Extracto
B de linfocitos inducida por la proteína de maduración 1 (Blimp1) es un regulador maestro de la diferenciación de células B, y los controles de la migración de células germinales primordiales. Recientemente hemos observado expresión Blimp1 aberrante en las células de cáncer de mama que resultan de una vía de señalización NF-kB RelB a Ras. Con el fin de abordar la cuestión de si la expresión inesperada de Blimp1 se observa en otros tumores epiteliales derivadas, se seleccionaron los cánceres de pulmón, ya que son frecuentemente impulsados por la señalización de Ras. Blimp1 se detectó en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón de cinco examinados y demuestran que fomentan la migración de células de cáncer de pulmón y la invasión. El interrogatorio de microarrays de datos demostró elevada
Blimp1
la expresión del ARN en el adenocarcinoma de pulmón, carcinomas ductales pancreáticas, tumores de cabeza y cuello, así como en glioblastomas. La participación de los
Ras
y su quinasa c-Raf aguas abajo se confirmó el uso de estrategias mutantes y siRNA. Seguidamente se dirigió a la cuestión del mecanismo de activación Blimp1 en el cáncer de pulmón. Uso de caída y la expresión ectópica, el papel de la proteína activadora (AP) -1 familia de factores de transcripción se demostró. Además, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina confirmaron la unión a los elementos identificados AP-1 en el
Blimp1
promotor ectópica expresó c-Jun y de subunidades endógenas AP-1 después de la estimulación de suero. El dominio de propéptido de la lisil oxidasa (LOX-PP) fue identificado como un supresor de tumores, con capacidad para reducir Ras señalización en células de cáncer de pulmón. LOX-PP expresión reducida de Blimp1 mediante la unión a c-Raf y la inhibición de la activación de AP-1, atenuando de esta manera el fenotipo migratorio de las células de cáncer de pulmón. Por lo tanto, Blimp1 es un mediador de Ras /Raf /AP-1 de señalización que promueve la migración celular, y es reprimida por LOX-PP en el cáncer de pulmón
Visto:. Yu Z, Sato S, Trackman PC, Kirsch KH , Sonenshein GE (2012) Blimp1 activación por AP-1 en células de cáncer de pulmón humano promueve un fenotipo migratorias y es inhibida por la lisil oxidasa propéptido. PLoS ONE 7 (3): e33287. doi: 10.1371 /journal.pone.0033287
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Octubre, 2011; Aceptado: 10 Febrero 2012; Publicado: 15 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios fueron apoyados por los Institutos nacionales de Salud (NIH) concede R01 CA143108 y PO1 ES011624. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
B proteína de la maduración de los linfocitos inducida por 1 (Blimp1) o positiva-Reguladora dominio I de unión al factor 1 (PRDI-BF1) es una proteína con dedos de zinc codificada por el dominio
PRDI-BF1 y RIZ 1
(
PRDM1
) o
Blimp1
genes [1], [2], que se aisló inicialmente como un represor transcripcional de la
IFNß
promotor [3]. Varios mecanismos de represión Blimp1 mediada por la transcripción de genes se han dilucidado: reclutamiento de las histonas methyltransferases (HMTs) [4], las histonas desacetilasas (HDACs) [5] o corepressors [2] o por la competencia con activadores de la transcripción [6]. Blimp1 fue identificado como un regulador maestro de la diferenciación terminal de células B [7], que promueve la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas [8]. Varios factores han sido implicados en la activación de la transcripción de la
Blimp1
génica durante la diferenciación de células B, incluyendo NF-kappa B, AP-1, IRF4, STAT3 y STAT5, aunque, sus mecanismos precisos de acción son no se entiende completamente [9]. Blimp1 se demostró posteriormente para regular la proliferación de células T y la homeostasis [10]. Durante el desarrollo, Blimp1 controla la especificación de células germinales primordiales (PGC) y la migración como Blimp1 deficientes en embriones de ratón generan células PGC-como los que no muestran la migración PGC característica [11], [12]. Algo inesperadamente, Blimp1 se detectó en las células de cáncer no hematopoyéticas. Nuestro laboratorio observó expresión Blimp1 en células de cáncer de mama, y se la mostró reprime la transcripción de la
ESR1
gen que codifica el receptor de estrógenos alfa (ER), promoviendo así un fenotipo más migratoria [13]. inducción transcripcional de Bcl-2 niveles de la subunidad NF-kB RelB reclutado Ras a la mitocondria [14]. La señalización Ras resultante condujo a una inducción aberrante de Blimp1 en las células de cáncer de mama [13]. El factor de transcripción exacta (s) aguas abajo de Ras que medió la activación de Blimp1 en estas células de cáncer se mantuvo a ser identificado. Sin embargo, la participación de señalización Ras en la activación Blimp1 nos lleva a plantear la hipótesis de que la expresión de Blimp1 puede ser más generalizada en el cáncer que se creía. También se encontraron células tumorales de colon para expresar Blimp1, que reprimió el
TP53
de genes y por lo tanto el crecimiento celular mantenido [15].
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los países occidentales . Aproximadamente dos tercios de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada, y del resto de los pacientes que se someten a cirugía, 30-50% desarrollan recurrencia de la enfermedad metastásica [16], [17]. El
RAS
oncogén se muta en un máximo de ~ 30% de los cánceres de pulmón, con la mayoría de las mutaciones que se encuentra en el
KRAS
de genes [16], [17]. Oncogén K-Ras predispone ratones transgénicos a la tumorigénesis de pulmón [18]. ras señales a través de múltiples vías, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Como aceptores nucleares para cascadas de señalización de MAPK, la proteína activadora (AP) -1 familia de factores de transcripción ha sido implicada en el fenotipo altamente migratorio de las células de cáncer de pulmón [19], [20], [21].
el gen
lisil oxidasa gratis (
LOX
) se aisló como los
ras recision gratis (
RRG
) debido a su capacidad para revertir Ras mediada transformación de los fibroblastos NIH 3T3 [22]. Nuestro grupo demostró ectópico expresión Pro-LOX reducida quinasa extracelular regulada por señal (ERK) y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt señalización y la activación de NF-kB en las células NIH 3T3 transformadas con Ras [23]. La pérdida de
LOX
la expresión génica se observó en muchos tejidos cancerosos y líneas celulares derivadas incluidos los de pulmón [24], [25], [26], de colon [27], de próstata [28], gástrico [29 ] y cánceres de cabeza y cuello escamosas [30]. Ectópico
LOX
expresión génica reducida la formación de colonias de células de cáncer gástrico cultivadas y formación de tumores en un modelo de xenoinjerto [29]. Lisil oxidasa se sintetiza y se secreta como un pro-enzima (Pro-LOX), y se procesa a una enzima funcional (LOX) y propéptido amino terminal (LOX-PP) [31]. La
rrg
actividad de Pro-LOX fue asignada inesperadamente al dominio LOX-PP, como se juzga por la inhibición del fenotipo transformado de las células NIH 3T3-Ras [32]. Posteriormente, LOX-PP ha demostrado reducir el fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama de ratón impulsada por Her-2 /Neu, que señala a través de Ras y su capacidad para formar tumores en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo [33], [34]. En H1299 células de cáncer de pulmón, que contienen un mutante
NRAS
de genes, LOX-PP reduce la activación de ERK y Akt, y la capacidad de crecimiento independiente de anclaje y la formación de colonias invasiva en Matrigel [25]. LOX-PP también atenúa la activación fibronectina mediada por la quinasa de adhesión focal en células de cáncer de mama [34], [35], y el factor de crecimiento de fibroblastos proliferación de células de cáncer de próstata [36] (FGF) -2-inducida. Aquí nos preguntamos si Blimp1 se expresa en células de cáncer de pulmón dado el importante papel de la señalización Ras en estas células cancerosas. Se detectó Blimp1 en todas las líneas de cáncer de pulmón examinados y promovió la migración y la invasión. Por otra parte,
Blimp1
ARN se detectó en otros tumores primarios impulsados por la señalización de Ras. En las células de cáncer de pulmón, Blimp 1 se indujo la expresión por una vía Ras /c-Raf /AP-1, lo que podría ser inhibida por LOX-PP a través de la interacción con c-Raf. Por lo tanto, estos estudios identifican Blimp1 como un mediador crítico de células de cáncer de pulmón fenotipo migratorio por la transformación de Ras /c-Raf /AP-1 en cascada.
Materiales y Métodos
Células y condiciones de cultivo
El A549 de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y líneas celulares H1299 fueron amablemente proporcionados por Zhi-Xiong Xiao Jim (Escuela de Medicina de la Universidad de Boston, Boston, MA). El H441 líneas de células Calu-1, H23 y fueron generosamente proporcionadas por Hasmeena Kathuria y María Ramírez (Universidad de Boston Escuela de Medicina). A549, Calu-1, H23 y H441 células expresan mutante K-Ras [37], [38] y H1299 mutante express N-Ras [39]. células Bosc23 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio esencial mínimo de Dulbecco excepto H441, que se mantuvo en medio RPMI-1640. Los medios de cultivo se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS), según lo recomendado por la ATCC. Los clones que expresan H1299 ratón LOX-PP en un vector inducible por doxiciclina (DOX) se establecieron y se aislaron ARN total como se describe anteriormente [25]. Se establecieron células A549 estables inducibles que expresan V5-etiquetados humanos o de ratón LOX-PP como se describe anteriormente [33], [34]. Brevemente, PCL-Ampho embalaje retrovirus vector (Imgenex, San Diego, CA) fue co-transfectó en células BOSC 23 utilizando Fugene 6 (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN), ya sea con vacío vector efector pC4
BSRR (TO) (EV) o vector que lleva los fragmentos de ADN de humanos o de ratón LOX-PP con la etiqueta V5 C-terminal y el vector regulador PCX
neoTR2 (tanto proporcionado amablemente por Tsuyoshi Akagi, KAN, Kobe, Japón). Después de 48 h, los sobrenadantes que contienen partículas virales se recogieron y se pasaron a través de un filtro de 0,45 micras (Corning Inc., Corning, NY). células de cáncer de pulmón A549 eran doblemente infectada durante 48 h con sobrenadante de BOSC 23 células que contienen virus que llevan los vectores regulador y efectoras suplementadas con 6 g /ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO). se seleccionaron las células infectadas con 10 mg /ml de blasticidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 1,4 mg /ml de geneticina (Sigma) para generar piscinas separadas de, células estables A549-EV A549-humano LOX-PP y A549-ratón LOX-PP .
los plásmidos y análisis de transfección
el pcDNA3 /Blimp [2] y el 7-kB
Blimp1
reportero de luciferasa -pGL3 (
Blimp1
-luc ) [40] vectores fueron amablemente proporcionados por Tom Maniatis (Universidad de Columbia, Nueva York) y Kathryn Calame (Universidad de Columbia), respectivamente. El c-jun, c-Fos, se informaron como anteriormente Fra-1 y Fra-2 AP-1 en construcciones vector de expresión pCI [41]. Para la transfección transitoria de los vectores de expresión, los cultivos se incubaron en placas de 12 pocillos durante 48 h en presencia de ADN 1 mg y 3 l Fugene 6 o 2,5 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Co-transfección del vector MSV-β-gal, que expresa β-galactosidasa (β-gal) se utilizó para normalizar la eficiencia de transfección. Se realizaron todos los ensayos de reportero de transfección transitoria, por triplicado, dos veces como se describe anteriormente [42], y el error estándar de la media (SEM) calculada.
Blimp1
siRNA, y
junio
,
FRA-1