Extracto
curcumina, el componente activo de la cúrcuma, se ha demostrado que protege contra la carcinogénesis y prevenir el desarrollo de tumores. Sin embargo, poco se sabe sobre su mecanismo anti-tumoral en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). En este estudio, hemos encontrado que la curcumina puede inhibir la proliferación de células SCLC, ciclo celular, la migración, la invasión y la angiogénesis a través de la supresión de la STAT3. células de SCLC fueron tratados con curcumina (15 mmol /L) y los resultados mostraron que la curcumina fue eficaz en la inhibición de la fosforilación de STAT3 para regular a la baja de una matriz de STAT3 objetivos de abajo, lo que contribuyó a la supresión de la proliferación celular, la pérdida de la formación de colonias, la depresión de la célula la migración y la invasión. La curcumina también suprimió la expresión de proteínas de proliferación (Survivin, Bcl-X
L y Ciclina B1), y proteínas invasivas (VEGF, MMP-2, MMP-7 e ICAM-1) .Knockdown de expresión STAT3 por siRNA fue capaz para inducir efectos anti-invasivos in vitro. Por el contrario, la activación de STAT3 corriente arriba de la interleucina 6 (IL-6) conduce a la mayor
celular
proliferación,
celular
supervivencia, la angiogénesis, la invasión, la migración y el crecimiento tumoral. Nuestros resultados ilustran la importancia biológica de la IL-6 de señalización /JAK /STAT3 en la progresión SCLC y pruebas providenovel que la vía puede ser un nuevo objetivo potencial para la terapia de SCLC. Se concluyó que la curcumina es un agente potente en la inhibición de la STAT3 con actividad farmacológica favorable, y la curcumina puede tener potencial como una traslación eficaz del cáncer terapéutico o agente preventivo para el CPCP
Visto:. Yang CL, Liu YY, Ma YG, Xue YX, Liu DG, Ren Y, et al. Las células Blocks (2012) curcumina cáncer de pulmón de células pequeñas migración, invasión, la angiogénesis, el ciclo celular y la neoplasia a través Janus quinasa-STAT3 señalización vía. PLoS ONE 7 (5): e37960. doi: 10.1371 /journal.pone.0037960
Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India
Recibido: 1 de Febrero, 2012; Aceptado: April 26, 2012; Publicado: 25 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Provincial de clave Laboratorio de cáncer de esófago, Departamento de Ciencia y Tecnología de la República Popular de China (Nº [2011] 20), Departamento de Salud de Liaoning, República Popular de China (Nº 2010-079), Liaoning Liaoning Departamento de Recursos Humanos y Seguridad Social, la República Popular de China (Nº 2009-390). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) la proteína es un miembro de una familia de factores de transcripción latentes citoplasmáticas que transmiten señales desde la superficie celular al núcleo activado por citoquinas y factores de crecimiento. El enlace de los receptores de la superficie celular con ligandos, tales como interleucina-6 (IL-6) o factor de crecimiento epidérmico (EGFR), induce la fosforilación de tirosina de la proteína STAT3 por Janus quinasas de tirosina quinasa y el factor de crecimiento receptor [1]. La forma dimérica activa de STAT3 fosfo- se transloca al núcleo y regula la expresión de genes que contienen sitios de unión de STAT3-en sus promotores [2]. La activación de la proteína STAT3 es rápida y transitoria en células normales. STAT3 regula los procesos biológicos fundamentales, incluyendo la proliferación celular, la supervivencia y el desarrollo. Recientemente, la acumulación de pruebas indica que las anormalidades en la Janus quinasa (JAK) transductor /de la señal y activador de la transcripción (STAT) vía de señalización están implicadas en la oncogénesis de varios tipos de cáncer [3].
Activado STAT3 (pSTAT3 nuclear) se expresa en alrededor del 55% de los tumores de NSCLC, como se mide por análisis de inmunohistoquímica [4] - [6]. la activación de STAT3 se observa en la mayoría de las líneas celulares de cáncer [7], [8]. En contraste con NSCLC, la fuerte expresión pSTAT3 se demostró en 100% (10/10) de los tejidos tumorales de SCLC probado [9]. Sin embargo, el mecanismo por el cual dysregulated señalización STAT3 contribuye a la progresión de cáncer de pulmón de células humanas (SCLC) no ha sido dilucidado. SCLC se sabe que tiene una biología más agresiva con el rápido crecimiento y la diseminación temprana, así como una asociación común con síndromes paraneoplásicos [10]. De todos los tipos histológicos de cáncer de pulmón, SCLC es el más sensible a la quimioterapia y la radiación, pero el pronóstico sigue siendo pobre, con una mediana de supervivencia tras el tratamiento global de 10 meses y una supervivencia a 5 años del 5% [11]. pacientes con cáncer de pulmón de edad avanzada y aquellos con un estado de actividad no son tratados con quimioterapia debido a la alta toxicidad de los regímenes de múltiples fármacos. Descubrimiento de nuevos fármacos con efectos secundarios menos graves es de gran necesidad. En el tratamiento clínico de pacientes con cáncer, muchos medicamentos recetados se derivan de especies de plantas naturales [12].
La curcumina se deriva de la cúrcuma (
Curcuma longa
) y es un polifenol natural. La curcumina se ha utilizado como un alimento, un agente colorante, y la medicina tradicional. Es seguro y no tóxico y tiene antitumoral demostrable, antiinflamatorio, apoptosis, y las propiedades antioxidantes [13]. Sobre todo por su propiedad anticancerígena, todavía ha sido objeto de un gran interés. aumento de la evidencia indica que la curcumina tiene efectos anticancerígenos frente a diferentes tipos de células tumorales humanas, incluyendo las células de cáncer de ovario, células de cáncer de colon y células astroglioma [14], [15]. Este contra el cáncer efectos de la curcumina se identificaron a través de interferir con el ciclo celular, inducción de apoptosis, e inhibiendo el potencial invasivo de cánceres. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de estos efectos contra el cáncer están todavía bajo investigación, especialmente por su potencial anti-invasivo en SCLC cancer.We han demostrado previamente que la curcumina inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis SCLC células SCLC [16]. En el presente estudio, hemos investigado los mecanismos moleculares por los que la curcumina suprimen la migración y la invasión en las células de SCLC. Nuestro objetivo fue determinar el papel de la señalización JAK /STAT en la progresión del SCLC y poner a prueba la hipótesis de que la curcumina podría servir como dianas terapéuticas.
Resultados
Nuestro objetivo en este estudio fue determinar si la curcumina modula el crecimiento de líneas celulares de SCLC y, de ser así, para delinear varios mecanismos por los cuales se puede mediar sus efectos. Examinamos los efectos de la curcumina en las células la activación de JAK, la activación de STAT3 y productos de los genes regulados STAT3 y el crecimiento celular en SCLC (NCI-H446 y NCI-1688). En un estudio anterior, hemos identificado un nivel de expresión de p-STAT3 superior en líneas de células NCI-H446 en comparación con otras líneas celulares de SCLC humanas. Se seleccionaron las células NCI-H446 para este estudio.
IL-6 induce la proliferación de las células de SCLC humanas, y la curcumina o si STAT3 inhibe. La curcumina o siSTAT3 inhibe la proliferación de NCI-H446 y células NCI-1688. Para investigar el papel de STAT3 en el funcionamiento de las células de SCLC, la activación de STAT3 y la inhibición se indujeron con IL-6 y con siSTAT3 o curcumina, respectivamente. Después de la transfección con STAT3 siRNA (siSTAT3) o ARNsi de control (control negativo comercialmente), la expresión de STAT3 se evaluó mediante Western blot y RT-PCR. Se encontró que siSTAT3 downregulated significativamente la proteína y los niveles de ARNm de STAT3, en comparación con siSTAT3 control (Fig. 1).
Las células fueron transfectadas con ARNsi de control o STAT3 siRNA (si STAT3). Después de la transfección, la expresión de la proteína STAT3 (A) y el ARNm (B) se evaluó mediante Western blot y RT-PCR y se compara con las células NCI-H446 y NCI-H1688 no transfectadas. Las columnas "células NCI-H446 y NCI-H1688" corresponden a las células no tratadas, respectivamente. Las columnas "siSTAT3" corresponden a la transfectadas con columnas STAT3 siRNA.The "control" corresponden a la transfectadas con ARNsi de control. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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. & Lt; 0,05, en comparación con las células control
Para reconfirmar los informes anteriores [17], [18] que la IL-6 induce la proliferación de células cancerosas, nos suero Starved NCI-H446 y células NCI-1688 para 12 h y luego cultivadas en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de IL-6 por 24 h, 48 h y 72 h. IL-6 inducida por la proliferación de NCI-H446 y NCI-1688 de una manera dependiente de la dosis. De acuerdo con los resultados de nuestro experimento preliminar, a 25 ng /concentraciones ml de IL-6 promovido significativamente la proliferación celular, en comparación con 12,5 concentraciones ng /ml, mientras que no hubo diferencia significativa entre 25 ng /ml y 50 ng concentraciones /ml (Fig . 2). La máxima concentración inhibitoria media (IC
50) el valor de la curcumina fue de 15 micras de células de SCLC de nuestro trabajo publicado anterior [16]. Por lo tanto, a 25 ng /ml concentración de IL-6 y 15 M curcumina concentración se utilizaron en el siguiente experimento. SiSTAT3 solo o 15 curcumina M tuvo efecto significativo sobre la proliferación celular, en comparación con células de control (Fig. 3). No se observaron diferencias significativas entre todos los puntos de tiempo examinados, lo que indica un aumento lineal en la proliferación con el aumento de los tiempos de exposición a la IL-6 (todos los
p Hotel & lt; 0,05)
Las células fueron tratadas con IL. 6 (12,5, 25 o 50 ng /ml) durante 24, 48, o 72 h, y la vitalidad celular se estimó usando el ensayo de Brdu. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p Hotel & lt; 0,01, en comparación con las células no tratadas con IL-6
Las células fueron tratadas con curcumina (15 m. ) para 24, 48, o 72 h, y la vitalidad celular se estimó usando el ensayo de Brdu. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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& lt; 0,01, en comparación con las células no tratadas.
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p Hotel & lt; 0,05 o
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. & Lt; 0,01, en comparación con el control de las células transfectadas con siRNA
La curcumina inhibe la migración de células de SCLC y la invasión. Las inhibiciones de NCI-H446 y NCI-1688 migración celular por la curcumina se examinaron mediante el uso de ensayos de curación de heridas y modelos de migración transwell y los resultados se muestran en la Fig. 4 y Fig. 5A. La curcumina (15 mmol /L) fue capaz de inhibir significativamente NCI-H446 y NCI-1688 SCLC la migración de células, y este efecto fue consistente en tanto la migración transwell modelos de cicatrización de heridas y. Además, los ensayos de curación de heridas y transwell ensayos de modelo de migración indicaron que siSTAT3 fue capaz de inhibir células migration.IL-6 fue capaz de promover la migración celular y la invasión. El ensayo transwell basado en Matrigel indicó que la curcumina o siSTAT3was capaz de inhibir significativamente la invasión de células (Fig. 5B). Estos resultados sugieren claramente que la curcumina exhibe efectos anti-migración y anti-invasión contra las células de SCLC
.
fueron marcados monocapas confluentes de células, y la reparación se controló microscópicamente después de 24 h de tratamiento con curcumina 15 M o IL-6 25 ng /ml. Las fotografías representativas mostraron la misma área en el tiempo cero y después de 24 h de incubación con o sin la curcumina. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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. & Lt; 0,01, en comparación con las células control
Después de 8 h de incubación con o sin la concentración indicada de la curcumina, se fijaron las células que migran a la cámara inferior, se tiñeron y se contaron mediante microscopía de luz o un sistema de cribado de alto contenido basado en la microscopía flurescent, como se describe en Materiales y Métodos. campos al azar fueron escaneadas (cuatro campos por filtro del pozo) para la presencia de células en el lado inferior de la membrana. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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& lt; 0,05 en comparación con células tratadas con IL-6 (25 ng /ml). B, se determinó el efecto del tratamiento con la curcumina en la invasión de células usando el sistema de ensayo de invasión de Matrigel. células NCI-H446 en medio libre de suero con o sin la curcumina se sembraron en la cámara superior del sistema. El fondo del pozo se llenó con medio completo. Después de 16 h de incubación, las células que habían invadido la membrana de Matrigel a través se tiñeron con solución de Giemsa al 20% y se contaron bajo un microscopio óptico (ampliación, × 200). Los experimentos se realizaron tres veces por triplicado. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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. & Lt; 0,05 en comparación con células tratadas con IL-6 (25 ng /ml)
Importancia de la /vía de IL-6 JAK /STAT3 en el crecimiento independiente de anclaje. El crecimiento independiente de anclaje de las células de SCLC se determinó en un ensayo de agar blando [19]. células NCI-H446 fueron capaces de construir grandes agregados en el agar blando durante el período de observación de 15 días. En contraste, no hubo proliferación en presencia de siSTAT3 o curcumina, lo que sugiere una contribución para esta vía en este proceso. Había una completa promover por la IL-6, lo que sugiere la importancia de esta vía en el crecimiento independiente de anclaje (Fig. 6). En la primera semana, las células parecían bastante similares bajo el microscopio excepto por el hecho de que los inhibidos no proliferaron. Sin embargo, después de las células 7-14 días inhibidas con curcumina comenzó a cambiar su morfología.
La formación de colonias de las células NCI-H446 y las sublíneas estables indicados en agar blando. Las células se observaron utilizando un microscopio invertido (× 400) en agar blando durante 15 días. Las columnas "de control" corresponden a la transfectadas con siRNA control.
La curcumina provoca G
2 /M fase de la detención del ciclo celular en las células NCI-H446. Para determinar si la curcumina inhibe la progresión del ciclo celular de las células NCI-H446, las células fueron cultivadas a 70% de confluencia y la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo después de una exposición de 12 y 24 h para la curcumina (15 M). Se observó que el porcentaje de células en G
fase 2 /M con el tratamiento de cúrcuma era 52,2% después de 12 h de incubación y se redujo hasta el 21,2% después de 24 h. El porcentaje de células en el sub-G
0 /G
1 fase fue del 3,5% y el 37,1% después de 12 y 24 h de incubación, respectivamente. En las células de control el porcentaje de células en G
2 /M y Sub-G
0 /G
1 fase fue de 21,7% y 1,1%, respectivamente (Tabla 1).
Para determinar el posible mecanismo por el cual influye en la curcumina G
distribución de fase 2 /M en células NCI-H446, la expresión de la ciclina B1 se evaluó mediante RT-PCR y Western blot. En comparación con las células de control, la curcumina downregulated significativamente el ARNm y los niveles de proteína de la ciclina B1, que se relaciona con G
progresión de la fase 2 /M (Fig. 7). El siSTAT3 tuvo efecto significativo sobre los niveles de expresión de ciclina B1. En comparación con las células de control, la IL-6 upregulated significativamente la proteína y los niveles de mRNA de la ciclina B1. Tomados en conjunto, los resultados anteriores de manifiesto que la curcumina inhibe la proliferación de células de cáncer de SCLC y lo bloquea en G
2 fases a través de la supresión de la expresión de ciclina B1.
células NCI-H446 fueron tratados con IL-6 ( 25 ng /ml) o la curcumina (15 M) durante 24 h. Los niveles de expresión de estos componentes se estimaron utilizando RT-PCR (A) y Western blot (B). Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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curcumina inhibe la IL-6 de la fosforilación de STAT3 inducible de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. Para examinar si la curcumina que fue diseñado para atacar selectivamente STAT3 mostraría efecto inhibitorio similar en la fosforilación de STAT3, las células NCI-H446 se cultivaron en medio libre de suero durante la noche y a continuación se trataron previamente con diferentes concentraciones de la curcumina para 1 hora o 15 M curcumina para diferente tiempo. Después del tratamiento, la proteína total fue extraído y STAT3 fosforilado y STAT3 totales se analizaron por Western blot. Como se muestra en la Figura 8, la curcumina inhibe la fosforilación de STAT3 en la tirosina 705 de una manera dependiente y el tiempo de la dosis. STAT3 total no se vio afectada por el tratamiento de curcumina
A:. Para estudiar el efecto dependiente de la dosis de los NCI-H446cells fueron tratados con diferentes concentraciones de curcumina durante 1 h. B: Para estudiar el efecto dependiente del tiempo, las células se trataron con la curcumina (15 M) para 30, 60 y 120 min. C: Para estudiar el efecto de la curcumina sobre la IL-6 inducida por p-STAT-3, las células fueron asdescribed cultivadas anteriormente, excepto que las células fueron pretratadas con IL-6 (25 ng /ml) durante 1 h antes del tratamiento con la curcumina (15 M) durante 1 h. Las células se retiraron en los tiempos indicados y se lisaron para preparar el extracto de células enteras. Las células se recogieron y 20 g de proteína a partir del extracto de células enteras se cargó en cada carril. GAPDH se utilizó como control de carga. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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Dado que las señales inducidas por IL-6 están mediados por la fosforilación de STAT3, es lógico entonces investigar el efecto de la IL-6 y la curcumina sobre la fosforilación de STAT3 en células de SCLC. Aunque las células de SCLC expresan altos niveles de Tyr705p-STAT3 (Fig. 8A y B). La Figura 8C muestra que la fosforilación de STAT3 inducida por IL-6 en las células de SCLC se redujo en el tratamiento de cúrcuma. La exposición de las células a la curcumina para 1 h marcadamente suprimida la fosforilación de STAT3 inducida por IL-6 en las células NCI-H446.
curcumina inhibe la fosforilación JAK en células de SCLC. La fosforilación de STAT depende de la activación de JAK. Los miembros de la familia JAK de tirosina quinasas de proteínas fosforilan fosforilan y activan proteínas STAT citoplásmicos. JAK-2 es un activador reconocido de STAT3 [20]. Hemos investigado si los efectos inhibidores de la curcumina sobre la activación de STAT se debieron a la supresión de la expresión JAK en SCLC cells.Curcumin inhibidas p-JAK-1, p-JAK-2 y P-JAK-3 expresión en células NCI-H446 (Fig. 9). Expresión del total JAK-1, JAK-2 y JAK-3 no fue alterada por el tratamiento de cúrcuma.
células NCI-H446 se trataron con concentración dfferent de la curcumina para 30 proteínas min.These se analizaron por transferencia de Western. Igual cantidad de proteína celular total (20 g) se resolvieron en un 10% -15% de SDS-PAGE. GAPDH se utilizó como control de carga. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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niveles de curcumina inhibió de MMP-2, MMP-7, VEGF, survivina, Bcl-X
L y ICAM-1 en las células de SCLC. Los niveles de migración, invasión y la angiogénesis asociada proteínas en células NCI-H446 después del tratamiento con curcumina se determinaron y se cuantificaron por Western Blot. Los resultados se muestran en Figura10 indican que los niveles de MMP-2, MMP-7, VEGF y survivina (Fig 10A). BCL-X
L e ICAM-1 (Fig. 10B) fueron inferiores a los del grupo de control correspondiente. Estas proteínas juegan un papel importante de la migración celular, la invasión y la angiogénesis. Estos efectos pueden haber dado lugar a la inhibición de la migración, la invasión y la angiogénesis a partir de células NCI-H446 después de la exposición a la curcumina a 15 mM.
células NCI-H446 fueron tratados con 15 mM curcumina para 24 h. Estas proteínas se analizaron por transferencia de Western. Igual cantidad de proteína celular total (20 g) se resolvieron en un 10% -15% de SDS-PAGE. GAPDH se utilizó como control de carga. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
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Discusión
SCLC representa un alto grado de malignidad y forma particularmente agresiva de cáncer, con principios y generalizada metastasesand un mal pronóstico. Hasta la fecha, no hay delinear los efectos de la curcumina en las proteínas que regulan STAT3 señalización en SCLC datos. Varios estudios que emplean enfoques genéticos y farmacológicos para modular la señal de transductor constitutiva y activador de la transcripción 3 (STAT3) la actividad han fundamentado el papel fundamental de la actividad STAT3 aberrante en la transformación maligna y progresión del tumor, y por lo tanto apoyar STAT3 como un objetivo novedoso medicamento contra el cáncer [21] .
curcumina (diferuloylmethane), un agente anti-inflamatorio se usa en la medicina tradicional, se ha demostrado para suprimir la transformación celular, la proliferación, la invasión, la angiogénesis y la metástasis a través de un mecanismo no se entiende completamente. Debido a que varios genes que median estos procesos están regulados por el transductor de señales y activador de la transcripción, hemos postulado que la curcumina media su actividad mediante la modulación de la activación de STAT3. En este estudio, se investigó el mecanismo por el que la curcumina manifiesta su efecto sobre STAT3 y la expresión génica aguas abajo STAT3-regulado. Hemos demostrado que la curcumina el regulado la expresión de productos del gen STAT3 reguladas implicados en el ciclo celular (ciclina B1), la supervivencia (Bcl-X
L, survivina), la angiogénesis (factor de crecimiento endotelial vascular) y la metástasis (matriz metalloproteinase- 2, la matriz metaloproteinasa-7 y molécula de adhesión intercelular-1). Tradicionalmente, el ciclo celular es segregada en cuatro fases: la replicación del ADN se produce durante la fase S, y la segregación de cromosomas ocurre durante la fase M. Las fases S y M están separadas por los llamados fases gap, G
1 (antes de la replicación del ADN) y G
2 (antes de la mitosis). Nuestro estudio demostró que la curcumina inhibe la proliferación de células del NCI-H446 mediante la inducción de la detención G
2 /M del ciclo celular que conduce a la muerte celular por apoptosis. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la distribución de las células en el
0 /G
1 y S fases G. En este estudio, la proteína y los niveles de mRNA de la ciclina B1 se downregulated significativamente cuando las células se trataron con la curcumina durante 24 h. Ciclina B1, que se sobreexpresa en una variedad de tumores, está regulada por STAT3 y se requiere para que las células avanzan desde el G
2 de fase a la fase M del ciclo celular [22], [23]. Este hallazgo demuestra por primera vez que la curcumina tiene un efecto de detención en la progresión del ciclo celular que implica la G
2 /M fase en las células de SCLC. También podría explicar los efectos antiproliferativos de la curcumina. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que la curcumina puede inducir la apoptosis de células SCLC. Además de la activación constitutiva de STAT3, hemos sido capaces de demostrar que la estimulación de las células de SCLC con IL-6 aumentó la fosforilación de STAT3 en los resultados de SCLC cells.Our reforzar el potencial de la curcumina como un fármaco de múltiples objetivos en la terapia contra el cáncer.
Nuestra conclusión de que la curcumina inhibe la invasión de células SCLC través de la baja regulación de la expresión de productos de genes regulados STAT3 involucrados en la invasión de células (por ejemplo, la MMP-2 y MMP-7). La baja regulación de VEGF como se muestra aquí podría explicar las actividades antimetastásicas de la curcumina [24]. ICAM-1 se ha implicado en procesos cancerígenos, y su sobreexpresión por células malignas se ha demostrado para mejorar la invasión celular, inducir la angiogénesis, regular las defensas celulares antiapoptóticas, y aumentar la resistencia inmunológica a través de la producción de la prostaglandina E2 [25]. MMP-2 y MMP-9 desempeña un papel crucial en la invasión tumoral y la angiogénesis por la mediación de la degradación de la matriz extracelular, y la inhibición de la actividad de MMP se ha demostrado que suprime la metástasis del cáncer de pulmón [26].
Para investigar la mecanismo de STAT3 efectos inhibidores de curcumina inducida en células de SCLC, que analiza las proteínas aguas arriba de STAT3. Las funciones de JAK han sido implicados en la activación de STAT3. Como se muestra en la Figura 8C y 9B, la fosforilación de JAK-1, JAK-2 y JAK-3 fueron suprimidas mediante tratamiento con curcumina en células de SCLC. Es probable que la inhibición de la Tyr705 STAT3 se debe a la inhibición de JAK porque la inhibición de la fosforilación de JAK ocurrió dentro de 30 min después del tratamiento, mientras que la fosforilación de STAT3 se inhibió dentro de 1 hora después del tratamiento. Esto sugiere que la curcumina podría manifestar su efecto sobre la activación de STAT3 a través de la inhibición de JAK. En un estudio anterior, nuestro laboratorio encontró que la curcumina inhibe selectivamente la fosforilación de la tirosina de STAT3, pero no afecta la fosforilación de serina de STAT3 en células de SCLC. Estos resultados están de acuerdo con estudios realizados por Saydmohammed et al [27]. Ellos encontraron que la curcumina no inhibir la fosforilación de STAT3 en Ser727 en las células de cáncer de endometrio y ovario. Tras la IL-6 de la estimulación, STAT3 se fosforila rápidamente en Tyr705 y transloca al núcleo. Nuestros resultados indican además que la IL-6 mediada por la fosforilación de STAT3 Tyr705 es principalmente un evento nuclear.
En muchos tumores y las células cancerosas, la activación constitutiva de STAT3 es IL-6 dependiente, ya sea a través de señalización autocrina o paracrina, que parece a ser ampliamente expresado en líneas celulares de cáncer [28]. En algunos casos, la activación de la vía STAT3 se correlaciona con paso ligero intratumoral células infiltración inflamatoria, lo que significa que la activación de STAT3 puede ser a través de mecanismos paracrinos [29]. En cuanto a este caso, la inhibición de STAT3 causó disminución de la producción de la activación de IL-6.El de la vía de STAT3 se ha estudiado en muestras de tejido tumoral de los pacientes. Los niveles de expresión de P-STAT3 correlacionados con la tasa de supervivencia y la gravedad de cordoma [30]. Estudios recientes también han relacionado la activación de la vía STAT3 a mayor grado histológico y estadio avanzado en varios tipos de cáncer [31]. Estos resultados sugieren que STAT3 no sólo puede servir como un marcador predictivo de la resistencia a los medicamentos, sino también como un marcador pronóstico de los tumores [32].
En resumen, antes de este informe, no había información sobre la situación de JAK /STAT3 señalización de proteínas en células de SCLC y su regulación por la curcumina. Este estudio es el primero que ha examinado en detalle la curcumina contra el cáncer función mecánica de la señalización /STAT3 JAK en SCLC tumorigénesis y progresión. La importancia de este estudio es que hemos identificado una perturbación en una plétora de JAK /STAT proteínas de señalización en células de cáncer. Por lo tanto, STAT3 desempeña un papel importante en la oncogénesis SCLC y podría ser una posible diana terapéutica para el tratamiento del SCLC.
Materiales y Métodos
Productos químicos y anticuerpos
La curcumina (1,7 bis [4-hy-droxy-3-metoxifenil] -1,6-heptadieno-3,5-diona) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), disuelto en DMSO a una concentración madre de 10 mM , y se diluyó a la concentración indicada con medio RPMI 1640. Los anticuerpos de la survivina, Bcl-X
L, ciclina B1, P-JAK1, JAK1, P-JAK2, JAK2, P-JAK3, JAK3, Tyr
705-pSTAT3 y STAT3 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología ( Beverly, MA). Los anticuerpos para VEGF, ICAM-1, MMP-2, MMP-7, y GAPDH se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). siSTAT3 y Lipofectamine 2000 se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich.
Cell Culture
NCI-H446 y NCI-1688 (SCLC) las líneas celulares humanas de nuestro anterior trabajo publicado [15] se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero HyClone bovino fetal (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.) en una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C.Cells fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos de cultivo y cosechado en una solución de tripsina-EDTA en la fase de crecimiento logarítmico.
plásmidos y siRNAs
se describieron los plásmidos pcDNA6.2-STAT3 y vectores de control (un mutante dominante negativo de STAT3) anteriormente [33]. secuencias de siRNA dirigidos STAT3α fueron los siguientes: F, 5'-TGCTGAATGCAGGCAATCTGTTGCCGGTTTTGG CCACTGACTGACCGGCAACATTGCCTGCATT-3 'y R', 5'-CCTGAATGCAGG CAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCAACAGATTGCCTGCATTC-3 '. Control negativo: F, 5'-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTG GCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 'y R', 5'-3-CCTGAAATGTA CTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTC
La transfección transitoria y estable
La transfección de plásmidos y siRNAs en el cáncer de pulmón de células pequeñas. las células se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para la transfección transitoria, las células fueron transfectadas con siRNA o plásmidos en diferentes dosis, como se indica durante 48 horas antes de los ensayos funcionales se realizaron. líneas celulares de manera estable transfeted se aislaron a partir de células de SCLC transfectadas con pcDNA6.2-STAT3 plásmido a través de la selección con blasticidina (Invitrogen, 5 mg /ml).
Ensayo de proliferación celular
proliferación de las células de SCLC era determinada mediante el análisis de 5'-bromo-2'-desoxiuridina incorporación (BrdU) en el ADN recién sintetizado usando una enzima proliferación de células ensayo inmunoenzimático (ELISA de proliferación celular (BrdU), Roche, Mannhein, Alemania). Para el ensayo de incorporación de BrdU, las células se contaron y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (2 × 10
3 células /pocillo). BrdU (10 l /pocillo) de las células de SCLC se añadió fueron fijadas y teñidas después de 4 h de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis colorimétrico se realizó con un lector de placas de ELISA (DTX880; Beckman, Miami, FL) a 450 nm
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
Tras el tratamiento con curcumina durante 24 h, las células de SCLC. se recogieron y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) y se fijaron en 75% de etanol durante 2 horas a 4 ° C. Las células fijadas se lavaron dos veces con 500 ml de PBS frío. Después, las células se tiñeron con 500 ml de solución de yoduro (PI) tinción de propidio (50 mg /PI ml, 0,1% de Triton X-100, 200 mg /RNasa libre de DNasa ml en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Diez mil eventos por muestra fueron adquiridas mediante un flujo FACS-scan citómetro (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), y el porcentaje de células en G
0 /G
1, S, G
2 /M y Sub-G
2 /M fases del ciclo celular se determinaron utilizando el software CELLQuest (Becton-Dickinson).
el ensayo de cicatrización de heridas
las células de SCLC se cultivaron en placas de 24 pocillos y se cultivaron en medio que contiene 10% de FBS a monocapa de células casi confluentes, entonces cuidadosamente rayado usando una punta de pipeta de plástico para dibujar una "herida" lineal en la monocapa de células de cada pocillo. La monocapa se lavó dos veces con PBS para eliminar los desechos o las células desprendidas de la monocapa, y a continuación, la curcumina fue añadido por 15 M; IL-6 fue añadido por 25 ng /ml; El pocillo de control se añadió con 0,1% de DMSO como control de disolvente. Los cultivos se incubaron a 37 ° C y photographedimmediately y monitoreados por lapso de tiempo en el sistema de Bio-estación de Carl Zeiss Axiovert. Bajo el microscopio, el número de células que migraron a la zona libre de células, se evaluó la base de la línea de la "herida" lineal. Los experimentos se realizaron tres veces por triplicado y se contaron doble ciego por al menos dos investigators.To investigar la motilidad celular, se prepararon y heridas como se describe anteriormente.El monocapas heridos se incubaron a 37 ° C en medio RPMI-1640 que contiene 10 monocapas de células de SCLC