Extracto
El tratamiento del cáncer de ovario avanzado, consiste en la quimioterapia basada en platino. Sin embargo, la quimio-resistencia es un obstáculo importante. Se cree que las células madre del cáncer (CSC) para ser una de las causas de la quimiorresistencia, pero el mecanismo subyacente sigue siendo difícil de alcanzar. Recientemente, se ha informado de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) promover rasgos CSC-como. En este estudio, se encontró que un inhibidor de la mitosis, el mesilato de eribulina (eribulina), el crecimiento inhibe eficazmente de líneas celulares de cáncer de ovario resistente al platino. eribulina células sensibles mostraron una mayor eficiencia para la formación de esferas, lo que sugiere que estas células poseen un fenotipo mejorado CSC-similares. Por otra parte, estas células expresan un mayor nivel de hTERT, y la supresión de la expresión de hTERT por siRNA resultó en disminución de la sensibilidad a la eribulina, lo que sugiere que hTERT puede ser un objetivo para eribulina. De hecho, encontramos que la actividad eribulina directamente inhibido ARN polimerasa dependiente de ARN (RDRP), pero no de la actividad de la telomerasa hTERT
en
in vitro
. Proponemos que la eribulina se dirige la actividad RdRP de hTERT y puede ser una opción terapéutica eficaz para los CAC. Por otra parte, hTERT puede ser un biomarcador útil para predecir la respuesta clínica a la eribulina
Visto:. Yamaguchi S, Maida Y, Yasukawa H, Kato T, M Yoshida, Masutomi K (2014) Objetivos Eribulina mesilato humano telomerasa transcriptasa inversa en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10.1371 /journal.pone.0112438
Editor: Taro Yamashita, Universidad de Kanazawa, Japón
Recibido: 19 Agosto, 2014; Aceptado: 6 Octubre 2014; Publicado: 6 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Yamaguchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el subsidio de Ayudas a la Investigación Científica (26462544) (SY) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), programa de financiación para los investigadores de próxima generación líder en el mundo (programa) SIGUIENTE (a KM) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (http: //www .jsps.go.jp /Inglés /e-jisedai /), la Fundación Mitsubishi (KM) (http://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), la Fundación Uehara Memorial (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/), y el Centro Nacional de Investigación del cáncer y fondos de desarrollo (26-a-5) (KM) (http://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/kaihatsu /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el más letal de todos los tumores malignos ginecológicos, alegando alrededor de 150.000 vidas cada año en todo el mundo. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostica en una etapa avanzada, y la quimioterapia basada en platino es el tratamiento estándar de primera línea para pacientes con cáncer de ovario avanzado. Sin embargo, la quimio-resistencia es un obstáculo importante en el tratamiento del cáncer de ovario.
adenocarcinoma seroso (SAC), el tipo más común de cáncer de ovario, por lo general responde bien a la quimioterapia inicial basada en platino, a pesar de que se repita y, finalmente, el desarrollo de fármacos resistencia. El carcinoma de células claras (CCC), el segundo tipo más común en Japón, es a menudo resistente a la quimioterapia basada en platino inicial [1]. Independientemente de si la resistencia se adquiere o, estrategias terapéuticas más prometedoras primarias son necesarios para superar la quimio-resistencia y mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario.
Los estudios recientes han sugerido que las células madre del cáncer (CSC) son, al menos en parte, responsable de la quimiorresistencia en muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de ovario [revisado en [2]]. CSC son una subpoblación de células tumorales, que se caracterizan por una capacidad de auto-renovación y capacidad de diferenciarse en tipos de células distintas. La aparición de los CAC se produce al menos en parte como resultado de la transición epitelial-mesenquimal (EMT), un proceso esencial para el desarrollo embrionario, que se induce durante la progresión del cáncer y crucial para la metástasis del cáncer. Los CCC poseen la característica de auto-renovación de las células madre normales y las vías de señalización similares regulan la autorrenovación de las células madre cancerosas y las células madre normales [3]. Uno de tales ruta implica la telomerasa transcriptasa (terc), la subunidad catalítica limitante de la velocidad de la telomerasa, que se expresa en la mayoría de los cánceres inversa. La evidencia reciente indica que regula de TERT vástago rasgos celular de una manera independiente de la longitud de los telómeros. Por ejemplo, terc activa las células madre epidérmicas quiescentes
en
vivo
de una manera independiente del componente ARN intrínseca de la enzima telomerasa TERC [4]. Además, junto con el modificador de sacarosa no fermentable (SWI-SNF) proteína compleja de genes relacionados con el brahma-1 (BRG1), terc actúa como un modulador transcripcional de la vía de señalización de Wnt /β-catenina, que contribuyen a la auto-renovación y proliferación durante el desarrollo [5]. Más recientemente, la evidencia acumulada indica que también opera de TERT en células madre cancerosas y promueve la EMT y rasgos de CSC-como. En concreto, la sobreexpresión de TERT humana resultados (hTERT) en una capacidad de formación de esferas mejorada, aumento de la expresión de marcadores de EMT /CSC, y el aumento de
en
in vivo
tumorigénesis causada por la interacción con hTERT β- catenina y la mejora de su actividad transcripcional [6]. Por el contrario, la supresión de la expresión de hTERT se traduce en una disminución de la capacidad de formación de esferas y la disminución de la expresión del marcador CD44 CSC [7]. Esta función de hTERT en la promoción de EMT y rasgos CSC-como parece ser independiente de su actividad de la telomerasa [6]. De hecho, hemos informado de que hTERT en un complejo con BRG1 y la nucleostemin nucleolar de unión a GTP proteína (NS) (complejo TBN) participa en el mantenimiento de células madre cancerosas. Por otra parte, se encontró que la sobreexpresión del complejo TBN mejora la tumorigenicidad y la expresión de marcadores de EMT /CSC de una manera hTERT dependiente pero de una manera la longitud del telómero-independiente [8]. Los mecanismos exactos de telomerasa independiente mediante el cual el complejo TBN regula las CSC siendo difícil de alcanzar. Un posible mecanismo es a través de la actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) de hTERT [9]. RDRP induce la interferencia de ARN mediante la producción de ARN de doble cadena de ARN de una sola hebra de plantilla y regula el conjunto de la heterocromatina y la progresión mitótico [10]. Al igual que en RdRPs en organismos modelo, se encontró que las actividades del complejo RdRp TBN son ricos en células mitóticas, y la supresión de los complejos resultados TBN de detención de la mitosis [11].
Para hacer frente a la quimio-resistencia, estrategias terapéuticas dirigidas EMT y células madre cancerosas están atrayendo cada vez más atención. Recientemente, debido a mesilato de eribulina (eribulina) se informó de inhibir la metástasis mediante la inversión de la EMT [12], especuló que la eribulina podría apuntar a células madre cancerosas. Eribulina es un inhibidor no taxano de la dinámica de microtúbulos [13], lo que induce el bloqueo mitótico irreversible, lo que lleva a la inactivación persistente de Bcl-2 y la posterior apoptosis [14]. En los Estados Unidos, eribulina ha sido aprobado para el tratamiento de cáncer de mama metastásico después de al menos dos regímenes de tratamiento que incluyen una antraciclina y un taxano. Por otra parte, la eribulina está aprobado para el tratamiento del cáncer de mama inoperable o recurrente en Japón.
En este estudio, se encontró que la eribulina efectivamente inhibe el crecimiento de células de cáncer de ovario resistente al platino. eribulina células sensibles mostraron una mayor características CSC-como la expresión de alto y hTERT. Supresión de la expresión de hTERT generado una disminución en la sensibilidad a la eribulina. Por otra parte, la eribulina inhibió la actividad de hTERT RDRP
en
in vitro
, lo que demuestra que hTERT es un objetivo directo de eribulina.
Resultados
Eribulina inhibe el crecimiento de líneas celulares de adenocarcinoma de ovario resistentes al cisplatino
Catorce líneas celulares de adenocarcinoma de ovario fueron investigados por la sensibilidad a cisplatino [cis-diaminodicloroplatino (II)], incluyendo seis líneas celulares SAC (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, y OVSAHO), seis líneas celulares CCC (RMG-I, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, y TOV21G), y dos líneas celulares de adenocarcinoma indiferenciado /no clasificados (OVCAR-3 y A2780) (Tabla S1). Como se muestra en la Figura 1A, OVKATE, RMG-I, PEO4, y las células PEO23 eran especialmente resistentes a cisplatino, presumiblemente a través de diferentes mecanismos. células OVKATE se ha informado anteriormente como resistente a los agentes de platino con elevada expresión de la glutatión-S-transferasa, un marcador de resistencia a fármacos [15]. células RMG-I son también resistentes a cisplatino, que implica la quinasa regulada por señales (ERK) vía extracelular [16]. células PEO4 y PEO23 se obtuvieron de los mismos pacientes como células PEO1 y PEO14, respectivamente, después del desarrollo de quimiorresistencia clínica, y por lo tanto son resistentes platino [17]. mutación BRCA2 se ha encontrado para contribuir a la resistencia de platino en células PEO4 [18].
Las células se trataron con cisplatino o eribulina durante 72 h, y luego la viabilidad celular se determinó por ensayos de MTT. (A) Media IC
50 valores de cisplatino (M). (B) Media IC
50 valores para eribulina (nM). líneas de células sensibles a la eribulina (eribulina S) se muestran como barras abiertas, y las líneas celulares resistentes a la eribulina (eribulina R) se muestran como barras cerradas. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
Hemos examinado una serie de compuestos anti-cáncer conocidos para la inhibición del crecimiento de líneas celulares de cáncer de ovario resistente al platino. Se encontró que eribulina, un inhibidor mitótico que suprime la dinámica de los microtúbulos [13], inhibe el crecimiento de las células PEO4 (Figura 1B) RMG-I, PEO23, y. Sorprendentemente, eribulina no fue tan eficaz en algunas de las líneas de células cisplatino-sensibles tales como OVTOKO, PEO14, y TOV21G (Figura 1A y 1B). Para una caracterización adicional, se definió ocho líneas celulares con una CI
50 & lt; 100 nM para la eribulina como "eribulina sensible" (eribulina S) y seis líneas de células con una CI
50 de & gt; 100 nM para eribulina como "eribulina resistentes" (eribulina R).
líneas de células sensibles a la eribulina muestran una mayor capacidad de formación de esferas
se cree
Los CCC para ser responsable de la quimio-resistencia, y se ha informado de los CAC para contribuir a la resistencia a cisplatino en varios tipos de cáncer [19]. Por otra parte, se informó recientemente de que la eribulina invierte EMT [12], un fenotipo que está altamente relacionada con células madre cancerosas. Por lo tanto, se investigó si las células sensibles a la eribulina poseen un fenotipo mejorado CSC-similares. Debido a una capacidad de formación de esferas es una característica similar a CSC, se realizaron ensayos de formación de esferas en condiciones libres de suero, y se encontró que las líneas celulares sensibles a la eribulina mostraron eficacia de formación de alta esfera (Figura 2A y 2B). La eficiencia de formación de esferas de líneas celulares Eribulina S fue significativamente mayor que la de las líneas celulares Eribulina R (Figura 2C, p = 0,0013), lo que sugiere que las líneas celulares eribulina sensibles poseen características mejoradas de CSC-como.
(A ) eficiencia en la formación de la esfera (SFE) de cada línea celular se indica por cada 1.000 células. líneas celulares S eribulina se muestran como barras abiertas, y las células Eribulina R se muestran como barras cerradas. Cada experimento se realizó al menos tres veces, y los valores medios ± SD se indican. (B) Morfología de tumorspheres en condiciones libres de suero. se muestran imágenes representativas de esferas formadas por A2780, RMG-I, ES-2, OVSAHO, TOV21G, y las células OVTOKO. Barra de escala = 50 micras. (C) La media SFE de líneas celulares Eribulina S líneas (n = 8) y Eribulina R de células (n = 6) se muestra en (A). Las barras de error indican SD. (D) El nivel de BRG1 y la proteína NS expresión se detectó por inmunotransferencia. expresión de GAPDH se muestra como control de carga. (E) Las señales en (D) se cuantificaron con el software ImageJ y normalizada a la señal GAPDH. Los valores promedio de nivel de expresión relativa ± SD se indican.
Dado que hemos demostrado recientemente que NS junto con hTERT y BRG1 mantiene las CSC [8] y nosotros y otros también han demostrado que NS es un útil CSC marcador [20] - [22], se determinó la expresión de BRG1 y NS en eribulina S y líneas celulares eribulina R. El nivel de expresión de la proteína de BRG1 fue significativamente mayor en las líneas Eribulina S celulares (Figura 2D y 2E, p = 0,0189), mientras que sólo se observó una modesta tendencia a una mayor nivel de NS en las líneas celulares Eribulina S (Figura 2D y 2E, p = 0,1216). No se detectó una diferencia en el nivel de expresión de CD133 o CD44 (Figura S1), los marcadores de superficie celular implicados en algunas células madre cancerosas [23].
S células eribulina expresan niveles más altos de proteína hTERT
la sobreexpresión de los resultados de hTERT en una capacidad de formación de esferas mejorada en células de cáncer gástrico [6]. Por el contrario, la supresión de la expresión de hTERT se traduce en una disminución de la capacidad de formación de esferas en células de cáncer de mama [7]. Por lo tanto, se determinó si las células de cáncer de ovario con una capacidad superior de formación de esferas expresan un mayor nivel de hTERT. Se observó una tendencia en líneas celulares con alta eficiencia de formación de esferas, como RMG-I, PEO23, y A2780, para expresar niveles relativamente altos de proteína hTERT, mientras que las líneas celulares con baja eficiencia de formación de esferas, como TOV21G, OVTOKO, y OVMANA, expresó bajos niveles de proteína hTERT, como se demuestra por ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) (Figura 3A). El alto nivel de expresión de hTERT en células RMG-I puede ser explicada por una mutación de ganancia de función (-124 G & gt; A) en la región promotora de hTERT (Tabla S1 y S2 Figura). Esta mutación específica del cáncer se informó recientemente en el melanoma y otros tipos de cáncer [24] - [27], lo que crea nuevos motivos de unión para E-veinte seis factores complejos /ternarios (ETS /TCF) y por lo tanto contribuye a la transcripción de hTERT upregulated [24], [25].
(A) El nivel de expresión de la proteína hTERT se determinó por ELISA (indicados como ng /ml). líneas celulares S eribulina se muestran como barras abiertas, y las células Eribulina R se muestran como barras cerradas. Cada experimento se realizó al menos tres veces, y los valores medios ± SD se indican. (B) El nivel de hTERT media de líneas celulares Eribulina S (n = 8) y líneas celulares Eribulina R (n = 6) que se muestran en (A). Las barras de error indican SD.
Se encontró que las líneas celulares Eribulina S expresaron niveles más altos de proteína hTERT que los de las líneas celulares Eribulina R (Figura 3B, p = 0,008).
Supresión de hTERT expresión resultados en disminución de la sensibilidad a la eribulina
La correlación entre la expresión de hTERT y la sensibilidad eribulina nos llevó a postular que la eribulina inhibe el crecimiento de células de cáncer de ovario a través de la inhibición de hTERT. Para probar esta hipótesis, se examinó si la supresión de la expresión de hTERT en células de cáncer de ovario conduce a la disminución de la sensibilidad a la eribulina. Dos siRNAs independientes hTERT-específica se introdujeron en las células A2780 y sensibilidad a la eribulina se comparó con las células que expresan el control de siRNA. Como se esperaba, las células que expresan hTERT siRNAs mostraron disminución de la sensibilidad a la eribulina (Figura 4A). De TERT siRNA1 mostró una tendencia de supresión más fuerte de la expresión de hTERT que de TERT siRNA2 como se demostró por ELISA (Figura 4B). Este hallazgo puede explicar por qué las células que expresan de TERT siRNA1 tendían a ser menos sensible a eribulina que las que expresan de TERT siRNA2 (Figura 4A). Se obtuvieron resultados similares en ES-2 células (Figura 4C y 4D). Estos resultados sugieren que hTERT podría ser un objetivo directo de eribulina.
células A2780 (A) que expresan ARNsi de control (barras blancas), terc siRNA1 (barras cerradas), o terc siRNA2 (barras sombreadas) fueron tratadas con eribulina durante 72 h, y luego la viabilidad celular se determinó por ensayos de MTT. * P & lt; 0,05 frente a células que expresan ARNsi de control. (B) El nivel de expresión de la proteína hTERT en células A2780 que expresan ARNsi de control (barras blancas), terc siRNA1 (barras cerradas), o terc siRNA2 (barras sombreadas) se determinó por ELISA (indicado como ng /ml). (C y D) Los experimentos descritos en (A y B) se llevaron a cabo de la misma manera utilizando ES-2 células que expresan ARNsi de control (barras blancas), terc siRNA1 (barras cerradas), o terc siRNA2 (barras sombreadas). * P & lt;. 0.05 vs células que expresan ARNsi de control
Eribulina inhibe la actividad de hTERT RDRP
en
in vitro
Se cree ampliamente que cualquier efecto de la supresión de hTERT está mediada por acortamiento de los telómeros. Sin embargo, debido se observó disminución de la sensibilidad a la eribulina en un período relativamente corto (Figura 4, 96 h después de la transfección de ARNsi contra hTERT), se especuló que este efecto es independiente de la función de mantenimiento de los telómeros de hTERT. Además, la función de hTERT en la promoción de la EMT y CSC-como rasgos es independiente de su actividad de la telomerasa [6]. Junto con nuestro informe reciente que muestra que tiene una actividad de hTERT RDRP independiente de mantenimiento de los telómeros [9], se investigó si la eribulina se dirige directamente a la actividad de hTERT-RDRP. Hemos supervisado el efecto inhibidor de la eribulina en la actividad hTERT-RDRP utilizando un
en
in vitro
RDRP ensayo [11], y se encontró que la eribulina inhibió la actividad de hTERT-RDRP
en
vitro
a una concentración de 50 mM (Figura 5A). La misma concentración de eribulina no inhibió la actividad de la telomerasa de hTERT como se muestra por el protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas (TRAP) ensayo (Figura 5B). Estos resultados sugieren que los efectos de eribulina en hTERT no están mediados por la actividad de telomerasa, pero a través de la actividad RdRP. Curiosamente, otro inhibidor de la mitosis, paclitaxel, un taxano representativo, no inhibió la actividad RdRP (Figura 5C), lo que sugiere que eribulina tiene un efecto inhibidor específico de la actividad de hTERT-RdRP.
(A) la actividad RdRP de hTERT inmune complejos preparados a partir de células HeLa detenidas en la fase mitótica se ensayó sin o con eribulina 10 y 50 mM. (B) Actividad de la telomerasa en extractos de células HeLa se ensayó sin o con eribulina 10 y 50 micras. RDRP la actividad de los complejos inmunes hTERT (C) se ensayó sin o con 10 y 100 M de paclitaxel (PTX).
Discusión
Entre los cánceres ginecológicos, cáncer de ovario es la principal causa de muerte. En particular, la resistencia a la quimioterapia convencional basada en platino ha sido una barrera en la mejora del pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario, y se requiere con urgencia nuevas estrategias terapéuticas. Aquí, se encontró que eribulina fue eficaz para inhibir el crecimiento de células de cáncer de ovario resistente al platino. Efectos de la eribulina se correlacionaron con los niveles de expresión de hTERT (Figura 3), y la supresión de la expresión de hTERT resultaron en disminución de la sensibilidad a la eribulina (Figura 4), lo que sugiere que hTERT podría ser un objetivo de eribulina en estas células. De hecho, la eribulina inhibió la actividad RDRP pero no la actividad de la transcriptasa inversa de hTERT
en
in vitro gratis (Figura 5).
CSC y hTERT
Los CCC se cree que participan en la quimio-resistencia, y se han encontrado varias vías para contribuir a la promoción o el mantenimiento de células madre cancerosas. Nosotros y otros han demostrado que la hTERT juega un papel importante en la promoción y mantenimiento de células madre cancerosas en modales de mantenimiento independiente del telómero [6] - [8]. Eribulina inhibe eficazmente el crecimiento de las células resistentes al platino (Figura 1). células eribulina sensibles exhibieron una mayor expresión de hTERT (Figura 3) y una mayor capacidad de formación de esferas (Figura 2), lo que sugiere que estas células han mejorado las características de CSC-como, posiblemente debido a los altos niveles de la proteína hTERT. Consistentemente, las células sensibles a la eribulina exhibieron una mayor expresión BRG1 (Figura 2), otro componente del complejo de TBN que mantiene células madre cancerosas. No se detectó una diferencia significativa en la expresión de CD133 o CD44 (Figura S1). Aunque CD133 y CD44 se cree que son indicativos de células madre cancerosas en algunos tipos de cáncer, lo que queda por esclarecer qué marcadores son apropiadas para los CAC en los cánceres de ovario [23].
Debido mantenimiento de los telómeros por la telomerasa es indispensable para infinito proliferación de células malignas, se han hecho esfuerzos para desarrollar terapias contra el cáncer dirigidas a la telomerasa. Estudios recientes indican que de TERT desempeña papeles funcionales más allá del mantenimiento de los telómeros. De hecho, la función de de TERT para activar las células madre quiescentes normales o rasgos CSC-como se ha mostrado ser independiente de su actividad de la telomerasa [4], [6], [28]. También hemos encontrado que el complejo de TBN mantiene células madre cancerosas de una manera la longitud del telómero-independiente [8]. Es posible que este mecanismo telomerasa-independiente está mediada por la actividad de RdRP de TERT, debido a que el complejo en sí TBN es responsable de la actividad RdRP y participa en la regulación de la heterocromatina y la progresión mitótica [11]. Los autores especulan que la actividad RdRP de hTERT está implicado en la regulación de la expresión génica a través de la heterocromatina en las células cancerosas, y podría ser una nueva diana terapéutica contra el cáncer. Si la actividad RDRP es un requisito previo para la función de hTERT en la promoción de las CSC queda por determinar.
Eribulina y hTERT
La eribulina se une a microtúbulos más extremos e inhibe la fase de crecimiento de la dinámica de los microtúbulos [29] . Recientemente, se demostró eribulina para revertir EMT por la regulación negativa de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) inducida por la fosforilación de Smad [12]. proteínas Smad se unen a los microtúbulos en ausencia de TGF-β y TGF-β desencadena la disociación de los microtúbulos y la fosforilación de proteínas Smad [30]. Yoshida
et al.
Especuló que la eribulina inhibe la fosforilación de Smad Smad posiblemente mediante la supresión de disociación de microtúbulos [12]. Debido a que recientemente hemos demostrado que hTERT se localiza en husos mitóticos y centrómeros durante la mitosis [11], también es posible que eribulina inhibe las funciones de hTERT al interferir con la interacción entre hTERT y microtúbulos. Eribulina mejora la supervivencia global de los pacientes con cáncer de mama metastásico, que tenía antes de la quimioterapia antraciclinas y taxanos basada en [31]. Un taxano, paclitaxel, no inhibió la actividad de la RDRP hTERT (Figura 5C), proporcionando una de las bases moleculares potenciales para los diferentes resultados clínicos de los taxanos y eribulina. El mecanismo exacto por el cual inhibe la función de eribulina hTERT aún no se ha entendido.
hTERT como biomarcador
Es importante identificar biomarcadores para predecir la respuesta a las terapias contra el cáncer. Mediante la determinación de los niveles de hTERT en muestras clínicas, los pacientes que son propensos a responder bien a la eribulina pueden ser identificados antes de recibir quimioterapia. En particular, un ELISA sería capaz de medir los niveles de hTERT en la práctica clínica.
En resumen, hemos encontrado que inhibe la actividad de la eribulina RdRP de hTERT, que puede contribuir a la quimio-resistencia en el cáncer de ovario mediante el mantenimiento de células madre cancerosas. Eribulina inhibió el crecimiento de células de cáncer de ovario con la expresión de alto hTERT y fuerte resistencia de platino, lo que sugiere que puede ser un agente terapéutico prometedor para el cáncer de ovario quimiorresistente. Por otra parte, hTERT puede ser un biomarcador útil para predecir la respuesta clínica a la eribulina.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
RMG-I [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], y OVKATE [33] las células se obtuvieron de la Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Cell Bank. OVCAR-3 células [35] se obtuvieron del Centro de bio RIKEN. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], y A2780 [36] Las células fueron adquiridos de la Colección Europea de Cultivos Celulares, y TOV21G [37], y ES-2 [38] Las células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection. células RMG-I se cultivaron en medio F12 de Ham suplementado con suero bovino fetal 10%, ES-2 células en medio de McCoy 5A suplementado con suero bovino fetal al 10%, las células TOV21G en MCDB105 /Medium 199 (01:01) suplementado con 10% células fetales de suero bovino, y HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10%. Todas las demás líneas celulares (A2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, y PEO23) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y piruvato de sodio 1 mM ( Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.).
Los compuestos
El cisplatino se compró a, paclitaxel fue adquirido de Wako (Osaka, Japón) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.), y eribulina (Halaven) se adquirió de Eisai Co., Ltd (Tsukuba, Japón).
MTT ensayo
Las células (5.000-10.000 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y luego tratados con cisplatino o eribulina después de 24 h. A las 72 h de tratamiento, un ensayo de proliferación de MTT (proliferación de células Kit I MTT, de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 10 l de reactivo marcador de MTT a cada pocillo, seguido de 4 h de incubación. Después, se añadieron 100 l solución de solubilización a cada pocillo, seguido de incubación durante la noche. El producto de reacción se cuantificó midiendo la absorbancia a 570 y 690 nm usando un lector de microplacas (Viento 808, BioTek, Winooski, VT, EE.UU.). La viabilidad celular se determinó por comparación con las células no tratadas.
Esfera formación de ensayo
Las células aisladas se sembraron en placas de 96 pocillos de ultra bajas de fijación (Corning Inc, Corning, Nueva York, EE.UU.) al 100- 1.000 células /100 l de medio en cada pocillo. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero DMEM /F12 (Gibco) suplementado con 20 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico ml (Wako), 20 ng /ml factor de crecimiento epidérmico (Wako), y suplemento B27 (Gibco). Los cultivos se complementaron con 25 l de medio fresco cada 3-4 días, y el número de esferas se contó en los días 7 y 14. Las imágenes microscópicas se obtuvieron con un microscopio invertido y CKX41 cámara digital DP21 (Olympus, Tokio, Japón).
Immunoblotting
Las células se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contenía NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl 1% (pH 7,4) y NaCl 150 mM. Después de la sonicación y centrifugación de los lisados, proteínas (20 mg) se sometieron a SDS-PAGE en geles al 7,5% de poli-acrilamida, seguido de análisis de inmunotransferencia. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-BRG1 (un regalo del doctor Tsutomu Ohta, Centro Nacional del Cáncer, Japón), anti-NS (A300-600A; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE.UU.), anti-GAPDH (3H12; Médico & amp; Biological Laboratories (MBL), Nagoya, Japón), anti-CD133 (W6B3C1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y anti-CD44 (2C5; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Se detectaron señales de LAS-3000 (Fujifilm, Tokio, Japón), cuantificado con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.) y se normalizaron utilizando GAPDH control de carga.
hTERT ELISA
El hTERT ELISA emplea un conejo anti-hTERT anticuerpo policlonal como anticuerpo de captura (MBL), y un anti-hTERT anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) (clon 2E4-5) como el anticuerpo de detección (código de MBL no. 5340, Ab-Match Asamblea humana Kit de TERT). El anticuerpo 2E4-5 fue generado contra hTERT recombinante como inmunógeno tal como se describe anteriormente [11]. Las células se lisaron en tampón RIPA. Después de la sonicación y centrifugación de los lisados, se añadieron 100 g de proteínas totales (100 l de volumen) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (código de MBL no. 5310, Ab Match-Kit universal). El ELISA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las absorbancias a 450 y 630 nm se midieron mediante un lector de microplacas. Cada experimento se realizó al menos tres veces, y se calcularon los valores medios.
promotor de TERT mutación análisis
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares de cáncer de ovario usando una célula de cultivo de sangre y ADN Kit (Qiagen , Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La
de TERT
región promotora (-146 a -124 pb aguas arriba del codón de inicio) se amplificó por PCR utilizando KOD FX (Toyobo, Osaka, Japón) y los siguientes cebadores: 5'-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3 ' y 5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3 '[25]. PCR se realizó en las siguientes condiciones: 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s, y 68 ° C durante 60 s. Los productos de PCR purificados se secuenciaron por secuenciación de Sanger.
Transfección de ARNsi
Las células fueron transfectadas con siRNA por Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) y luego se sembró a 5.000-10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos . A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con eribulina, y se realizó un ensayo MTT después de 72 h de tratamiento. Para el ELISA, 2-5,0 × 10
6 células transfectadas con siRNA se sembraron en una placa de 10 cm de Petri, y a continuación se recogió después de 48 h de incubación. hTERT siRNA1 y hTERT siRNA2 se han descrito previamente [8]. También se utilizó
IP-RDRP ensayo
Con el fin de detectar la actividad RDRP
en
vitro
, el complejo inmune hTERT se aisló por mAb contra hTERT. Un ensayo de IP-RdRP se ha establecido en las células HeLa detenidas mitóticamente [11]. Por lo tanto, se utilizaron células HeLa para este ensayo. Para sincronizar células HeLa mitosis someterse, las células se cultivaron en medio que contiene timidina 2,5 mM (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) durante 24 h. A las 6 h después de la liberación, las células se incubaron en medio que contenía 0,1 mg /ml nocodazole (Sigma-Aldrich) durante 14 h. Después de agitar suavemente, se recuperaron las células mitóticas. El ensayo de IP-RDRP se llevó a cabo como se describe anteriormente [11].
ensayo TRAP
Una trampa de ensayo se utilizó para detectar la actividad de la transcriptasa inversa específica de los telómeros como se describe anteriormente [39].
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Se utilizó la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney. los valores de p de dos caras de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Apoyo a la Información
Figura S1..
CD133 y CD44 expresión en Eribulina S y R Eribulina células cáncer de ovario. (A) El nivel de expresión de la proteína CD133 y CD44 se detectó por inmunotransferencia. Desde que se obtienen los datos en el mismo experimento que en la Figura 2 el panel D, gel GAPDH era idéntica a señales del panel de la Figura 2 D. (B) en (A) se cuantificó con el software ImageJ y normalizados a la señal GAPDH. Los valores promedio de nivel de expresión relativa ± SD se indican
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figura S2. células de viajeros sobre Es-2 y RMG-I poseen mutaciones del promotor de hTERT. El promotor de hTERT fue secuenciado en cada línea celular. ES-2 células albergan una -138 /-139 GG & gt; AA mutación como se describe anteriormente [27], y las células RMG-I albergan una -124 G & gt; Una mutación. Las secuencias de tipo salvaje de las regiones correspondientes a partir de células OVKATE y OVSAHO se muestran como controles
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Tabla S1.
líneas celulares de cáncer de ovario utilizados en este estudio
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Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Tsutomu Ohta por el don de anticuerpo anti-BRG1, el Dr. Koichi Ichimura para la asistencia técnica con el análisis del promotor de mutación, y MBL para su colaboración para establecer el kit ELISA para la detección de hTERT.