horas. medio de inanición se reemplazó con medio normal que contiene 7 nM EGF-NIR. Las células se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se recogieron. 50 g de proteína de lisados fueron separados por 10% de poliacrilamida SDS-PAGE y se transfirieron en hielo a membranas de nitrocelulosa (90 V durante 1,5 horas; Whatman, Dassel, Alemania). La unión no específica fue bloqueada por incubación de las membranas durante 2 horas a temperatura ambiente (TA) con 5% de leche desnatada en polvo (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) en solución salina amortiguadora Tris que contenía 0,1% de Tween-20. La inmunodetección se realizó con anticuerpo monoclonal anti-EGFR (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EE.UU.) o anticuerpos primarios (1:1,000) contra fosfo-o pan-Erk1 /2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EE.UU.), seguido de peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.) y se reveló con ECL (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.)
(a) izquierda:. un esquema de CRC de pólipos con un alto manchas de células transformadas (CRC) y las esferas de actividad zona heterogénea que incluye tanto las células normales y transformadas CRC; Medio: generación de una mezcla heterogénea en diferentes proporciones (%) entre HT-29 y SW 620; 0 - no hay células; + /++ -presencia De diferentes concentraciones de células; Derecha: chapado focal (en un anillo) de HT-29 y A431 monocapa rodeado de SW620 monocapa; insertar el nivel de EGFR (170 kD) y EGFR no maduro (150 kD) en las células; (B) La relación entre la intensidad de NIR de la unión con 7 nM EGF-NIR 15 min (media ± SD, n = 9) y el porcentaje de SW620 en la mezcla de células, ya sea con HT-29 (círculos cerrados) o HCT116 (abierto círculos) * p & lt; 0,05 vs. 100% SW620; (C) La relación entre SBR (media ± SD, n = 9) y la concentración de EGF-NIR; A431 (círculos abiertos); HT-29 (círculos cerrados); unión se realizó durante 15 minutos. Insertar: exploraciones NIR; * P & lt; 0,05 vs. 0,01 nM; (D) La cinética de 7 nM EGF-NIR unión (media ± SD, n = 9) a las culturas focales de A431 (círculos abiertos) o HT-29 (círculos cerrados); Insertar: exploraciones NIR; * P & lt;. 0,05 frente a 0 min
Preparación de
in vitro
Modelos CRC y en Cell Imaging NIR (IC-NIR)
monocapa homogénea de una línea celular individual.
CRC células se sembraron a una densidad de 150.000 células /pocillo en 12 pozos de placas de cultivo de tejidos (Nunc, Rochester, NY, EE.UU.) dos días antes de los experimentos que generan monocapa celular homogénea. A partir de entonces, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contiene 7 nM EGF-NIR, durante 15 min a 4 ° C y 37 ° C, para medir la unión total. Al final del experimento los cultivos se lavaron tres veces con 1 ml de PBS y se estimó la intensidad NIR celular asociada. Para evaluar la unión no específica, cultivos hermanos fueron incubadas con la misma concentración de EGF-NIR, en las mismas condiciones, en presencia de un exceso de 100 nM EGF. La unión específica por imágenes de EGF-NIR se define como la diferencia entre la intensidad NIR del total de la intensidad de unión y NIR de unión no específica. Los experimentos de competición con 500 nM de cetuximab, transformando α del factor de crecimiento (TGF-a) o neuregulina 1 (NRG1) se realizaron por incubación simultánea del competidor con EGF-NIR. Los resultados se presentan como la media ± SD de al menos tres experimentos independientes (n = 9). La formación de imágenes NIR se estima a través de imágenes por infrarrojos Odyssey en las siguientes condiciones de alcance: Resolución: 170-340 micras; área de píxeles: 0,03 mm
2 (aproximadamente 15-20 células); calidad: medio-bajo; centrarse offset: 1-3; Canales: 800 nm; Intensidad: 1-3.
monocapa focal heterogéneo de células CRC
Para imitar los puntos altos de células transformadas de CRC en el pólipo [19] y para permitir mediciones directas de la relación señal a fondo en. el mismo experimento, se utilizó un enfoque de cultivo celular focal. Las diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal (con diferentes niveles de EGFR) o 15 × 10
3 A431 (altos niveles de EGFR) se cultivaron hasta la confluencia en un 4 mm anillo de clonación de diámetro interior (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU. ) colocado en el centro de un pozo. Las células se dejaron adherir durante 2 horas en una incubadora. A partir de entonces, 15 × 10
3 SW620 células (que carece de EGFR) se sembraron en la zona libre de células que rodea el anillo de clonación y se dejaron adherir durante 2 horas en las mismas condiciones. Se realizaron dos tipos de tales experimentos: a. uno de los focos. segundo. dos focos. Al final del paso de adherencia celular, el anillo de clonación se retiró y las células se lavaron con medio de cultivo. Dos días después de generar el modelo, los cultivos se someten a la unión y los experimentos de imagen como se describe anteriormente. relación señal /fondo de valores (SBR) indican la relación de señal fluorescente NIR del círculo central (área focal de CRC o células A431) para la señal fluorescente NIR de la superficie exterior (SW620).
Las diferentes células CRC fueron focalmente chapada sobre un fondo de IEC6 monocapa enterocito. Los cultivos se incubaron durante 15 min a 37 ° C con 7 nM EGF-NIR en presencia (unión no específica - barras blancas) o ausencia (unión total - barras grises) de 100 nM sin modificar EGF. El /la relación de señal (línea celular CRC) de fondo (IEC6) se estimó en condiciones idénticas para todas las culturas y se presentan como la media ± desviación estándar (n = 9). Significado: * p & lt; 0,05 en comparación con los valores IEC6; ** P & lt; 0,05 en comparación con la unión total del respectivo grupo p & lt; 0,05 en comparación con A431 y & amp; p & lt; 0,05 en comparación con COLO 205; inserciones inferiores: exploraciones NIR; inserciones superiores: expresión de la proteína EGFR-izquierda por el Western Blot; flecha indican la posición de EGFR maduro 170 kD proteína y proteína no glicosilada kD 150; expresión de la derecha ARNm de CEA y β-actina en cultivos celulares.
suspensiones heterogénea de células CRC.
Para imitar la distribución heterogénea de células transformadas de CRC en el pólipo [20] y para permitir la evaluación de la sensibilidad de la detección de la cantidad mínima de EGFR células entre los enterocitos normales de control, culturas heterogéneamente mixtos de HT-29 y células SW620 expresando fueron preparados. Los cultivos en suspensión de HT-29 se mezclaron con cultivos en suspensión de SW620 para generar diferente porcentaje del cultivo de células individuales en el mismo volumen. células SW620 podían distinguirse de las células HT-29 por su morfología alargada. En condiciones designadas como "0%" la suspensión contiene 0% HT29 células y 100% de células SW620, y al "100%", la suspensión contiene 100% de células HT-29 y 0% SW620 células. En los otros casos, los porcentajes indican la relación entre 29 HT-porcentaje de células y el porcentaje de células SW620. El enlace de las condiciones experimentales y mediciones de intensidad de fluorescencia NIR (unidades arbitrarias /mm
2) de los diferentes cultivos heterogéneos se realizó como arriba.
(A) Fotografía de un tumor ortotópico y la proteína EGFR expresión en el tumores; (B) Evolución temporal de la acumulación de EGF-NIR en los tejidos de ratones portadores de tumores. Los ratones fueron inyectados i.v. con 1 nmol de EGF-NIR en ratones sin tratar (fila superior, n = 6) o ratones pre-inyectados con 1 mg /ml cetuximab (fila inferior, n = 4); BOI alta resolución de un ratón inyectado con EGF-NIR y los círculos indican las mediciones de ROI (C) Evolución temporal de la acumulación de tejido de EGF-NIR a las 48 horas a partir de ratones presentados en B; intensidad de la señal a 800 nm se normalizaron a la fluorescencia de fondo utilizando un círculo tumor arbitraria (10-20 ROI /ratón) en comparación con una región idéntica en el flanco (músculo adyacente); * P & lt; 0,05 en comparación con EGF-NIR 4 horas; ** P & lt; 0,05 en comparación con los ratones inyectados con EGF-NIR; relación (D) EGF-NIR señal /fondo en el tejido aislado de los ratones portadores de tumores 48 horas después de la inyección. * P & lt; 0,05 en comparación con el músculo, ** p & lt; 0,05 en comparación con el hígado; Insertar: superior fotografías de los tejidos en el plato; Las imágenes de infrarrojo cercano Oriente; mapas de intensidad inferior espectrales; escala-rojo-marrón (5) de alta intensidad de la expresión; azul (3) muy baja expresión.
RT-PCR y EGFR siRNA silenciamiento
El ARN total se aisló y el ADN genómico se degradó a partir de las preparaciones de ARN, utilizando la SV aislamiento total de ARN sistema (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). 1 g de ARN total fue transcrito invertir (Promega, Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR se realizó en un volumen final de 50 l que contenía ADNc de 5 g, 50 pmol de cada sentido aguas arriba y cebadores sentido aguas abajo de CEA o EGFR [21], [22], y 25 l de GoTaq® Mix verde Master (Promega, Madison , WI). PCR experimentos se llevaron a cabo durante 35 ciclos. Para generar varios fragmentos de ADNc, un gradiente Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) se programó como sigue: desnaturalización a 95 ° C durante 1 min, hibridación a 61 ° C y elongación a 72 ° C durante 1 min. Para derribar el protocolo EGFR agente de transfección amina nivel de Ambion (Applied Biosystems, Austin, TX, EE.UU.) fue seguido. Brevemente, 5 nM de 21 mer anti-EGFR Silenciador seleccionar los pequeños ARN de interferencia (siRNA) y revueltos ARN fueron transfectadas de forma inversa en cultivos de células A431 utilizando agente de transfección siPORTNeoFX acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células a una densidad de 80.000 células /ml se aplicaron sobre placas de 12 pocillos y 2 días después de las transfecciones se analizaron. Tumbar de EGFR mRNA fue confirmada por Western Blot. El siguiente antígeno carcinoembrionario (CEA) y cebadores de EGFR, preparado por SyntezzaBioScience Ltd., Jerusalén, Israel, se utilizaron:
Humano CEA CAM5: Sentido: 5'-CGCATACAGTGGTCGAGAGA-3 '; Antisentido: 5'-ATTGCTGGAAAGTCCCATTG-3 '
Rata CEA1: Sentido: 5'-CTACAGGCTGAGGGATGCTC-3' antisentido: 5'-GGTCCCGTCACAGTTACGTT-3 '
EGFR humano: Sentido: 5' CGAGGGCAAATACAGCTT-3 'antisentido: AAATTCACCAATACCTATT-3'
humano EGFR siRNA: sentido: 5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt-3 'antisentido: 5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag-3'
siRNA revueltos: sentido: 5 '-UAACGACGCGACGACGUAATT-3' antisentido: 5'-UUACGUCGUCGCGUCGUUATT-3 '
Preparación y NIR de imagen de CRC ortotópico tumores en ratones
Este estudio utilizando masculino desnudos Balb /c (Harlan , Israel) los ratones se aprobó, realizada y supervisada por las directrices del Comité del Centro Médico de Cuidado y uso de Animales Chaim Sheba. se tripsinizaron las células HT-29, se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10
7 células /ml en PBS. Para la implantación del tumor, los ratones se anestesiaron por inyección intra-peritoneal de una mezcla de ketamina (100 mg /kg) y xilazina (20 mg /kg). inyección trans-anal de 1 × 10
6 HT-29 células se llevó a cabo con una lupa microscopio (X40) utilizando una aguja de 27 g. La inyección fue dirigida por vía submucosa en el recto distal, posterior, de aproximadamente 2 a 3 mm más allá del canal anal y en la mucosa rectal [23]. Los ratones se controlaron dos veces por semana durante la iniciación del tumor y la progresión. Tumores alcanzaron ~ 0,75 cm de tamaño a las 3-4 semanas.
In vivo
de formación de imágenes de EGF-NIR de fluorescencia en ratones se realizó con un LI-COR Biosciences pequeños animales de imágenes Odyssey MousePOD®. Para visualizar los tumores, 1 nmol de EGF-NIR en 100 salina l se inyectó a través de la vena de la cola en los ratones de tumor positivo en presencia (n = 4) o ausencia (n = 6) de cetuximab (1 mg /ml) y evaluado para el aclaramiento sistémico mediante imágenes NIR a intervalos de 1-8 horas durante un período de tres días, después de lo cual el tiempo & gt; 95% de la señal se había aclarado. Los ratones fueron imágenes hasta dos días después de la inyección y sacrificados. El análisis estadístico de las imágenes para cada ratón se normalizó utilizando las mismas escalas de intensidad, en las condiciones descritas anteriormente. SBR se calculó como sigue: intensidad media NIR del tumor dividido por la intensidad media de NIR del fondo del músculo adyacente. Las regiones de interés (ROI) con áreas idénticas se utilizaron tanto para el tumor y el fondo. La desviación estándar de la media de los fondos se calculó utilizando 10-20 ROI. Debido a las diferencias de tamaño del tumor entre los animales que recibieron EGF-NIR, la señal del tumor dividido por la señal de fondo de ROI tamaño similar corregido para la zona (píxeles), siempre que el tumor de dos (2D) etiquetado total de dimensiones. Los tumores, músculo esquelético y tejido hepático de los ratones sacrificados se diseccionaron y se recogieron sus muestras de orina. Los tejidos se pesaron y se introdujeron en tubos de plástico platos. Los platos fueron digitalizadas en la Odisea de imágenes por infrarrojos. intensidad NIR de ROI del tumor se comparó con el músculo adyacente para generar SBR. análisis tejido aislado se realizaron en los escaneos en 800 nm canal, para el tejido acumulado señal de fluorescencia EGF-NIR y el SBR se calculó. La formación de imágenes NIR se estimó en las siguientes condiciones: Resolución: 170-340 micras; área de píxeles: 0,03 mm
2; calidad: medio-bajo; centrarse offset: 1-3; Canales: 800 nm; Intensidad: 1-3.
Pacientes y CRC de tejidos extracción de pruebas
18 pacientes mayores de 18 años con diagnóstico histológico de adenocarcinoma primario de colon se les ofreció la participación en el estudio. 5 pacientes que recibieron radiación o quimioterapia antes no eran elegibles para el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional (IRB, Comité de Helsinki) de la Universidad Hebrea Hadassah Medical Center. Todas las muestras se obtuvieron a partir de consentir los sujetos del estudio sometidos a resección quirúrgica del tumor que firmaron un consentimiento informado por escrito. Todas las muestras se sometieron a análisis macroscópicos y microscópicos de rutina por un patólogo certificado por la junta según el Colegio Americano de Patólogos (CAP) directrices de presentación de informes histopatología (www.cap.org). Los tejidos identificados por el estudio forense como adenocarcinoma de colon y los tejidos adyacentes [24] a continuación, se utilizaron para la imagen IC-NIR.
36 Rebanadas de tejidos de CRC y 19 rebanadas de tejido del colon adyacente (n = 10-15 retorno de la inversión en cada rebanada) se sometieron a
ex vivo
ensayo de unión durante 45 minutos a 37 ° C con 70 nM EGF-NIR en presencia (no específico) o ausencia (unión total) de 1 mM no marcada EGF. La intensidad NIR se estimó en condiciones idénticas para todos los sectores (n = 12). Significado: * p & lt; 0,01 en comparación con el grupo respectivo en EGFR de colon adyacente, ** p & lt; 0,05 en comparación con el grupo respectivo en CRC tejido EGFR; Insertar: Western Blot típico para EGFR de las rodajas investigados
Imágenes de cinco rebanadas típicos, etiquetados específicamente con EGF-NIR, como se describe en la leyenda de la Fig.. 7. El 800 nm de imágenes por infrarrojos Odyssey obtuvo imágenes se procesaron usando el software de imagen espectral aplicada, Vista espectral. escala-rojo-marrón (5) alta expresión de la unión de EGF-NIR intensidad; verde (4) expresión intermedia; azul (3) muy baja expresión.
NIR BOI del CRC tejidos
tejido tumoral fresco o tejidos de colon adyacentes se dividieron en rebanadas horizontales, 230 m de espesor, que se prepararon usando una vibratome VT1000S (Leica, Nussloch, Alemania) y se incubaron en solución de enlace DMEM enfriado con hielo. Las rodajas se transfirieron a placas de 24 pocillo de cultivo tisular llenos de DMEM saturado con 95% de O
2 y 5% de CO
2 similar a las condiciones que permitan cultivos de órganos rectales [25]. Las placas se mantuvieron en hielo durante 45 min de duración en DMEM y el experimento de unión se realizó mediante la adición de 70 nM EGF-NIR en presencia (unión no específica) o ausencia (unión total) de 1 M de no modificada EGF. De cada tejido, rebanadas por triplicado se incubaron con 70 nM NIR en colorantes (IRDye800CW) para evaluar la unión no específica del colorante. El experimento de unión se terminó lavando el tejido tres veces con PBS frío. Las rodajas húmedos se transfirieron a nuevas placas de 24 pocillos en 1 ml /pocillo de PBS y analizan en busca de la formación de imágenes NIR intensidad usando Odyssey Infrared Imager, en las condiciones descritas anteriormente. En serie, durante un período de dos años, se evaluaron 43 CRC y 23 muestras de tejido de colon adyacentes. ROIs con áreas idénticas se utilizaron para las rebanadas de los diferentes grupos experimentales. Los medios y las desviaciones estándar de la intensidad NIR (unidades arbitrarias fluorescentes /mm
2 de área) se calcularon utilizando 10-15 ROI en cada división individual. Cada rebanada presentado para el experimento de unión de EGF-NIR también se evaluó después de la proyección de imagen para la expresión de EGFR por el Western Blot. Los datos obtenidos se clasifican de acuerdo con EGFR positivo tejidos, tejidos de CRC CRC negativos EGFR y el tejido del colon adyacente, que en la mayoría eran EGFR negativo. La falta de EGFR se demostró por Western Blot. 85% de las rodajas se incluyeron en los análisis estadísticos de acuerdo a los siguientes criterios farmacológico: a. La unión total; segundo. Figs. Higo.