Extracto
El objetivo de este trabajo fue para revelar las características metabólicas de las mitocondrias que podrían ser esenciales para la inhibición de potencial apoptótico en células de cáncer de próstata. Estudiamos las mitocondrias aisladas de células normales de la próstata epiteliales (PrEC), líneas celulares de cáncer de próstata metastásico LNCaP, PC-3, DU145; y las células de cáncer de próstata no - células de fibrosarcoma HT1080 humano; y células linfoblastoides humanas normales. células PrEC contenían 2 a 4 veces menos mitocondrias por gramo de células que las tres líneas celulares PC. actividades respiratorias de las mitocondrias de células PrEC fueron 5-20 veces menor que las mitocondrias de PC, en función de los sustratos y el estado metabólico, debido al contenido de más y más la actividad de los complejos de enzimas respiratorias. Las mitocondrias de las tres líneas celulares de cáncer de próstata metastásico reveló varias características que son distintivos sólo para estas células: baja afinidad del complejo I de NADH, potenciales 20-30 mV superior membrana eléctrica (ΔΨ). Sin protección con ciclosporina A (CsA) los PC-3 mitocondrias requieren 4 veces más Ca
2 + para abrir el poro de transición de permeabilidad (MPTP) cuando se comparan con las mitocondrias PrEC, y que no se sometieron a la inflamación, incluso en presencia de alameticina , un gran formador de poros antibiótico. En presencia de CsA, la mitocondria PC-3 no se abrió espontáneamente la MPTP. Llegamos a la conclusión de que el bajo potencial de apoptosis de las células metastásicas de PC puede surgir de la inhibición de la Ca
2 + -dependiente de transición de permeabilidad debido a un muy alto ΔΨ y una mayor capacidad de secuestrar Ca
2 +. Sugerimos que debido a la alta ΔΨ, el metabolismo mitocondrial de las células de cáncer de próstata metastásico se basa principalmente en la utilización de glutamato y glutamina, que puede promover el desarrollo de la caquexia
Visto:. Panov A, Orynbayeva Z (2013) bioenergética y antiapoptótico Propiedades de mitocondrias de cultivadas de cáncer de próstata humano líneas de células PC-3, DU145 y LNCaP. PLoS ONE 8 (8): e72078. doi: 10.1371 /journal.pone.0072078
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Febrero, 2013; Aceptado: July 5, 2013; Publicado: 8 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Panov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Grant Nacional institutos de la Salud CA69764 (a Petros JA), Universidad de Emory Fiduciario para la Investigación urológica. Cornelio F. J. Beukenkamp Fundación para la Investigación del Cáncer de Próstata. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
próstata es la principal causa de muerte por cáncer en hombres de edad entre 55-74, y por encima de los 75 años es la segunda causa de muerte en los hombres de América del Norte después del cáncer de pulmón y bronquios [1,2 ]. Esencialmente todos los hombres con enfermedad avanzada, que pasaron por las terapias de privación de andrógenos, eventualmente mueren a causa del desarrollo del cáncer de próstata metastásico andrógeno-independiente [1,3,4]. El alto nivel de mortalidad por cáncer de próstata se asocia con la proliferación activa del adenocarcinoma de próstata que difunde a órganos distantes con las preferencias al tejido óseo [5]. Hay una gran cantidad de datos, lo que indica que la progresión de los tumores prostáticos primarios y metastásicos se determina por la pérdida de de la célula apoptótica potencial [6-8].
La participación de las mitocondrias en la apoptosis ha sido demostrada por un gran número de informes que describen alteraciones mitocondriales proapoptóticos, como la producción de especies de oxígeno reactivas (ROS), el agotamiento de ATP, y la inducción del poro de permeabilidad mitocondrial transición (MPTP) [9-11]. Se ha demostrado que otras proteínas reguladores de la apoptosis de esta familia Bcl-2 y se encuentran en los sitios de unión mitocondriales de las membranas interior y exterior o el espacio intermembrana y regulan la apoptosis a través de sus efectos sobre la transición de permeabilidad mitocondrial [12-15]. Los estudios sobre las relaciones entre la inducción de la apoptosis en células de cáncer de próstata y la expresión de proteínas relacionadas con Bax Bcl-2 y dieron resultados contradictorios [16-21], y los datos sugieren que la Bcl-2, Bcl-XL y algunas otras proteínas relacionadas con la apoptosis no son importantes para la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata [18,19,22-24]. Por otra parte, la apertura del poro de transición de permeabilidad depende directamente de las propiedades mitocondriales tales como membrana de potencial eléctrico (ΔΨ), la producción de ROS [25], y la actividad respiratoria [26-28]. Por lo tanto, es importante entender los aspectos bioquímicos y fisiológicos de la funcionalidad mitocondrial como un portero de central en la incapacidad de las células de cáncer de próstata que se comprometan a la muerte celular programada
.
Si bien hay muchos informes sobre la inducción de apoptosis en la próstata células a través de la modulación del metabolismo mitocondrial [29-31], en general no se sabe mucho acerca de la bioenergética y funciones mitocondriales de las células prostáticas normales o cancerosas, salvo las diferencias en su metabolismo de ácido cítrico [32] y mitocondrial L-lactato [33]. Se ha demostrado que a diferencia de la mayoría de los tejidos malignos, las células tumorales de próstata se caracterizan por una baja tasa de glucólisis y la captación de glucosa [34,35], y por la absorción preferencial de los ácidos grasos sobre la glucosa [36]. La alta plasticidad bioquímica de las células del cáncer de próstata les ayuda a adaptar su metabolismo a condiciones de hipoxia tumoral típica [37]. Sin embargo, en muchos de estos estudios sobre el metabolismo mitocondrial en las células de cáncer de próstata, los autores utilizaron antibióticos [29,31,36-38]. Se sabe que los antibióticos aminoglucósidos (estreptomicina, gentamicina) son mitotoxic [39-41]. Hemos establecido que las mitocondrias aisladas de células de cáncer de próstata, células linfoblastoides humanas y hepatocitos cultivados en presencia de estreptomicina no respiran en ningún sustrato. Así, las células en los cultivos que contenían antibióticos no mantienen el metabolismo aeróbico y glucólisis es la única fuente de ATP. Por lo tanto muchas de las conclusiones obtenidas en cultivos celulares con antibióticos han de considerarse con precaución.
Los primeros estudios sobre la estructura ultramicroscopic de las células normales y cancerosas de la próstata han indicado que las células del cáncer de próstata muestran un aumento notable en el número y pleomorfismo de mitocondria [42]. Esto separa el cáncer de próstata a partir de otros tipos de cáncer, donde la transformación maligna suele ir acompañado de una disminución significativa en mitocondrias de la célula [43].
En la próstata normal, las células epiteliales secretan un alto nivel de citrato probablemente debido a su relativa incapacidad para oxidar citrato a través del ciclo de Krebs [32,44]. los niveles de citrato de próstata aumentan aún más en hiperplasia benigna de próstata, pero descienden drásticamente durante el desarrollo del cáncer de próstata, presumiblemente porque las mitocondrias cancerosas adquieren la capacidad de oxidar el citrato [32]. Esta propiedad metabólica de las mitocondrias cáncer de próstata es la antítesis de la observada para muchos tipos de cáncer de crecimiento rápido, en el que el ciclo de Krebs cambia de utilización de citrato para la producción de citrato, lo que resulta en un aumento de la producción de colesterol [45].
La contribución de metabolismo de la energía en el desarrollo y progresión del cáncer se ha descrito en una serie de obras [44,46,47]. Se cree que para que la terapia contra el cáncer con el cáncer específico, las características metabólicas bioenergéticos de cada tipo de tumor tienen que ser dilucidado primero. Las alteraciones en las funciones bioenergéticas de cáncer de próstata humano LNCaP, DU145 y células PC-3 se ha demostrado estar relacionada con disfunciones mitocondriales [38], mientras que los mecanismos detallados de la patología mitocondrial siguen siendo inciertas. El propósito de este estudio fue determinar las características metabólicas de las mitocondrias que podrían contribuir a la inhibición de la apoptosis en células de cáncer de próstata. Debido a la heterogeneidad extraordinaria conocida de cáncer de próstata se analizaron las propiedades bioenergéticas mitocondriales de las líneas celulares de cáncer de próstata tres, a saber, PC-3, LNCaP y DU145, que difieren en su origen, la tumorigenicidad, la respuesta a los andrógenos, y las tasas de proliferación [38,43,48 , 49]. Para la comparación, se estudió la mitocondria de las células cultivadas normales humanos epiteliales de la próstata (PrEC). Todas estas líneas celulares son prácticamente sin estudiar en términos de las funciones mitocondriales. Para efectos de comparación, se estudió también un fibrosarcoma humano HT1080 línea celular no prostático. Las células linfoblásticas humanas normales transformadas con EBV (HLB) sirvieron como una referencia a la forma en las mitocondrias de las células normales en cultivo responden a Ca
2 + cargas y ciclosporina A.
Esta es la primera investigación sobre las propiedades bioenergéticas y el Ca
2 + dependiente de transición de la permeabilidad de las mitocondrias aisladas de las líneas celulares de cáncer de próstata establecidos y células PrEC humanos normales. Presentamos aquí que las mitocondrias de las tres líneas celulares de cáncer de próstata metastásico tiene una serie de características metabólicas distintas: un mayor membrana eléctrica de 20 a 30 mV de potencial (ΔΨ), baja afinidad del complejo I de NADH, una mayor resistencia a Ca
2+ cargas, y una respuesta inusual a la ciclosporina a y el formador de poros antibiótico alameticina, en comparación con el PREC y mitocondrias normales HLB. Las características observadas en las mitocondrias de cáncer de próstata pueden proteger a las células de cáncer de próstata a partir de la apoptosis mediante la inhibición directa e indirecta de transición de permeabilidad mitocondrial.
Resultados
rendimientos mitocondriales
La figura 1 muestra la rendimientos de mitocondrias aisladas de las células bajo estudio. En comparación con la PC-3, las células de cáncer de próstata DU145 y LNCaP, células normales de la próstata PrEC produjeron correspondientemente 2.1, 2.3 y 4.6 veces menos mitocondrias por gramo de células. Se obtuvieron los mayores rendimientos entre las células de cáncer de próstata con células LNCaP, y también con células de fibrosarcoma (HT1080C) y células linfoblásticas humanas normales (HLB). Los rendimientos fueron bastante consistentes para una línea celular dada, pero varió entre las líneas de células [50].
mitocondrias se preparó como se describe en Métodos. Los resultados se presentan como media ± SE, n = 5-7 (aislamientos independientes de las células). Los valores se expresan como proteína mitocondrial mg por 1 gramo de células húmedas. Estadísticas: **
p Hotel & lt; 0,05; ***
p Hotel & lt; 0.001. Los valores para las células de cáncer de próstata PC-3, DU145 y LNCaP se compararon con las células normales de la próstata PrEC.
actividades respiratorias de mitocondrias aisladas de las células cultivadas
Figura 2 muestra las actividades respiratorias de la mitocondria en diversos estados metabólicos. Debido a lo limitado de los rendimientos de las mitocondrias de las células cultivadas, en particular de las células normales PrEC, que limita la selección de los sustratos de succinato, glutamato + malato, citrato y malato +. Citrato fue seleccionado debido a las notables diferencias en el metabolismo de citrato en tejidos prostáticos normales y malignos (32,44). oxidación de succinato es una alternativa a los sustratos fuente dependiente de NAD de electrones. La oxidación de glutamato + malato proporciona electrones para el Complejo I, pero también puede reflejar el funcionamiento del ciclo de Krebs en el modo de división. Además, en los experimentos preliminares hemos encontrado que las mitocondrias de cáncer de próstata oxidan glutamato + malato a tarifas más altas que el piruvato + malato.
Las condiciones de incubación se describen en Métodos. Sustratos: succinato 10 mM; glutamato 10 mM + malato de 2 mm; citrato 10 mM + malato de 2 mm. La fosforilación oxidativa (estado 3) la respiración se vio estimulado por la adición de 150 ADP M; la respiración desacoplada (Estado 3U) fue estimulada por la adición de 0,5 M cianuro
m
-chlorophenylhydrazone (CCCP). controles respiratorios se calcularon como las proporciones de la tasa de respiración Estado 3 a la velocidad de respiración en el estado 4
0 (antes de la adición de ADP).
Con succinato y glutamato + malato, las actividades respiratorias de las mitocondrias a partir de los tres tipos de células PC en estudio fueron colector superior en todos los estados metabólicos, en comparación con las mitocondrias de las células PrEC normal (Figura 2).
en cierta medida, la eficacia de la fosforilación oxidativa mitocondrial puede ser evaluado por los coeficientes de control respiratorio (RCR), que se calculan como la relación de la frecuencia respiratoria en el estado 3 (fosforilación oxidativa) a la frecuencia respiratoria en el Estado 4 (respiración en reposo). Sin embargo, las tasas absolutas la respiración en el Estado 3 Estado 4 y, también son muy importantes para la comprensión de la energética mitocondrial. En general, en las mitocondrias de los tejidos normales aislados en presencia de albúmina de suero bovino, los valores son más altos RCR con los sustratos dependientes de NAD que con succinato [51].
En general, los datos presentados en la Figura 2 demuestran claramente que las mitocondrias normales PrEC difieren significativamente de las mitocondrias de células de cáncer de próstata, así como de las células normales y malignas no prostático. Las figuras 1 y 2 muestran que la transformación del cáncer de células de tejido normales de la próstata fue acompañado por aumento de varias veces en el contenido de mitocondrias por célula y el aumento muchas veces en la actividad respiratoria mitocondrial.
Cuando normal o cáncer de próstata mitocondrias de las células de succinato oxidado, la adición de ADP o un desacoplador (CCCP) produjeron tasas respiratorias altas que las tasas correspondientes para los sustratos dependientes de NAD (Figura 2). Por lo tanto, las bajas tasas de Estado 3 oxidación de glutamato y citrato en las mitocondrias de cáncer no fueron causadas por una baja actividad del transportista ATP /ADP, ATP sintasa, o las actividades de los complejos III y IV, sino más bien, por la baja actividad del complejo I (NADH deshidrogenasa).
potenciales de membrana eléctrica de las mitocondrias de las células de la próstata y no próstata
altos potenciales de membrana mitocondrial en las células de carcinoma, incluyendo las células de cáncer de próstata, en comparación con las células epiteliales normales, han sido reportados en varios estudios [52]. Sin embargo, la mayoría de estos datos se obtuvieron con colorantes catiónicos fluorescentes (Rodamina 123, JC-1, etc.) que dan sólo una evaluación cualitativa de ΔΨ, y, a veces, resultados erróneos. Las trampas de los métodos fluorescentes para la evaluación de la activación mitocondrial en las células se han discutido en la literatura [53,54]. Con las mitocondrias aisladas, se utilizó una TPP
+ - electrodo sensible que permite evaluar cuantitativamente los valores de los potenciales de membrana ΔΨ superior a -100 mV [55]
Figura 3 muestra los valores de ΔΨ para las mitocondrias aisladas. de las líneas de células bajo estudio. Estos valores se calcularon utilizando las correcciones para la unión de TPP
+ a la membrana interna y la matriz (IBC, constante de unión interna) estimado de acuerdo con [56] y suponiendo que el volumen de la matriz de 1 l por 1 mg de proteína mitocondrial. La Figura 3 muestra que los valores ΔΨ para las mitocondrias de cáncer de próstata eran de 20 a 30 mV más alto que los estimados para las células PrEC, y para las células HT1080C cáncer no prostático, para los cuales el método de colorante fluorescente mostró mayor que normal de la membrana potencial [52] . Es importante destacar que, de alta ΔΨ en las mitocondrias de las células cancerosas de la próstata (PC) no se observó en las células, que se recogieron de los matraces de cultivo que alcanzaron aproximadamente el 80-90% de confluencia. Las mitocondrias de los cultivos casi confluentes de células PC tenía ΔΨ continuación -150 mV. Cualitativamente, se obtuvieron resultados similares con el cultivaron células PC-3 en 60% y 90% de confluencia, cuando las células se tiñeron con los tintes fluorescentes de mitocondrias específicas con diferente afinidad por energizado mitocondrias (datos no se muestran).
Las condiciones de incubación y el cálculo de ΔΨ como -mv se describen en Métodos. Los valores se expresan como media (-mv) ± SE. Estadísticas: **
p Hotel & lt; 0,05; ***
p Hotel & lt; 0.001. Los valores para las células de cáncer de próstata PC-3, DU145 y LNCaP se compararon con las células normales de la próstata PrEC.
propiedades cinéticas de Complejo I en las partículas submitocondriales (SMP)
Para saber ¿Por qué la mitocondrias aisladas de células PC mostró actividades relativamente bajas con el sustrato NAD (glutamato + malato, citrato malato +) en comparación con succinato, estudiamos las propiedades cinéticas de I. Complejo el ensayo de Complejo I implica NADH como el donador de electrones y un aceptor de electrones artificial adecuada. Hasta ahora, 6-decilo ubiquinona (DB) es la mejor y la más usada receptor de electrones [57]. El complejo deshidrogenasa NADH consta de 46 subunidades que se organizan en estructura en forma de L, con el dominio hidrofóbico embebido en la membrana interna y el hidrófilo "brazo" que sobresale en el espacio de la matriz, y que ha sitios para NADH [58] de unión. El dominio hidrófobo abarca todas las subunidades codificadas 7 ADN mitocondrial (ADNmt) que incluyen el dominio de unión coenzima Q del Complejo I en SMP cancerosos y no cancerosos. En primer lugar, se estimó la concentración óptima de DB para cada tipo de mitocondrias. Para ello se titularon DB en presencia de un exceso de NADH (Figura 4 A, B) y, a continuación titulada NADH en presencia de la concentración óptima de DB para la determinación de las constantes de Michaelis (Km) para NADH (Figura 5).
Las condiciones de incubación se describen en los métodos. SMP (0,15 mg) se incubaron con varias concentraciones de DB durante 5 min a 30
oC; la reacción se inició por adición de NADH 1 mM
Panel A:.. la tasa de reducción por DB SMP de LNCaP (■), PC-3 (●) y DU145 (▲) células
Panel B:. la tasa de reducción por DB SMP de PrEC (■), células de HLB (▲), y HFS (●) guía empresas
las condiciones de incubación como en la figura 2.
en la LNCaP y PC-3 y en cierta medida para líneas celulares de cáncer de próstata DU145, las actividades del complejo I, medido como el porcentaje de reducción de la DB, eran altos y mostró un rango de concentración de DB sorprendentemente estrecha para tasa máxima de NADH oxidación (Figura 4A). Por el contrario, la actividad del complejo I de SMP PrEC, HFS, y las células de HLB, fueron más bajos y mostró una gama bastante amplia de las concentraciones de base de datos que proporcionan las actividades máximas, aunque las actividades en sí difirieron significativamente (Figura 4A, B). El SMP de las células PREC y HFS mostró actividades específicas muy bajas Complejo I en comparación al PSM de HLB y las mitocondrias células PC. Las grandes diferencias en las respuestas a los cambios en la concentración de DB observado entre las mitocondrias de las células PC (Figura 4A) y las células normales PREC y las células no de próstata (Figura 4B) pueden proporcionar una indicación de las diferencias en las interacciones lípido-proteína en las membranas mitocondriales, que podría ser responsable de la inusual falta de respuesta de las mitocondrias de las células PC tras la adición alameticina, un péptido de formación de poros (ver Figura 6).
las condiciones de incubación (medio B) sacarosa 210 mM, KCl 20 mM, 3 mM de glicil-glicina, pH 7,2, KH
2 PO
4 1 mM, succinato 10 mM, mitocondrias 0,5 mg, volumen final de 1,0 ml. hinchamiento mitocondrial se registró como la densidad óptica (DO) a 520 nm utilizando Shimadzu Multispec-1501 espectrofotómetro modelo. Adiciones: Ca
2 + 50 nmol /ml, alameticina 4 mg /ml
Figura 5 muestra un experimento representativo de las mediciones de los parámetros cinéticos complejo I para la oxidación del NADH en presencia de. la concentración óptima DB se muestra en la Figura 4. No hubo diferencias significativas entre los SMP de las células PC y otras líneas celulares. SMP de las tres líneas celulares de cáncer de próstata tenía relativamente baja afinidad similar, por NADH (K
H
NADH = 20 + 2,5 M). En comparación, las afinidades para NADH fueron correspondientemente 5, 4, y 11 veces mayor que con el SMP de PrEC (K
M
NADH = 4 + 0,5 M), HT1080C (K
M
NADH = 5 + 2 M), y las células HLB (K
M
NADH = 1,8 + 0,1 M). La baja afinidad por el NADH podría explicar en cierta medida las tasas relativamente bajas de Estado 3 oxidación de los sustratos dependientes de NAD por las mitocondrias células PC (ver Figura 2).
Los valores de V
MAX NADH para la oxidación por el Complejo I también fueron sorprendentemente diferentes entre SMP partir de las células de cáncer de próstata y células PrEC. V
MAX refleja en gran medida la cantidad de una enzima presente en el sistema en estudio [59]. El V
MAX valores para el Complejo fuera mM DB ,3-,45 reduce /min /mg de proteína para las células de cáncer de próstata, y DB mM 0,028 reducida /min /mg de proteína para la PrEC SMP, a 10 a 16 veces diferencia. Así, las células PrEC no sólo tenían menos mitocondria, pero las mitocondrias también tenían un contenido mucho más bajo del complejo I por mitocondria de las mitocondrias de las células del cáncer de próstata metastásico.
Ca
2 + inducida por la permeabilidad de transición de PC- 3 y HLB mitocondrias
Durante mucho tiempo, la mayor parte de nuestro conocimiento sobre el Ca
2 + -dependiente de transición de permeabilidad de las mitocondrias se basa casi exclusivamente en los experimentos con las mitocondrias de hígado de rata (RLM) [60] . Large hinchazón osmótica amplitud de RLM se consideró como una manifestación clásica de la apertura del poro de transición de permeabilidad inducida por el calcio en presencia de fosfato inorgánico (CAPI) (véase la Figura 6). Sin embargo, encontramos que a diferencia de RLM, las mitocondrias de otros tejidos no pueden someterse a la inflamación [28], e incluso la despolarización de las mitocondrias durante el secuestro de calcio no es indicativo de transición de permeabilidad [50]. Se demuestra que las mitocondrias del HLB y PC-3 células no fueron sometidos a gran amplitud hinchazón durante Ca
2 + cargas (Figura 6). HLB mitocondrias se sometieron a hinchamiento tras la adición de alameticina, un poro no específica bacteriana formación de antibióticos, mientras que alameticina no fue eficaz con los PC-3 mitocondrias (Figura 6). Por lo tanto gran hinchazón amplitud de las mitocondrias no se puede utilizar con el HLB y PC-3 mitocondrias como una indicación de apertura del poro de transición de permeabilidad. Por lo tanto, hemos utilizado otros métodos para registrar la transición de permeabilidad en estas mitocondrias.
Como se ha mencionado en los métodos, hemos restringido el ensayo de la transición de la permeabilidad de las mitocondrias de las células de HLB que pueden ser cultivadas en las botellas rotativas, y el PREC y células PC-3 que pueden ser cosechados sin tratamiento de las células con una proteasa. La razón de esto radica en nuestra observación de que el tratamiento de un tejido (músculo esquelético, músculo del corazón, el hígado) antes de la homogeneización, o mitocondrias aisladas con Nagarase o tripsina aumentó significativamente la capacidad de retención mitocondrial de calcio (Panov A, datos no publicados).
figuras 7 y 8 muestran los cambios de potencial de membrana y el pH del medio durante Ca gradual
2 + carga del sin protección HLB y PC 3-mitocondrias oxidantes succinato (Figura 7), y las mitocondrias protegidos por 0,5 M de ciclosporina A (Figura 8). Como las mitocondrias consumen añadieron Ca
2 + a través de la uniporter calcio electrógeno, el ΔΨ cayó, y luego fue restaurada al nivel inicial. A medida que se añade cada vez más Ca
2 +, la bicicleta electrógeno de calcio también aumentó y esto era responsable de la disminución gradual de la ΔΨ. Cuando abre el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP), ΔΨ se derrumbó casi al instante con la mitocondria HLB y muy lentamente con las mitocondrias de las células PC-3. El método de registro de pH Ca
2 + consumo por las mitocondrias permite registrar con precisión el momento de la abertura de MPTP. El método de pH es la más fiable para la evaluación cuantitativa de la cantidad de Ca
2 + consumida por la mitocondria antes de que ocurra la transición de permeabilidad - la capacidad de retención de calcio (CRC) [28,50]. Cuando MPTP se abrió, la alcalinización del medio de incubación se asoció con la disociación de trifosfato de calcio (Ca
3 (PO
4)
2) en la matriz, y la unión de H
+ a los liberados PO
4
3- anión para formar HPO
4
2 y H
2 PO
4
- aniones en conformidad con el pH del tampón [28,61]. Por lo tanto alcalinización del medio de manera inequívoca marca el momento de la apertura del PTP. Hemos implementado medidas simultáneas de la ΔΨ y pH. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la despolarización de las mitocondrias no siempre está asociado con la apertura del MPTP, mientras que la apertura de MPTP siempre resulta en el colapso de ΔΨ [50,60]. Esto se ilustra en las figuras 7 y 8. En el experimento con HLB mitocondrias (Figura 7), la despolarización instantánea de las mitocondrias y alcalinización del medio producido casi al mismo tiempo debido a la apertura del poro grande.
(A) mitocondrias de linfoblastos humanos. (B) Las mitocondrias de células PC-3 de cáncer de próstata. Adiciones: TPP
+ se añadió en 0,5 M alícuotas, concentración final de 1,5 micras; Ca
2 + 20 nmol /ml, HCl 125 nmol /ml causó ΔpH de 0,07.
(A) mitocondrias de linfoblastos humanos. (B) Las mitocondrias de células PC-3 de cáncer de próstata. Las condiciones de incubación como en la Figura 8, excepto que la CsA 0,5 M estaba presente. Adiciones: TPP
+ se añadió en 0,5 M alícuotas, concentración final de 1,5 micras; Ca
2 + 20 nmol /ml, CCCP 0,5 M, HCl 125 nmol /ml causaron ΔpH de 0,07.
La figura 8 muestra las respuestas a Ca
2 + del HLB (Figura 8A) y PC-3 (Figura 8B) mitocondrias tratadas con ciclosporina A (CsA). CsA es el más potente inhibidor conocido de la transición de permeabilidad. Normalmente, CsA retrasa fuertemente el inicio de la MPT, pero no impide que, como se ilustra en el caso de las mitocondrias de HLB (comparar las figuras 7A y 8A) cuando CsA aumentó el pliegue CRC1.5. Sin embargo, no fue posible inducir la apertura MPTP por la carga de calcio de los PC-3 mitocondrias protegidas con CsA (Figura 8B). disminución gradual de la señal del TPP
+ - electrodo sensible más probable refleja el desplazamiento de TPP
+ de la matriz mediante la acumulación de sales de fosfato de calcio, en lugar de la verdadera despolarización [28]. La traza de pH, que se muestra en la Figura 8B, demuestra que a diferencia de las mitocondrias de HLB, PC-3 mitocondrias en presencia de CsA protones extruidos de forma desigual, con diferentes H
+ /Ca
2 + ratios. En comparación con las mitocondrias no protegido, en presencia de CsA los PC-3 mitocondrias eran capaces de consumir gran cantidad de calcio sin necesidad de abrir la MPTP. Podríamos permitir que el Ca
2 + liberación y apertura del MPTP solamente mediante la adición de CCCP, un protonóforo que estimula la despolarización mitocondrial. Antes de la adición de CCCP, los PC-3 mitocondrias eran capaces de consumir casi 5 veces más Ca
2 + en presencia de CsA (Figura 8B), que en el experimento de control (Figura 7B). Por lo tanto, los experimentos presentados en las Figuras 7 y 8 muestran que las mitocondrias de PC-3 tienen propiedades anormales del Ca
2 + transición de permeabilidad inducida. Con la mitocondria PrEC, en presencia de CsA el CRC aumentó de 20 a sólo el 40 nmol Ca
2 + /mg de proteína (Figura 9).
Condiciones
incubación como en las figuras 7-8. Las barras grises - mitocondrias no protegidos oxidantes succinato, barras oscuras -mitochondria protegidos por ciclosporina A 0.5 M + oligomicina 2 mg /ml + ADP 50 mM. Los datos son M ± error estándar calculado a partir de 3 aislamientos independientes de las mitocondrias. Los datos se expresan como nanomoles Ca
2 + proteína mitocondrial /mg. Estadísticas: *
p Hotel & lt; 0,1; ***
p Hotel & lt; 0.001. Los datos para protegidas por las mitocondrias de CsA se compararon con la mitocondria no protegidas correspondientes. Los datos de las mitocondrias de las células PC-3 se compararon con las de las mitocondrias de las células PrEC.
Figura 9 compara las capacidades de retención de calcio de las mitocondrias de las células normales de la próstata PrEC, células normales de HLB y el cáncer de próstata células PC-3 oxidantes succinato en ausencia y en presencia de ciclosporina A. Hemos demostrado anteriormente que los CRCs de las mitocondrias aisladas de las líneas celulares similares, pero procedente de diferentes individuos, variaron significativamente [50]. Por lo tanto, las respuestas a Ca
2 + CsA y de las mitocondrias de diferentes líneas celulares sólo se pueden evaluar cualitativamente. Figura 9 muestra que sin protección mitocondrias PrEC, tenía capacidad despreciable para retener Ca
2 + (alrededor de 20 nmol Ca
2 + /mg de proteína), mientras que PC-3 mitocondrias tenían un 4 veces mayor resistencia a las cargas de calcio. En las mitocondrias protegidas con CsA, la CRC para PrEC mitocondrias aumentó 2 veces, por HLB mitocondrias del CRC se incrementó en un 50%, mientras que para la mitocondria PC-3, el CRC aumentó casi 5 veces y fue 9 veces mayor que el de PREC mitocondrias. Es importante destacar que, a diferencia de las mitocondrias de las células PREC y HLB, los CsA-protegida PC-3 mitocondrias no se abrieron poro de transición de permeabilidad de forma espontánea, pero sólo después de la adición del CCCP protonóforo.
Discusión
La las células cancerosas y no cancerosas utilizadas en este estudio se originaron de diferentes tejidos y personas [38,43,48,49]. Diferencias en las condiciones de cultivo también pueden contribuir a las diferencias observadas en los parámetros metabólicos de las células. Anteriormente se ha encontrado que las mitocondrias del mismo tipo celular, las células a saber humanos linfoblastoides (HLBM), obtenidos a partir de diferentes individuos tenía cuantitativamente diferentes rendimientos por 1 gramo de células, actividades respiratorias y capacidades para secuestrar fosfato de calcio [50]. Cualitativamente, HLBM normal fueron similares entre sí y distintos de HLBM de pacientes con la enfermedad de Huntington [50]. HLBM de pacientes con enfermedad de Huntington también tenía diferencias cuantitativas en las tasas de respiración y capacidades de retención de calcio, pero cualitativamente eran únicamente similares entre sí [50]. No había ninguna posibilidad y el sentido de la comparación estadística de HLBM de individuos normales y pacientes con la enfermedad de Huntington. Por lo tanto, la interpretación de los datos al comparar las células de fondo y cultura diferentes condiciones genéticas debe hacerse con precaución y se basa en gran medida de las propiedades cualitativas. Las comparaciones cuantitativas pueden realizarse únicamente dentro de la misma línea celular.
La discusión de los resultados presentados en este artículo, con respecto a los trabajos publicados sobre el tema metabolismo energético, el cáncer será relativamente limitada. En primer lugar, este trabajo hasta el momento es el único que se realiza en las mitocondrias aisladas de líneas celulares de cáncer de próstata normales y; y en segundo lugar, consideramos que es difícil discutir numerosas publicaciones sobre las propiedades metabólicas y el papel de las mitocondrias en las células del cáncer de próstata cultivadas en presencia de antibióticos [21,23,36-38]. Los antibióticos aminoglucósidos (estreptomicina, gentamicina) son tóxicos para la mitocondria de varias maneras [39-41,62]. Hemos observado repetidamente que las mitocondrias aisladas de células cultivadas en presencia de antibióticos (penicilina y estreptomicina) no respiran en cualquier sustrato. Higgins et al. [38] cultivaron PC-3, las células LNCaP y DU145 en presencia de penicilina-estreptomicina al 1% y llegó a la conclusión de que las mitocondrias en estas células eran disfuncionales. Por lo tanto, las publicaciones donde se cultivaron las células en presencia de los antibióticos son al menos confuso y difícil para la interpretación.