Extracto
La berberina (BBR), un alcaloide derivado de isoquinolina aislado a partir de hierbas chinas, tiene una larga historia de usos para el tratamiento de múltiples enfermedades, incluyendo el cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos de acciones de BBR en células de cáncer de pulmón humano no están claros. En este estudio, hemos investigado los mecanismos moleculares por los que BBR inhibe el crecimiento celular en células de células no pequeñas de cáncer de pulmón humano (NSCLC). El tratamiento con BBR promovido cambio morfología celular, la migración celular inhibida, la proliferación y la formación de colonias, y la apoptosis celular inducida. El estudio adicional mecanismo molecular demostró que BBR dirigido simultáneamente las vías de señalización para inhibir el crecimiento de células NSCLC múltiples células. El tratamiento con BBR inhibida AP-2α y expresión AP-2β y abrogó su unión en los promotores de hTERT, lo cual inhibe la expresión de hTERT. Desmontables de AP-2α y AP-2β por siRNA aumentada considerablemente la inhibición mediada por BBR del crecimiento celular. BBR también suprimió la translocación nuclear de p50 /p65 proteínas NF-kB y su unión a la COX-2 promotor, produciendo la inhibición de COX-2. BBR también downregulated la expresión de HIF-1α y VEGF e inhibió la fosforilación de Akt y ERK. Desmontables de HIF-1α por siRNA aumentada considerablemente la inhibición BBR mediada del crecimiento celular. Además, el tratamiento BBR desencadena la liberación de citocromo-c desde el espacio inter-membrana mitocondrial en el citosol, promueve la escisión de la caspasa y PARP, y la expresión afectada de BAX y Bcl-2, activando de este modo la vía apoptótica. En conjunto, estos resultados demostraron que BBR inhibió el crecimiento celular de NSCLC por la orientación simultáneamente AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT, Raf /MEK /ERK y el citocromo-c /caspasa vías de señalización. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la comprensión de los mecanismos contra el cáncer de BBR en la terapia del cáncer de pulmón humano
Visto:. Fu L, Chen W, W Guo, Wang J, Tian Y, Shi D, et al. (2013) La berberina Objetivos AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, HIF-1α /VEGF y el citocromo-c /Caspasa Señalización para suprimir el crecimiento de células cancerosas humanas. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10.1371 /journal.pone.0069240
Editor: guti Xiao, Universidad de Pittsburgh Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 26, 2013; Aceptado: 6 Junio 2013; Publicado: July 15, 2013
Derechos de Autor © 2013 Fu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071687, 81272195), el Estado "Programa 863" de China (SS2012AA020403), la Fundación de Programas de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20110171110077), y el Laboratorio Estatal de Oncología en el sur de china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran la afiliación (s) para "Guangzhou Doble Bioproducto Inc" en el sección de Intereses de la forma de manuscrito en línea que compiten. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón ocupa el primer lugar entre las muertes relacionadas con el cáncer en el mundo [1]. La incidencia del cáncer no microcítico de pulmón de células (CPNM), una forma importante de cáncer de pulmón, se ha ido incrementando con la mortalidad y la morbilidad significativa. El tratamiento como la quimioterapia y la radioterapia son las principales estrategias de terapia de cáncer de pulmón [2]. En los últimos años, las terapias se dirigen selectivamente a señalización celular vías, tales como EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, MET, TITF-1, p53, LKB1 y muchos otros, no sólo proporcionan una mejor comprensión de NSCLC carcinogénesis, sino también utilizado como factores de pronóstico u objetivos para la personalización de la terapia [3]. Sin embargo, la supervivencia sigue siendo pobre. El progreso en la biología del cáncer de pulmón y la genética llevó al desarrollo de fitoquímicos de molécula pequeña, especialmente fitoquímicos extraídos de hierbas chinas que tienen efectos sobre la proliferación de células de cáncer, la angiogénesis y la apoptosis [4]. Por lo tanto, la optimización del uso de fitoquímicos terapéuticos convencionales y novedosos puede mejorar el resultado del tratamiento para el cáncer de pulmón.
Las hierbas chinas se han utilizado ampliamente y con éxito durante siglos en el tratamiento de diferentes tipos de enfermedades [5]. Los fitoquímicos de las hierbas chinas se han mostrado prometedores para la prevención del cáncer con seguridad y eficacia [6]. La berberina (BBR) es un alcaloide derivado de isoquinolina aislado a partir del rizoma, las raíces y la corteza del tronco de un número de hierbas chinas, los
Berberis
especies, como
Hydrastis
canadensis
(sello de oro),
corteza phellodendri gratis (Huangbai) y
Rhizoma Coptidis gratis (Huanglian) [7]. La berberina tiene una larga historia de ser utilizado como agente terapéutico para tratar una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer. Se ha informado de que BBR exhibiendo múltiples actividades farmacológicas, incluyendo anti-inflamatoria [8], anti-hipertensiva [9], que reduce el colesterol [10], anti-diarreicas [11,12], anti-microbiana [13,14 ] actividades, y el efecto antitumoral de BBR era cada vez más de relieve en las últimas décadas [15,16]. BBR se ha demostrado que presentan efectos anti-proliferación contra las células de cáncer de diferentes orígenes, incluyendo glioblastoma [17], melanoma [18], cáncer de colon [19], cáncer de mama [20,21], cáncer de próstata [22], etc. . En el cáncer de pulmón humano, se ha demostrado que mejora la BBR cito-toxicidad de la radiación en la
in vivo
y
in vitro y modelos en a través de la inducción de la autofagia [23], y BBR exhibido un efecto protector sobre la lesión pulmonar inducida por la radiación a través de la adhesión intercelular crecimiento molecular-1 y la transformación del factor-beta-1 [24]. BBR también inhibió de manera efectiva la capacidad de la motilidad y la invasión de cáncer de pulmón a células A549 en una dosis y tiempo dependiente bajo concentraciones no citotóxicas través de una reducción de las producciones activador de plasminógeno de tipo uroquinasa y la matriz metaloproteinasa-2 [25]. Además, se informó de BBR para inhibir el crecimiento e inducir la apoptosis en células de cáncer de pulmón humano, y la administración de BBR por sonda oral inhibió el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos atímicos [26]. A pesar de la evidencia de los efectos antitumorales de BBR se está expandiendo, la incertidumbre de los mecanismos de BBR en NSCLC sigue siendo.
telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) ha demostrado ser un importante componente de la telomerasa humana, que sintetiza ADN telomérico, alarga extremos de los cromosomas y mantiene la estabilidad cromosómica, finalmente conduce a la inmortalización celular [27]. hTERT no se expresa en la mayoría de las células somáticas humanas, pero comúnmente se sobreexpresa en una amplia gama de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón [28]. La elevada expresión de hTERT es necesario transformar las células humanas normales en células cancerosas. La regulación transcripcional del gen hTERT es el principal mecanismo para la activación específica del cáncer de la telomerasa, y un número de factores han sido identificados para regular directa o indirectamente el promotor de hTERT [29]. El potenciador de unión activación de la proteína-2 (AP-2) ha demostrado que el control transcripcional de la expresión de hTERT. La familia del factor de transcripción AP-2 contiene un conjunto de ácidos desarrollo regulados los genes inducibles, retinoico compuestos por cuatro factores relacionados-AP2α, AP2β, AP2γ, y AP2δ [30]. Mediante la unión al promotor de hTERT, AP-2 factores ejercen sus efectos biológicos a través de la activación de un número de genes relacionados con el tumor y vías de señalización, incluyendo hTERT, PI3K /Akt, y Raf /MEK /ERK [31].
factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) ha sido reconocido como uno de los principales iniciadores en el desarrollo y progresión del sistema de vascularización [32]. factor derivado del epitelio pigmentario-(PEDF), un potente inhibidor de la angiogénesis, así como un factor de neuro-protector, contrarresta el efecto de VEGF [33]. VEGF y PEDF ambos poseen múltiples actividades y funciones biológicas y que tienen una relación inversa entre sí especialmente en el cáncer [34]. La expresión de VEGF y PEDF está regulada por un cuerpo de factores externos, de la que la hipoxia es el mediador mejor caracterizada. La hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) es un factor de transcripción que juega un papel crucial en la carcinogénesis. La actividad de HIF-1α es upregulated por una variedad de señales no hipóxicas, incluyendo la activación por varias vías oncogénicas tales como Src, HER-2, Ha-Ras, y activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) de señalización [35]. Mediante la unión a los elementos de respuesta a hipoxia en el promotor de VEGF, HIF-1 conduce a la activación transcripcional del gen de VEGF [36].
COX-2 es una enzima inducible que convierte el ácido araquidónico en prostaglandinas, y se sobreexpresa habitualmente en una amplia gama de cánceres humanos [37]. El aumento de la expresión de la proteína COX-2 y de la producción de PGE2 secuencial han demostrado mejorar significativamente la carcinogénesis y las reacciones inflamatorias mediante la regulación al alza de EGFR, PI3K, y ERK1 /2 señalización [38]. La expresión de la COX-2 se transcriptionally controlada por la unión de múltiples transactivadores y coactivadores a los sitios correspondientes situados en su promotor. Entre los varios elementos reguladores conocidos que distribuyen en la región núcleo promotor de la COX-2 transcripción de inicio del sitio, sitio de unión de NF-kB es esencial para la COX-2 la actividad promotora [39,40]
.
La PI3K /AKT y Raf /MEK /ERK son dos vías de señalización celular clásicos y desempeña un papel clave en la regulación de la expresión génica celular, la supervivencia de crecimiento. Anormal PI3K /AKT y la señalización /ERK Raf /MEK pueden conducir a la proliferación de células aumentado o no controlada, resistencia a la apoptosis y a la quimioterapia, la radioterapia, y la orientación terapias en los tumores. La activación de la proteína HIF-1 podría ser facilitada por PI3K /AKT y la señalización de Raf /MEK /ERK. Como las moléculas de señalización aguas arriba de la proteína HIF-1, ERK también podría desempeñar su papel en la mediación del efecto de BBR en la inhibición de crecimiento celular [41].
La inducción de la apoptosis se considera como uno de los posibles mecanismos de inhibición del desarrollo del cáncer. La activación de caspasa juega un papel central en la ejecución de apoptosis. Las caspasas activadas escinden una variedad de proteínas diana, desactivando de este modo importantes procesos celulares y romper los componentes estructurales de la célula. La liberación de citocromo-c desde el espacio entre la membrana mitocondrial al citosol es la condición previa de la vía de la apoptosis dependiente de caspasa. El citocromo c se une a Apaf-1 en ausencia de dATP, y el complejo se une pro-caspasa-9 para formar apoptosoma, que escinde la pro-caspasa a la caspasa 9, y a su vez activa el efector de la caspasa-3 [42].
en este estudio, hemos investigado los mecanismos que subyacen detalladas de BBR en la inhibición del crecimiento de células de NSCLC en CPNM
in vitro
. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la exploración de las posibles estrategias terapéuticas y nuevos objetivos para el cáncer de pulmón humano.
Resultados
BBR cambian la morfología celular y la migración celular inhibida
En primer lugar, analizamos la efecto de BBR en la morfología celular en células A549 y H1299. El tratamiento con BBR a 100 mM BBR redujo efectivamente el contacto célula a célula y condujo a una menor difusión con menos formación de fi lopodia en comparación con los grupos de control DMSO (Figura 1A). También probamos el efecto de BBR sobre la migración celular mediante el empleo de un ensayo de cicatrización de heridas. Como se muestra en la Figura 1B, la parte del espacio de la herida entre las capas de células después de hacer un cero fue ocupada completamente por las células que migran a las 48 h en el grupo de control. Sin embargo, el espacio vacío de las células no fue ocupado por las células que migran tratados con 20 mM BBR. Estos resultados demostraron el potencial de BBR en el cambio de la morfología celular y la inhibición de la migración de células en células de cáncer de pulmón
(A) Los cambios en la morfología celular y la difusión en A549 y células H1299 tratadas con 100 mM BBR para se observaron 48 h y las células se fotografiaron usando un microscopio equipado con una cámara digital. migración (B) de la célula se analizó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Las células se hicieron crecer hasta confluencia completa. Las monocapas de células fueron heridos con una punta de pipeta estéril, y se lavaron con medio para eliminar las células desprendidas de las placas. Las células se dejaron sin tratar o tratadas con 20 mM BBR. Después de 48 h, se observó la brecha de la herida y se fotografiaron las células.
BBR suprime la proliferación celular y la formación de colonias
berberina se ha demostrado que induce la inhibición del crecimiento y la apoptosis de las no pequeñas células de cáncer de pulmón humano de células a través de la vía de señalización de p53 [43]. A continuación analizaron cuantitativamente el efecto de BBR en la proliferación celular en el cáncer de pulmón A549 y células H1299 por el ensayo de MTT. El tratamiento con BBR a la dosis de 10 mM a 200 mM inhibió la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis. El IC valores
50 de BBR para A549 y células H1299 son de 67,1 micras y 59,2 mM, respectivamente (Figura 2A). También hemos probado los efectos de BBR en clonogenicidad de células tumorales en células A549 (Figura 2B). El tratamiento con BBR formación de colonias marcadamente inhibida, lo que resulta en una disminución significativa tanto en relación de la formación de colonias (Figura 2C) y tamaño de las colonias (Figura 2D).
(A-C) A549 humano y H1299 células fueron tratadas con BBR a las dosis indicadas. A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante un ensayo MTT. Se calcularon los valores de CI50 de BBR para A549 y las células H1299 (A). También se analizó la formación de colonias inducida por las células tumorales A549 (B), y se calculó la tasa de formación de colonias (C) y tamaño de las colonias (D). Las células tratadas con DMSO se utilizaron como grupo de referencia con la viabilidad celular fijado en 100%. El porcentaje de viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con vehículo de control DMSO. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres pruebas. *, P & lt; 0.05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control de DMSO.
BBR inhibieron AP-2 /señalización
hTERT
hTERT ha sido considerado como el sello distintivo de la carcinogénesis y la expresión de hTERT es estrechamente controlada por el factor de transcripción AP-2. Para determinar si BBR dirige la señalización AP-2 /hTERT, se trataron células A549 con BBR (20 mM o 100 mM) y examinado la expresión de AP-2α, AP-2β y proteínas hTERT y mRNAs por Western blot y RT-PCR , respectivamente. El tratamiento con BBR condujo a una marcada inhibición de la expresión de AP-2α, AP-2β y hTERT en proteína (Figura 3A) y los niveles de ARNm (Figura 3B).
células A549 NSCLC humano (A-C) fueron tratados con BBR a las dosis indicadas. A las 48 horas después del tratamiento, las proteínas hTERT AP-2 y (A) y el ARNm (B) se analizaron por transferencia Western y RT-PCR, respectivamente. GAPDH se utilizaron como controles para la carga de la muestra. La unión de AP-2 a la sonda de promotor de hTERT (C) se analizó mediante un ensayo desplegable estreptavidina-agarosa. (D) células A549 fueron transfectadas con un ARNsi AP-2 o un vector de AP-2-expresión durante 24 horas, y luego tratados con BBR (100 M). A las 48 horas después del tratamiento, la expresión de proteínas y la viabilidad celular se determinó por transferencia Western y ensayo de MTT, respectivamente. El porcentaje de viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con el control del vehículo. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *, P & lt; 0.05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control de DMSO
desplegable ensayo estreptavidina-agarosa
Dado que la expresión de hTERT está estrechamente controlada por la actividad de unión de AP-2 en la familia promotor de hTERT, A continuación realizó. para examinar el efecto de BBR en actividades de unión de AP-2α y AP-2β al promotor de hTERT. Como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento BBR abrogada efectivamente AP-2α y AP-2β de unión a la sonda de hTERT promotor de ADN marcado con biotina (Figura 3C).
Para confirmar el papel de la AP-2 de señalización en BBR- inhibición de la proliferación mediada por células, las células transfectadas A549 con AP-2α o AP-2β siRNA (100 nM) y luego se los trató con BBR (100 mM) durante 48 h. Los resultados mostraron que la transfección con AP-2α o AP-2β siRNA eficazmente el regulado de la expresión de AP-2α o proteína AP-2β y la viabilidad celular considerablemente inhibido (Figura 3D). Desmontables de AP-2α o AP-2β por siRNA también aumenta notablemente la inhibición mediada por BBR de la viabilidad celular en comparación con la transfección con el ARNsi de control (si-NC) (Figura 3D). Estos resultados confirman que el efecto de BBR en la inhibición de la proliferación celular está mediada al menos en parte a través de la vía de señalización AP-2 /hTERT en células de cáncer de pulmón.
BBR inhibe NF-KB /COX-2 de señalización
High expresión de COX-2 está implicada en el crecimiento de células de cáncer, la migración y la angiogénesis. Para determinar los efectos de BBR sobre COX-2 de señalización en células de cáncer de pulmón, el próximo analizado la expresión de la proteína COX-2 en las células A549 tratadas con BBR por Western blot. El tratamiento con BBR a la dosis de 20 mM no inhibió significativamente la expresión de la proteína COX-2, mientras que la dosis de 100 mu M disminuyó notablemente la expresión de la proteína COX-2 en células A549 (Figura 4A)
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(A) células A549 humanas se trataron con BBR a las dosis indicadas. A las 48 horas después del tratamiento, la proteína COX-2 se analizó mediante transferencia Western. GAPDH se utilizaron como controles para la carga de la muestra. (B) las células A549 se trataron previamente con la COX-2 celecoxib inhibidor selectivo (CB, 20 M) durante 24 horas, y luego tratados con BBR (20 M). A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante análisis MTT. El porcentaje de viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con el control del vehículo. células A549 (C) se trataron con BBR a las dosis indicadas. A las 48 horas después del tratamiento, la unión de p50 y p65 de la COX-2 sonda de promotor se analizó mediante un ensayo desplegable estreptavidina-agarosa. (D) células A549 se trataron con BBR (100 nM). A las 48 horas después del tratamiento, el efecto de BBR en NF-kappa B p65 y p50 translocación se analizó mediante ensayo de inmunofluorescencia. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *, P & lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control DMSO.
La expresión de la COX-2 está estrechamente regulada por la actividad de unión de p50 /p65 de NF-kB en la COX-2 promotor estructura. A continuación se determinó si la inhibición inducida por BBR de la proliferación de células tumorales y la COX-2 expresión es mediada por la inhibición de la unión de NF-kappa B para COX-2 promotor en células A549. desplegable ensayo de estreptavidina-agarosa mostró que BBR a la dosis de 100 M marcadamente inhibida p50 NF-kB y p65 que se unen a la COX-2 sonda de promotor en comparación con el grupo control (Figura 4B). Por el contrario, BBR a la dosis de 20 y 100 M no afectó a los niveles de p50 y la proteína p65 en lisados de células enteras (Figura 4A).
La translocación de p65 NF-kB y p50 en los núcleos de células y obras de teatro citoplasmáticas un papel clave en regular la COX-2 de la expresión génica. A continuación realizó ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de BBR en NF-kappa B p65 y p50 translocación en las células A549. translocación constitutiva de NF-kB p65 y p50 a los núcleos de las células se detectó (Figura 4C). El tratamiento con BBR (100 M) promueve eficazmente la translocación de p65 NF-kB y p50 a partir de núcleos de células de citoplasma. Los resultados sugieren que la inhibición del crecimiento de células tumorales por BBR podría estar también mediada por la modulación de la vía de señalización de NF-KB /COX-2 en células de cáncer de pulmón.
BBR inhibida HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT , Raf /MEK /ERK señalización
El VEGF señalización de HIF-1α PEDF //está estrechamente relacionada con el crecimiento celular del cáncer, la migración y la angiogénesis. Se determinó el efecto de la siguiente BBR sobre la expresión de HIF-1α, VEGF y PEDF en la proteína y los niveles de mRNA en células de cáncer de pulmón por RT-PCR y Western blot, respectivamente. El tratamiento de células A549 con BBR inhibió significativamente la expresión de HIF-1α y VEGF, pero no PEDF, en la proteína (Figura 5A) y los niveles de mRNA (Figura 5B).
células A549 se trataron con BBR en el indicado dosis. A las 48 horas después del tratamiento, la expresión de HIF-1α, VEGF y PEDF en proteína (A) o los niveles de mRNA (B), así como el total y Akt fosforilada y ERK1 /2 proteínas (D), se determinaron. las células A549 se trataron con el siRNA HIF-1α-específico (si-HIF) (C) o el inhibidor de Akt selectivo LY294002 (LY, 30 M) o el U0126 inhibidor de ERK-selectivo (U, 50 M) (E) para 24 horas, respectivamente, y luego tratados con BBR. A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante análisis MTT. El porcentaje de viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con el control del vehículo. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *, P & lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control de DMSO.
Para validar los efectos de BBR sobre la señalización de HIF-1α /VEGF /PEDF, transfectadas las células A549 con HIF-1α siRNA (100 nM) y luego se trata con BBR (100 mM) durante 48 h. Como se muestra en la Figura 5C, desmontables de HIF-1α por siRNA se incrementó considerablemente la inhibición mediada por BBR de la proliferación celular en comparación con la transfección con el control de siRNA. Estos resultados confirman que el efecto de BBR en la inhibición de la proliferación celular también está mediada parcialmente a través de HIF-1α /VEGF /ruta en células de cáncer de pulmón de señalización PEDF.
La PI3K /AKT y la señalización de Raf /MEK /ERK desempeña un papel importante en la regulación de la proliferación celular del tumor y la supervivencia. Para determinar si la inhibición del crecimiento celular mediada por BBR también es a través de la inactivación de la vía PI3K /AKT y ruta de señalización de Raf /MEK /ERK, se analizó el efecto de BBR en la fosforilación de Akt y ERK en las células A549 por Western blot. Como se muestra en la Figura 5D, el tratamiento con BBR redujo significativamente los niveles de la Akt fosforilada y ERK1 /2 proteínas, mientras que los niveles de Akt total y de la proteína ERK1 /2 no cambiaron.
BBR activa de apoptosis dependiente de caspasa vía
también determina si la mejora de la inhibición del crecimiento celular inducida por BBR se asocia con el aumento de la apoptosis en células de cáncer de pulmón. El tratamiento con BBR a las dosis de 20 mM y 100 mM inducidos 26% y el 50% de células apoptóticas en A549 y 28% y 60% de células apoptóticas en células H1299 (Figura 6A). Para confirmar el efecto de BBR en la apoptosis, el próximo detectado la expresión de algunas proteínas pro-apoptóticos y anti-apoptóticos, caspasa-3 /7/9, PARP, BAX y Bcl-2 en las células A549 mediante análisis de transferencia Western. BBR aumenta notablemente los niveles de expresión de PARP de la caspasa-3 /7/9, exfoliados escinde y las proteínas Bax, pero disminuyó los niveles de proteína Bcl-2, en comparación con el grupo control (Figura 6B).
A549 y células H1299 se trataron con BBR (20 mM o 100 mM). A las 48 horas después del tratamiento, la apoptosis se determinó mediante un análisis FACS (A). Los niveles de la PARP caspasa-3, 7, 9, exfoliados troceados, proteínas Bax y Bcl-2 en células A549 se analizaron por Western blot (B). La liberación de Cyt-c en las células A549 se analizó por análisis de imágenes de inmunofluorescencia para controlar la liberación Cyt-c del espacio inter-mitocondrial en el citosol (C). La apoptosis están representados por porcentajes relativos de células apoptóticas en comparación con la de las células tratadas con DMSO. *, P & lt;. 0.05, diferencias significativas entre los grupos tratados con BBR y los grupos tratados con DMSO
El citocromo-c (cito-c) la liberación es un evento importante en la vía de la apoptosis dependiente de caspasa . A continuación realizó el análisis de imágenes de inmunofluorescencia (IF) para monitorear los cambios en la localización subcelular de cito-c en las células A549 para determinar si BBR podría inducir la liberación de cito-c. El tratamiento con BBR (20 mM o 100 mM) marcadamente desencadena la liberación de cito-c del espacio inter-mitocondrial en el citosol (Figura 6C). Estos resultados demuestran que puede facilitar la BBR aguas abajo cito-c-dependiente ensamblaje apoptosome y la activación de caspasas en el citosol de las células de cáncer de pulmón.
Discusión
En este estudio, se evaluó la respuesta de los humanos las células de cáncer de pulmón A549 y H1299 de BBR, un derivado de isoquinolina alcaloides aislados de hierbas chinas. Se encontró que BBR mejorada inhibición del crecimiento celular y la inducción de apoptosis de una manera dependiente de la dosis, mientras que estos efectos no se observaron en las células epiteliales bronquiales humanas normales (datos no mostrados). Nuestros resultados demostraron que el efecto antitumoral de BBR está mediada a través de la modulación de la AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, NF-kB /COX-2, PI3K /Akt, Raf /MEK /ERK, caspasa /citocromo C y BAX /Bcl-2 dependiente de la señalización.
hTERT ha sido considerada como el punto de referencia de la carcinogénesis. La señalización /hTERT AP2 ha demostrado ser importante en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [44]. Se encontró que la inhibición de la expresión de hTERT para contribuir a prevenir la proliferación y la angiogénesis y para inducir la apoptosis de las células del cáncer [45]. En nuestro estudio, hemos demostrado que el efecto de BBR en la inhibición de la proliferación de células tumorales está mediada parcialmente a través de la señalización AP-2 /hTERT. El tratamiento con BBR suprimió la expresión de AP-2a y AP-2b y reduce su abundancia de proteínas en el núcleo celular, disminuyendo de ese modo la unión de AP-2a y AP-2b con el promotor de hTERT y abajo de la regulación de la expresión de hTERT en el BBR- las células tratadas.
se requiere que el aumento de la proporción de VEGF /PEDF para la angiogénesis y el crecimiento tumoral [46]. La vía de HIF-1α /VEGF /PEDF existe como un paso crítico en la angiogénesis del cáncer de pulmón y metástasis del tumor [47]. Nuestro estudio demostró que la BBR inhibe la expresión de HIF-1α, por lo tanto inhibe la relación de VEGF /PEDF en células de cáncer de pulmón. Es posible que BBR inhibe la acumulación de proteína HIF-1α en células de cáncer de pulmón y, a continuación, suprimió la expresión de los genes relacionados que están implicadas en la proliferación de células tumorales. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que HIF-1α señalización contribuye, al menos en parte, a la inhibición del crecimiento celular inducida por BBR.
COX2 juega un papel clave en las primeras etapas de la carcinogénesis de pulmón [48]. Aquí, hemos demostrado que BBR jugado su papel antiproliferativo parcialmente a través de la inhibición de la COX-2 de expresión. Se encontró que el BBR inhibe la COX-2 expresión no sólo a nivel de proteínas, pero también a nivel de ARNm, lo que sugiere que BBR podría ejercer un efecto antitumoral parcialmente a través de la supresión de la COX-2 de señalización. También se encontró que la inhibición de la COX-2 expresión mediante el tratamiento de BBR está mediada en parte por la estimulación de NF-kappa B translocación nuclear de al citosol y mediante la inhibición de la unión de NF-kappa B para COX-2 promotor.
La PI3K /AKT y la señalización de Raf /MEK /ERK juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica celular, la supervivencia de crecimiento. La relación de Raf /MEK /ERK y PI3K /AKT con el cáncer de pulmón sigue siendo un área de investigación intensa en la actualidad [49,50]. Nuestra investigación ha demostrado el importante papel de PI3K /AKT y la vía de señalización de Raf /MEK /ERK en la inhibición de la proliferación celular mediada por BBR. BBR podría funcionar a través de la inactivación de PI3K /AKT y la vía Raf señalización /MEK /ERK, la inhibición de la fosforilación de las proteínas Akt y ERK, y la regulación negativa de HIF-1α señalización para inhibir el crecimiento de células tumorales.
Apoptosis jugar un papel crucial en la respuesta del cáncer a la quimioterapia y la radiación. En este estudio, hemos demostrado que la inducción de la apoptosis en células de cáncer de pulmón humano por BBR fue mediado por el citocromo-c y vías de la apoptosis dependiente de caspasa. Se encontró que BBR inducida por la activación de las proteínas de caspasa y PARP, y promueve la liberación de citocromo-c de la mitocondria al citosol. Por tanto, nuestros resultados sugieren que el efecto antitumoral de BBR en células de cáncer de pulmón está asociado con el aumento de la activación de la citocromo-c y vía apoptótica dependiente de caspasa.
En resumen, hemos demostrado que BBR exhibió anti-proliferativa y pro actividades -apoptotic en células de NSCLC mediante la modulación simultánea de la AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, NF-kB /COX-2, Raf /MEK /ERK, PI3K /AKT y la caspasa /citocromo-c vías de señalización. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos en la exploración de las nuevas estrategias terapéuticas potenciales y nuevos objetivos para el tratamiento del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
El cáncer de pulmón humano A549 líneas de células y H1299 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células fueron cultivadas como monocapas en medio RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal, 100 mg /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
Reactivos y anticuerpos
la berberina (BBR), U0126, LY294002 y celecoxib fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO) y se disolvieron en una pequeña cantidad de DMSO antes de la adición al medio de cultivo celular completo. Estreptavidina-agarosa se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). Los anticuerpos para GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, p50, p65, COX-2 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra AP-2α, AP-2β, hTERT, el citocromo-c, PARP, caspasa-3 /7/9, BAX, Bcl-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt o ERK1 /2 fueron adquiridos de Señalización Celular ( Beverly, MA).
cicatrización de heridas ensayo
El ensayo de cicatrización de heridas se realizó para detectar la migración celular. Las células se hicieron crecer hasta confluencia completa en placas de seis pocillos y se incubaron durante la noche en medio de inanición. monocapas de células fueron heridos con una pipettetip 100 l estéril, se lavaron con medio de inanición para eliminar las células desprendidas de las placas. Las células fueron tratadas con dosis indicadas de BBR en medio completo y se mantienen en un CO
2 incubadora. Después de 48 h, el medio se reemplazó con PBS, se observó la brecha de la herida y las células se fotografiaron usando un microscopio Olympus equipado con cámara digital.
viabilidad de las células de ensayo
viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT (Roche Diagnóstico, Indianapolis, IN). Brevemente, las líneas celulares de cáncer de pulmón se sembraron a 4 x 103 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante toda la noche, y luego las células se cambiaron a medio fresco que contenía varias concentraciones de BBR disueltos en DMSO (concentración final, 0,1%). Después las células se incubaron durante 48 h, se midió el crecimiento de las células. El efecto sobre la viabilidad celular se evaluó como el porcentaje de viabilidad celular en comparación con células de control tratadas con vehículo, que fueron asignados arbitrariamente 100% de viabilidad. La concentración BBR requerida para causar inhibición del crecimiento celular del 50% (IC50) se determinó mediante interpolación a partir de curvas de dosis-respuesta.
Anchorage independiente ensayo de formación de colonias
células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos eran tratado con BBR. Después de 24 h, las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron. Luego, las células (8 × 10
3 /ml) se mezclaron en agar 5a de 1,0 ml de 0,3% McCoy que contenía 10% de FBS. Los cultivos se mantuvieron en un 37 ° C, 5% de CO
2 incubadora durante 14 días. El medio se desechó y las células se lavaron cuidadosamente con PBS dos veces.