Extracto
Antecedentes
Las opciones terapéuticas actuales para castration- y el cáncer de próstata resistente al tratamiento son limitadas y se necesitan desesperadamente nuevos enfoques. Nuestros resultados recientes de una pantalla de sensibilidad biología química sistemática que cubre fármacos más conocidos y moléculas similares a fármacos indicaron que aldehído deshidrogenasa inhibidor disulfiram es uno de los inhibidores específicos de cáncer más potentes de crecimiento de células de cáncer de próstata, incluyendo TMPRSS2-ERG fusión cánceres positivos. Sin embargo, los resultados revelaron que el disulfiram por sí sola no bloquear el crecimiento del tumor
in vivo
ni inducir la apoptosis
in vitro
, lo que indica que los enfoques combinatorios pueden ser necesarios para mejorar los efectos antineoplásicos.
métodos y las conclusiones
en este estudio, se utilizó una pantalla de sensibilidad a los fármacos biología química para explorar disulfiram detalles mecanicistas y para identificar compuestos que potencian el efecto del disulfiram en las células de cáncer de próstata positiva de fusión TMPRSS2-ERG. En total, 3357 compuestos que incluyen agentes quimioterapéuticos actuales, así como compuestos moleculares pequeños similares a fármacos se seleccionaron solo y en combinación con disulfiram. Curiosamente, los resultados indicaron que los compuestos androgénicos y antioxidantes antagoniza efecto disulfiram mientras que los inhibidores de tirosina quinasa del receptor, del proteasoma, la topoisomerasa II, la glucosilceramida sintasa o del ciclo celular estaban entre compuestos sensibilización de las células de cáncer de próstata a disulfiram. La combinación de disulfiram y un agente antiangiogénico sunitinib se estudió con más detalle, ya que ambos están ya en uso clínico en seres humanos. Disulfiram-sunitinib de combinación indujo apoptosis y la reducción de expresión de la proteína del receptor de andrógenos más de cualquiera de los compuestos solos. Por otra parte, la exposición combinatoria reduce características metastásicas como la migración celular y la invasión de células en 3D, así como la diferenciación epitelial inducida que se muestran como expresión de E-cadherina elevada.
Conclusiones
En conjunto, nuestros resultados permiten proponer novela combinatoria enfoques para inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata. combinación de disulfiram-sunitinib fue identificado como uno de los enfoques sinérgicos potentes. Desde sunitinib solo se ha notificado a la falta de eficacia en los ensayos clínicos sobre el cáncer de próstata, nuestros resultados proporcionan un fundamento para combinatoria enfoque novedoso para el cáncer de próstata orientar de manera más eficiente
Visto:. Ketola K, Kallioniemi O, Iljin K (2012) Biología química sensibilidad a los fármacos pantalla identifica sunitinib como agente sinérgico con disulfiram en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (12): e51470. doi: 10.1371 /journal.pone.0051470
Editor: Jun Liu, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 29 de mayo de 2012; Aceptado: 6 de Noviembre de 2012; Publicado: December 12, 2012
Derechos de Autor © 2012 Ketola et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por el proyecto EU-PRIMA (contrato#LSHC-CT-204 a 504.587), el cáncer de Organizaciones de Finlandia, la Fundación Sigrid Juselius y la Academia de Finlandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más frecuente y la segunda causa principal de muerte por cáncer en la población masculina en el mundo occidental [1]. Como la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata con el tiempo se vuelven resistentes a los fármacos actualmente existentes, tales como anti-andrógenos y más tarde también a agentes citotóxicos, se necesitan nuevos fármacos y métodos combinatorios. Hemos llevado a cabo recientemente una pantalla compuesto biología química para probar sistemáticamente las sensibilidades de 4910 fármacos conocidos y pequeñas moléculas similares a fármacos en células de cáncer de próstata no malignas y malignas [2]. Aldehído deshidrogenasa (ALDH) disulfiram inhibidor estuvo entre los cuatro inhibidores selectivos de cáncer identificados bloquea el crecimiento de las células cultivadas positivas VCAP fusión TMPRSS2-ERG en una concentración nanomolar además de reducir el crecimiento de xenoinjertos VCAP
in vivo
[2]. Recientemente, el potencial inhibidor del crecimiento de disulfiram en el cáncer de próstata se ha confirmado en una pantalla de compuesto de alto rendimiento independientes
in vitro
y xenoinjertos estudios de
in vivo
[3], [4].
el disulfiram es un inhibidor de ALDH que ha estado a largo término que se utiliza como un elemento de disuasión del alcohol en las clínicas. Además del cáncer de próstata, disulfiram también se ha demostrado que tiene efecto contra el cáncer en la mama, mieloma, leucemia, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de cuello uterino, melanoma, neuroblastoma y el cáncer colorrectal [5] - [11]. Actualmente, disulfiram es en la Fase I de ensayos clínicos en el melanoma metastásico, en la hormona cánceres refractarios con pulmón y metástasis de hígado (www.clinicaltrials.gov, identificadores NCT00256230 y NCT00742911), así como en el cáncer de próstata (identificador: NCT01118741). En las células de cáncer de próstata cultivadas, disulfiram induce estrés oxidativo, reduce las actividades de la ADN metiltransferasa (DNMT) ALDH y así como inhibe la replicación del ADN [2], [4], [12]. En el cáncer de mama, disulfiram y cobre co-exposición inhibe la actividad de NF-kB, aumenta las especies reactivas de oxígeno y el número de células madre de cáncer (CSC) [13]. Por otra parte, la inhibición de la actividad de ALDH se ha sugerido como un potencial significa para reducir las células madre de cáncer y para superar la resistencia a fármacos [14]. Nuestros resultados anteriores indicaron que aunque disulfiram reduce VCAP crecimiento de xenoinjerto de células aproximadamente en un 40%, no fue capaz de bloquearlo [2]. Resultados similares se han obtenido en metastásicas en hueso humano xenoinjertos LNCaP C4-2B [4]. Además, la exposición disulfiram por sí solo no era suficiente para inducir apoptosis en células de cáncer de próstata [2]. Por lo tanto, en este estudio, se realizó una pantalla sensibilidad combinatoria en células de cáncer de próstata positiva ERG para explorar mecanismo disulfiram de acción en más detalle. Por otra parte, el objetivo fue identificar potenciales agentes sinergizantes con disulfiram en las células del cáncer de próstata. En total, 3357 compuestos que incluyen agentes quimioterapéuticos actuales y compuestos moleculares pequeños similares a fármacos se estudiaron solo y en combinación con disulfiram. Las alteraciones moleculares y fenotípicas se exploraron con uno de los más potentes sensibilizador disulfiram, sunitinib.
Materiales y Métodos
Las células
El
TMPRSS2-ERG
la fusión de genes y la línea celular de carcinoma de próstata positiva AR VCAP se recibió de los Dres. Adrie van Bokhoven (Universidad de Colorado Centro de Ciencias de la Salud, Denver, Colorado) y Kenneth Pienta (Universidad de Michigan, Michigan) y se cultivaron en Dulbecco modificada de Eagle Medium [15]. PC-3 células de carcinoma de próstata fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Suecia) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
loess normalizado CellTiter-Glo resultados con 3357 compuestos seleccionados (en ausencia eje y) y presencia (eje x) del disulfiram (CE
50 90 nM) en células de cáncer de próstata VCAP. Cada punto representa resultado obtenido con un compuesto. Los puntos de datos que califican como sensibilizantes disulfiram (cuadrados por debajo de la línea de tendencia) y el rescate (triángulos por encima de la línea de tendencia) compuestos están indicados. Resultado con sunitinib se indica mediante una flecha.
Los compuestos
El disulfiram se adquirió de Fluka (Múnich, Alemania) y se diluye en DMSO. Sunitinib fue adquirido de LC Laboratories (Woburn, EE.UU.) y se diluye en DMSO.
Compuesto de alto rendimiento sensibilidad de la pantalla
Una pantalla de la sensibilidad compuesto de alto rendimiento con la biblioteca de compuestos 3357 solo y en combinación con disulfiram se realizó en células VCAP. La biblioteca incluye agentes quimioterapéuticos actuales y compuestos moleculares pequeños de bibliotecas de compuestos comerciales LOPAC (1280 existente fármacos y otros compuestos de Alimentos y Medicamentos aprobados con estructuras farmacológicamente pertinentes; 1 y 0,1 mol /L), Microsource Spectrum (2.000 compuestos incluyendo la mayor parte de la conocida fármacos y otros compuestos bioactivos y productos naturales; 1 y 0,1 mol /L), y una biblioteca Resto (77 compuestos experimentales; 10, 1, y 0,1 mol /L). En la pantalla, se utilizó CE
50 valor de disulfiram (90 nM). La viabilidad celular se determinó después de la incubación de 3 días utilizando un CellTiter-Glo (CTG) ensayo de viabilidad celular fluorescente (Promega, Inc.). Los resultados de viabilidad celular fueron normalizados utilizando un método de loess como [2] se describe anteriormente. Los compuestos que se clasificaron como golpea la viabilidad celular inhibida por al menos tres desviaciones estándar de la media de los controles de DMSO.
Se realizaron
Viabilidad celular y la apoptosis Ensayos
ensayos
viabilidad celular y la apoptosis en placas de 384 pocillos (Falcon). 2.000 células por pocillo se sembraron en 35 l de sus respectivos medios de crecimiento y se dejaron unir durante la noche. Las diluciones del compuesto se añadieron a las células en 15 l y se incubaron durante 48 h. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de viabilidad celular CTG (Promega, Inc.). La inducción de la caspasa-3 y 7 actividades se detectó con homogénea Apo-ONE ensayo (Promega, Madison, WI). a continuación, los ensayos de viabilidad celular y la apoptosis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, en el ensayo de viabilidad celular, se añadieron 25 l de reactivo CTG activado a cada pocillo, la placa se incubó durante 30 min a TA /150 rpm y la señal de luminiscencia (700 nm) se cuantificó usando Envision Multilabel lector de placas (Perkin Elmer, Massachusetts, MA). Para el ensayo de apoptosis, 25 l de los medios de comunicación se sacó cada l así y 25 de reactivo ApoONE se añadió en cada pocillo. La placa se incubó durante 2 horas a RT y la señal fluorométrico (excitación 499 nm FITC, emisión de FITC 521 nm) se cuantificó usando Envision Multilabel lector de placas. La luminiscencia media o una señal fluorométrico de los pozos tratados con el compuesto de seis replicados se dividieron por la media de la señal de control del vehículo DMSO seis pocillos tratados para determinar los cambios veces.
Relativas resultados de la viabilidad celular en A) VCAP y B) PC- células de cáncer de próstata 3, así como en C no maligno) células) EP156T RWPE-1 y D. Los asteriscos indican la significación estadística: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; y ***, P & lt;. 0.005
Análisis estadísticos
Los criterios de éxito en la pantalla compuesto (puntuación inferior a -3 respecto a la mediana) corresponden a un valor de P & lt ; 0,01. Los análisis estadísticos de todos los resultados se realizaron mediante el uso de la prueba t de Student. Estos resultados se presentan como la media ± desviación estándar. Los siguientes valores de p se utilizan para mostrar la significación estadística: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; y ***, P & lt;. 0.005
Determinación de combinatorias efectos de drogas
La naturaleza de la interacción y el grado de sinergia entre el disulfiram y sunitinib fueron analizados utilizando el método del índice de combinación [16]. Se determinó la dependencia de la concentración de los efectos antiproliferativos para ambos compuestos, ya sea solo o en combinación. Fracción afectada (Fa) se definió como la fracción de células afectadas por la concentración dada de los compuestos solos o en combinación. Fa = 0 se determinó basado en el control DMSO y Fa = 1 en la estaurosporina (1 M) de respuesta (no hay células viables izquierda). Los datos se analizaron con el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK), y el índice de combinación (IC) se calculó a partir de las parcelas efecto mediano según la ecuación IC = (D) 1 /(DX) 1+ (D) 2 /( DX) 2, donde (DX) 1 y (DX) 2 son las concentraciones de compuestos D1 y D2 necesaria para producir un nivel dado de efecto antiproliferativo cuando se utiliza solo, mientras que (D) 1 y (D) 2 son sus concentraciones que producen el mismo efecto cuando se utiliza en combinación. Un índice de combinación de 0,9-1,1 indica la interacción aditivo, valores inferiores a 0,9 indican sinergismo, y valores superiores a 1,1 indican antagonismo.
A) Morfología celular en respuesta al disulfiram (1 M) y sunitinib (5 M) exposiciones solos y en combinación. B) Presentación del índice de combinación (IC) y la fracción de células afectadas (fa) por exposiciones compuestos en diferentes concentraciones (500 nM, 1 mM, 5 mM y 10 mM) en células de cáncer de próstata VCAP. valores de CI para cada concentración: 500 M: 0,92, 1 micra: 0.19, 5 micras: 0.21, 10 micras: 0,40. C) Caspasa 3/7 actividades en respuesta a la exposición a los compuestos. Los asteriscos indican la significación estadística:. ***, P & lt; 0,005
Extracción de ARN y de la transcriptasa inversa cuantitativa PCR
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transcripción inversa usando 500 ng de ARN total se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc de Applied Biosystems. TaqMan sondas y cebadores de expresión génica de la biblioteca universal de la sonda (Roche Diagnostics, Espoo, Finlandia) se utilizaron para estudiar los receptores de andrógenos (AR), antígeno específico de próstata (PSA), ERG, MYC y la expresión del ARNm β-actina. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1. PCR en tiempo real cuantitativa se realizó utilizando ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La cuantificación se llevó a cabo utilizando el
método ΔΔCT con el software gestor de 1.2 RQ (Applied Biosystems). β-actina se utilizó como control endógeno. expresión media de las muestras de control de DMSO expuesto fue considerado para el cálculo de los cambios veces. De dos a cuatro muestras replicadas se estudiaron para la cuantificación de la expresión de ARNm.
Análisis y Western Blot subcelular Proteoma Extracción
Para la extracción de proteína y análisis de transferencia Western, las células se sembraron a VCAP 70% de confluencia y se deja para unir durante la noche antes de los tratamientos. lisados de células enteras se prepararon usando tampón de lisis (Tris 62,5 mM, SDS al 1%, 5%, β-mercaptoetanol, 10% de glicerol y azul de bromofenol). Tres muestras replicativa se estudiaron para la cuantificación de la expresión de proteínas. Se utilizaron anticuerpos específicos que reconocen AR (1:1000 dilución, monoclonales de ratón, LabVision, Fremont, CA) o de PSA (1:1000, policlonales de conejo, DakoCytomation, Dinamarca). β-actina (1:4000, monoclonal de ratón, Sigma) se utilizó como control de carga. Se detectaron señales con 1:4000 diluciones de anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados (todos de Invitrogen Molecular Probes, Carlsbad, CA), seguido de visualización mediante el reactivo de quimioluminiscencia mejorada (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido). Las señales obtenidas se analizaron con el software de forma densitométrica GeneTools (SynGene, sinópticos Ltd, Cambridge, Reino Unido).
La expresión de A) AR, B) PSA, C) ERG, D) MYC ARNm en respuesta al disulfiram ( DSF) y sunitinib (SU) exposiciones solos y en combinación. E) AR y PSA expresión de la proteína en respuesta a la exposición a compuestos solos y en combinación. F) La cuantificación de la expresión de proteínas en respuesta a AR de 6 y 24 exposiciones compuestos h. Los asteriscos indican la significación estadística: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; y ***, P & lt;. 0.005
E-cadherina (rojo) y F-actina expresiones (amarillo) en respuesta a los tratamientos compuestos. El ADN se tiñeron con DAPI (azul).
inmunofluorescencia
La tinción de inmunofluorescencia de las células VCAP se llevó a cabo como se describe anteriormente [12]. Las imágenes fueron tomadas con 63 × magnificación utilizando un Zeiss Axiovert 200 M microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).
Curación de Heridas Ensayo
El efecto del disulfiram (1 M) y sunitinib (5 mM) solo y en combinación sobre la migración de células de cáncer de próstata se estudió usando un ensayo de cicatrización de heridas. PC-3 células se sembraron en placas de 96 pocillos (Essen ImageLock, Essen Instruments, Birmingham, Reino Unido) y una herida estaba rayado con rascador de la herida (Essen Instruments). Los compuestos se añadieron y controles apropiados inmediatamente después de la herida arañazos y confluencia de las heridas se controló con sistema de imágenes en vivo Incucyte-Cell y el software (Essen Instruments). Cierre de la herida se midió cada hora durante 24 h mediante la comparación de la densidad de la herida relativa media de tres réplicas biológicas en cada experimento.
Las células fueron imágenes automáticamente una vez cada hora después de la herida rascado. efecto cierre de la herida se calculó como confluencia de heridas en respuesta 6, 12 y 24 h exposiciones de los compuestos A) la curación de heridas en respuesta a la exposición a compuestos durante 24 horas. área de color negro representa los bordes de la herida en el comienzo del ensayo. B) Cuantificación de las células que entran en el área de la herida. Los asteriscos indican la significación estadística: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; y ***, P & lt;. 0.005
A) La morfología celular en el ensayo de esferoide 3D en respuesta a la exposición a compuestos. B) El área de las células en las imágenes Incucyte (% del área total) en respuesta a los tratamientos compuestos. Los asteriscos indican la significación estadística:. *, P & lt; 0,05
3D Ensayo
Las células fueron cultivadas en 3D en Matrigel en la angiogénesis sin recubrimiento mu-slides (ibidi GmbH, Alemania). Los pocillos de fondo se llenaron con 10 l de Matrigel (50%) en medio de cultivo y se incubaron durante 30 min en 37 ° C. Las células (1000 células /pocillo) se sembraron y dejar que se unieran durante 1-2 horas en 37 ° C. Se añadió la segunda capa de Matrigel en medio de cultivo (25%) y las placas se incubaron en 37 ° C. Se añadió disulfiram (1 M), sunitinib (5 mM) o disulfiram-sunitinib combinación después de 4 días de incubación y se mantuvo durante un máximo de 7 días. Esferoides fueron monitorizados en tiempo real mediante la formación de imágenes de células vivas (Incucyte, instrumentos de Essen; 10 × objetivo), la adquisición de imagen 1 /h. El área de estructuras 3D de las imágenes se comparó con el área total de la imagen (en porcentajes) para cuantificar los posibles efectos de los compuestos sobre el crecimiento celular.
Resultados
Biología compuesto Sensibilidad Química pantalla identifica sinérgica los agentes con disulfiram
biología química enfoque de pantalla compuesto se utilizó para estudiar el mecanismo de disulfiram reducción de la viabilidad celular en células de cáncer de próstata y para explorar posibles interacciones sinérgicas de disulfiram y los compuestos seleccionados. Biblioteca del 3357 compuestos, incluyendo la mayor parte de los fármacos conocidos y compuestos moleculares pequeños similares a las drogas se proyectó solo y en combinación con disulfiram en las células del cáncer de próstata VCAP. Los resultados de viabilidad celular en ausencia (control DMSO) o presencia de disulfiram (CE
50, 90 nM) se compararon. Como se esperaba, varios compuestos inhibieron el crecimiento de células VCAP (Fig. 1). Sin embargo, sólo 15 compuestos mostraron un efecto de combinación con disulfiram. En total, seis compuestos sensibilizan células VCAP a disulfiram: treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol hidrocloruro, bortezomib, clorhidrato de CGP-74514A, clorhidrato de epirubicina, forbol 12-miristato 13-acetato y sunitinib ( Tabla 1). En contraste, 9 compuestos rescatados disulfiram inducida efecto antiproliferativo (Tabla 2). Curiosamente, estos compuestos incluyen compuestos androgénicos 4-androsteno-3,17-diona, 5-alfa-androstan-3-alfa, 17-beta-diol y androsterona, así como astaxantina antioxidante. Por lo tanto, los resultados indican que la proliferación de células disulfiram reducida puede ser antagonizado con la activación de andrógenos o antioxidantes. Por otra parte, PKC activador de forbol 12-miristato 13-acetato era entre los fármacos sensibilizantes efecto disulfiram y PKC analógica inactivador decualinio, C-14 enlazador, fue uno de los medicamentos rescatando efecto disulfiram, lo que indica que la PKC puede jugar un papel en la respuesta disulfiram. Además, el efecto disulfiram puede ser potenciada mediante la inhibición de tirosina quinasas receptoras, proteasoma, la topoisomerasa II, la glucosilceramida sintasa o del ciclo celular (Tabla 1) mientras que la inhibición del receptor del factor de crecimiento epidérmico no parece ser una estrategia potente para mejorar el efecto de disulfiram (Tabla 2).
sunitinib y disulfiram el cotratamiento Mostrar sinergismo
Curiosamente, sunitinib, un agente anti-angiogénico, potenció el efecto inhibidor del crecimiento disulfiram inducida. Sunitinib inhibe la actividad de múltiples tirosina quinasas, tales como VEGFR-1, -2 y -3, PDGFR-α y -β, c-Kit, Ret y Flt-3 [17]. Se ha demostrado que tienen actividades anti-neoplásicas en una variedad de tumores malignos tales como cáncer hepatocelular, tumores neuroendocrinos pancreáticos y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Sunitinib tiene licencia para el carcinoma metastásico de células renales y tumores gastrointestinales [18] - [20]. En el cáncer de próstata, sunitinib reduce significativamente el crecimiento de cáncer de próstata resistente a la castración, tanto en la configuración preclínicos y clínicos [21], [22]. Sin embargo, un reciente estudio de fase III de sunitinib en el cáncer de próstata fracasó debido a la falta de eficacia en el cáncer de próstata resistente a la castración (identificador: NCT00676650). Desde sunitinib ya se ha estudiado en ensayos clínicos en pacientes con cáncer de próstata, se seleccionó la combinación de sunitinib-disulfiram para más
in vitro
estudios in.
Para validar el efecto antiproliferativo combinatoria de sunitinib en la próstata las células cancerosas, el efecto de disulfiram y solo y en combinación sunitinib se estudió en VCAP y células PC-3 de cáncer de próstata. Los resultados indicaron que el disulfiram y sunitinib co-exposición reducida viabilidad celular VCAP más de cualquiera de los compuestos solos (Fig. 2A). En las células PC-3, el efecto antiproliferativo se observó sólo en concentraciones más altas en respuesta al sunitinib o disulfiram-sunitinib co-exposición (Fig. 2B). Para identificar si el sinergismo en las células VCAP es causada simplemente debido al aumento de la citotoxicidad, el efecto de disulfiram, sunitinib o disulfiram-sunitinib co-exposición se estudió en RWPE-1 y de próstata EP156T células epiteliales no malignas. Los resultados mostraron que la viabilidad celular se redujo solamente concentración a la más alta (10 mM) en las células EP156T RWPE-1 y (Fig. 2C y D), lo que indica que el aumento de la toxicidad celular en general no explica la respuesta combinatoria en las células VCAP.
Para comparar los efectos de disulfiram (1 M) y sunitinib (5 mM) solo y en combinación sobre la morfología celular VCAP, se realizó un análisis de células vivas Incucyte. Las células se expusieron a los compuestos durante 48 horas. No se observaron cambios morfológicos claros en respuesta a todas las exposiciones compuestos (Fig. 3A). En particular, sunitinib causó las células se unan entre sí ya que no se observaron células individuales en las células de exposición de sunitinib. En respuesta a co-tratamiento disulfiram-sunitinib, las células también fueron unidos entre sí, pero no había células claramente menos viables izquierda (Fig. 3A). se determinó el índice de combinación (IC) a diversas concentraciones de fármaco (500 nM, 1 mM, 5 mM y 10 mM) sobre la base de los resultados de la viabilidad celular en células VCAP. Los resultados indicaron que el disulfiram y sunitinib mostraron sinergismo en todas las concentraciones ensayadas (CI & lt; 1) (Fig. 3B). Los valores de CI más bajos se observaron en concentraciones de 1 mM y 5 mM (IC 0,19 y 0,21). concentración Sunitinib de 5 M fue elegida para experimentos adicionales de combinación a base de CI y la viabilidad celular resultados, así como sunitinib anterior
in vitro
estudios en en células de cáncer de próstata [23] - [25].
sunitinib y disulfiram cotratamiento induce la apoptosis en células de cáncer de próstata
Para identificar si el disulfiram y sunitinib exposición induce la apoptosis, las caspasas 3 y 7 actividades se determinaron mediante un ensayo fluorométrico cuantitativo. Actividad de la caspasa se midió en respuesta a disulfiram (1 M) y sunitinib (5 M) la exposición durante 48 horas solo y en combinación en células VCAP. Curiosamente, ni disulfiram ni sunitinib solo fue capaz de inducir apoptosis. Sin embargo, una inducción significativa de la apoptosis se observó en respuesta al tratamiento combinación disulfiram-sunitinib (Fig. 3C). Tomados en conjunto, sunitinib muestra efectos inhibidores del crecimiento sinérgicos con disulfiram y la combinación de estos dos compuestos inducen la apoptosis más que cualquiera de los compuestos solos.
Sunitinib disminuye la expresión del receptor de andrógenos (AR), antígeno prostático específico (PSA ), ERG y MYC en células de cáncer de próstata positiva ERG
para identificar los primeros cambios moleculares en respuesta al disulfiram y sunitinib, la expresión de ARNm de oncogenes de cáncer de próstata AR, PSA, ERG y MYC se estudió en el disulfiram (1 M ), sunitinib (5 mM) o co-expuestos células VCAP disulfiram sunitinib en el punto de tiempo de 3 horas. Curiosamente, los resultados indicaron que sunitinib redujo significativamente AR, PSA, ERG y los niveles de MYC (aproximadamente de 40%) mientras que disulfiram solo no tuvo efecto importante (Fig. 4A, B, C y D). Los resultados con el disulfiram están de acuerdo con nuestro estudio anterior [2]. Sin embargo, no había indicios de un efecto combinatorio del disulfiram y sunitinib en la reducción de la expresión de estos oncogenes a nivel de ARNm.
Para saber si los cambios pueden ser detectados a nivel de proteínas, AR fue estudiado en respuesta a más largo exposiciones (6 y 24 horas) de disulfiram y sunitinib solo y en combinación. Curiosamente, sólo se observó una ligera reducción de AR en respuesta a sunitinib solo, y no disminución de la expresión de la proteína AR se observó en respuesta a disulfiram solo. Sin embargo, se observó una clara reducción de la expresión de proteínas AR (20 y 50%) en respuesta a la exposición combinación de disulfiram y sunitinib en 6 y 24 horas puntos de tiempo (Fig. 4E y F). Por otra parte, se observó disminución similar en los niveles de proteína PSA AR regulado (Fig. 4E). Tomados en conjunto, estos resultados indican que sunitinib reduce la señalización de andrógenos en células de cáncer de próstata, especialmente cuando se combina con disulfiram. Sin embargo, se necesita más análisis para identificar si el disulfiram y actuar de forma sinérgica sunitinib través de la señalización de andrógenos.
El disulfiram y sunitinib co-tratamiento induce la expresión de E-cadherina
Los resultados del análisis de la morfología microscópica de células sugieren que las células VCAP fueron más unidas entre sí en respuesta a cualquiera sunitinib o disulfiram y sunitinib co-exposición en comparación con la exposición disulfiram solo (Fig. 3A). Para identificar si estos fenotipos se debieron a la inducción de la molécula de adhesión celular E-cadherina, se realizó tinción inmunoquímica. Los resultados indicaron que el disulfiram y sunitinib cotratamiento expresión inducida E-cadherina más de cualquiera de los compuestos solos (Fig. 5). E-cadherina se conoce comúnmente marcador para la diferenciación de células de cáncer y se downregulated en carcinoma de próstata invasivo [26]. Hemos demostrado anteriormente que la inducción de la expresión de E-cadherina se asocia con reducción de la proliferación celular en células de cáncer de próstata positivas VCAP ERG [27], [28]. Estos resultados indican que el fenotipo morfológico visto en respuesta a co-tratamiento con sunitinib-disulfiram se correlaciona con la expresión de E-cadherina elevada en las células del cáncer de próstata VCAP.
El disulfiram y sunitinib cotratamiento reduce el cáncer de próstata migración celular
Para estudiar si el disulfiram y sunitinib co-tratamiento afecta a la migración de células de cáncer de próstata, se realizó ensayo de migración celular de células vivas. En el ensayo, se usaron células PC-3 como modelo de cáncer de próstata, ya que las células VCAP no migran en este ensayo. Los resultados indicaron que la migración celular disulfiram-sunitinib co-exposición reducida más de uno cualquiera de los compuestos solos (Fig. 6). La migración se redujo significativamente en el disulfiram y las células de cáncer de próstata co-expuestos sunitinib a intervalos de 12 y de 24 horas los puntos de tiempo (en un 20 y un 30% en comparación con el control de DMSO). disminución significativa en la migración celular se observó también en el disulfiram y sunitinib células expuestas a 24 horas punto de tiempo (Fig. 6B). PC-3 confluencia celular no se redujo significativamente en estos puntos de tiempo, lo que indica que la reducción de la migración de células no da como resultado, debido a la proliferación celular reducida (Figura S1). Por lo tanto, los resultados mostraron que el disulfiram-sunitinib co-exposición reduce la migración de células de cáncer de próstata más que cualquiera de los compuestos solos.
El disulfiram y combinación Sunitinib Reduce la célula del cáncer de próstata Invasión de Cultura 3D
La efecto del disulfiram y sunitinib co-tratamiento se estudió en PC-3 modelo esferoide 3D [29]. Los esferoides se hicieron crecer en Matrigel durante 4 días y disulfiram (1 M) y sunitinib (5 mM) solo y en combinación se añadieron a las células y la morfología de las células se monitorizó durante 7 días utilizando imágenes de células vivas. Los resultados se muestran en la Figura 7. El disulfiram solo fue capaz de reducir las células de invadir estructura 3D, pero no era capaz de reducir el crecimiento de las células en el interior del lumen (Fig. 7A). Por el contrario, se trata de sunitinib esferoides eran más pequeños, mientras que la invasión de células no fue bloqueada. Curiosamente, el tratamiento de combinación redujo la cantidad de salientes invasivos, así como el tamaño de los esferoides. El área de las células en las imágenes (% del área total) en respuesta a los tratamientos compuestos por 7 días en 3D se presenta en la Figura 7B. En su conjunto, el tratamiento concomitante reducción de próstata invasión de células cancerosas disulfiram sunitinib y el crecimiento en el modelo esferoide 3D.
Discusión
En este estudio, se utilizó una pantalla compuesto sensibilizante biología química para estudiar aldehído deshidrogenasa (ALDH ) disulfiram mecanismo inhibidor de la acción y para identificar potenciales agentes sinérgicos para el disulfiram en las células del cáncer de próstata positiva TMPRSS2-ERG. Total de 3357 compuestos que incluyen agentes quimioterapéuticos actuales y compuestos moleculares pequeños se seleccionaron solo y en combinación con disulfiram y el mecanismo sinérgico para sunitinib disulfiram sensibilizador se estudió con más detalle.
Los resultados de la pantalla combinatoria de alto rendimiento indicaron que varios compuestos androgénicos, así como un antioxidante astaxantina fueron de compuestos rescatando disulfiram inducida efecto antiproliferativo en células de cáncer de próstata. Nuestros resultados anteriores indicaron que el disulfiram inducida por el estrés oxidativo en células de cáncer de próstata [2]. Disulfiram aumenta los niveles de ROS también en células de cáncer de mama [13]. Por lo tanto, el efecto de rescate de astaxantina antioxidante en las células disulfiram expuesto es compatible con los resultados previos que indican que la proliferación celular reducida disulfiram está mediada a través de la inducción de estrés oxidativo. Los resultados de la evaluación también sugirieron que PKC juega un papel en la respuesta disulfiram desde PKC activador de forbol 12-miristato 13-acetato era entre los fármacos sensibilizantes a efecto disulfiram mientras analógico PKC inactivador decualinio, C-14 enlazador rescató efecto disulfiram en la pantalla. Por otra parte, la inhibición de tirosina quinasas receptoras, proteasoma, la topoisomerasa II, la glucosilceramida sintasa puede ser formas alternativas para aumentar el efecto disulfiram mientras que la inhibición del receptor del factor de crecimiento epidérmico tiene un efecto opuesto. Uno de los seis compuestos sensibilizantes células VCAP a disulfiram inducida efecto anti-proliferativo fue antiangiogénico agente, tirosina-receptor proteína cinasa sunitinib inhibidor. Sunitinib es un medicamento contra el cáncer que se utiliza clínicamente para tratar el carcinoma de células renales metastásico y los pacientes con cáncer gastrointestinal. También se ha demostrado que tienen actividad anti-neoplásica en el cáncer hepatocelular, tumores neuroendocrinos pancreáticos, y no pequeñas de cáncer de pulmón de células [18] - [20].