Extracto
Para desarrollar marcadores sero-diagnóstico para el cáncer de pulmón, se generaron anticuerpos monoclonales utilizando el adenocarcinoma pulmonar (AD) células A549 -derivado como antígenos mediante el empleo del método de inmunización al azar. Los sobrenadantes de hibridoma se rastrearon mediante inmunohistoquímica para detectar anticuerpos con Amex-fijos y preparaciones de células A549 incluidos en parafina. Los clones positivos se monocloned dos veces a través de diluciones limitantes. De los anticuerpos monoclonales obtenidos, se seleccionó un anticuerpo designado como KU-Lu-5, que mostró una intensa tinción de la membrana de las células A549. Sobre la base de la inmunoprecipitación y el análisis Madli TOF /TOF-MS, este anticuerpo fue reconocido como XII de la anhidrasa carbónica (CAXII). Para evaluar la utilidad de este anticuerpo como un marcador serológico de diagnóstico para el cáncer de pulmón, se realizó el análisis de transferencia de puntos con un conjunto de entrenamiento que consiste en los sueros de 70 pacientes de cáncer de pulmón y 30 controles sanos. Los niveles de expresión CAXII fueron significativamente mayores en los pacientes con cáncer de pulmón que en los controles sanos en el conjunto de entrenamiento (P & lt; 0,0001), y el área bajo la curva ROC fue de 0,794, con un 70,0% de especificidad y sensibilidad del 82,9%. En los cánceres de pulmón, los niveles de expresión de CAXII fueron significativamente mayores en los pacientes con carcinoma de células escamosas (SCC) que con AD (P = 0,035). Además, CAXII fue significativamente mayor en los CE bienestar y moderadamente diferenciados que en los pobremente diferenciados (P = 0,027). Para confirmar aún más la utilidad de los niveles de CAXII suero como un marcador serológico de diagnóstico, un conjunto adicional que consiste en los sueros de 26 pacientes de cáncer de pulmón y 30 controles sanos también se investigó por análisis de transferencia puntual como un estudio de validación. Los niveles séricos de CAXII también fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer de pulmón que en los controles sanos en el conjunto de validación (P = 0,030). Por lo tanto, los niveles séricos CAXII deben ser marcadores aplicables discriminar pacientes con cáncer de pulmón de los controles sanos. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que proporciona evidencia de que CAXII puede ser un nuevo marcador serológico de diagnóstico para el cáncer de pulmón
Visto:. Kobayashi M, Matsumoto T, Ryuge S, K Yanagita, Nagashio R, Y Kawakami , et al. (2012) CAXII es un marcador Sero-diagnóstico para el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (3): e33952. doi: 10.1371 /journal.pone.0033952
Editor: Vladimir Brusic, Instituto de Cáncer Dana-Farber, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Septiembre, 2011; Aceptado: 20 Febrero 2012; Publicado: 16 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Kobayashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una subvención-en-ayudas a Consejo de Investigación Científica (23590414) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, subvenciones del tercer período de Investigación de control Integral para el cáncer llevado a cabo por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón , así como del proyecto de investigación (Nº 2011-1006) de la Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Kitasato. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer. , que comprende el 13% (1,6 millones) del total de casos de cáncer y el 18% (1,4 millones) de las muertes por cáncer en el mundo en 2008 [1], [2].
los marcadores tumorales se han detectado en el suero , orina y tejidos de los pacientes con tumores malignos, y puede ser utilizado para un diagnóstico exacto, la discriminación de los tumores benignos o malignos, el seguimiento después de las terapias, y la predicción de la evolución del paciente. En la actualidad, algunos marcadores sero-diagnóstico se utilizan para el cáncer de pulmón, tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno sialil Lewis X (SLX) para el adenocarcinoma (AD), y el fragmento citoqueratina 19 (CYFRA) y el antígeno de carcinoma de células escamosas (el CE) para el carcinoma de células escamosas (SCC) [3]. Las tasas positivas de CEA, SLX, CYFRA, y un CE se informa, 57, 40~50, 50~60, y 60~80%, respectivamente. Sin embargo, se ha informado de que estos marcadores no muestran suficientes características específicas del tumor o de órganos; por ejemplo, SLX puede dar resultados falsos positivos en la presencia de tuberculosis pulmonar y fibrosis pulmonar, y CYFRA puede elevar con neumonía intersticial e insuficiencia renal.
Los anticuerpos se desarrollan normalmente utilizando proteínas purificadas o péptidos sintéticos. Hemos generado de forma exhaustiva anticuerpos monoclonales (MoAbs) contra diversas proteínas asociadas al tumor utilizando la celda A549 derivados de AD pulmonar como un antígeno con el método de inmunización al azar [4], y se han obtenido más de 1.000 MoAb [5]. Se espera que este método para generar anticuerpos contra las proteínas con modificaciones post-traduccionales específicas de tumor, que son difíciles de obtener por métodos de inmunización convencionales.
carbónico anhidrasa XII es una metaloenzima transmembrana zinc que cataliza la hidratación reversible del dióxido de carbono para formar bicarbonato (H
2O + CO
2⇔H
++ HCO
3
-), y es miembro de la familia de la anhidrasa carbónica alfa (CA). CAXII se ha propuesto para estar involucrado en la acidificación del microambiente extracelular, que es adecuado para el crecimiento rápido del tumor. CAXII sobreexpresión se detectó inicialmente en el carcinoma de células renales, y los estudios posteriores confirmaron su expresión en diversos cánceres humanos, tales como astrocitoma difuso, de mama, de páncreas y el carcinoma de ovario, así como en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [6] - [11]. Su expresión fue influenciado tanto por factores relacionados con la diferenciación y la hipoxia en el cáncer de mama
in vivo
, y se asocia con un pronóstico más favorable en pacientes con carcinoma de mama invasivo [12]. CAXII expresión más alta también se correlaciona con una mejor supervivencia global y específica de la enfermedad en pacientes con CPCNP resecable [13]. Sin embargo, ningún estudio ha aclarado CAXII en el suero y su utilidad clínica como un marcador serológico de diagnóstico para los pacientes con tumores malignos.
En este estudio, la especificidad del anticuerpo anti-CAXII obtenido fue confirmada por inmunohistoquímica (IHC ) y inmunotransferencia con líneas celulares de cáncer de pulmón y los tejidos de cáncer de pulmón. Para confirmar aún más su utilidad como un marcador serológico de diagnóstico, los niveles de CAXII en sueros de pacientes con cáncer de pulmón se estudiaron mediante análisis de transferencia de puntos.
Materiales y Métodos
1. Las líneas celulares
El A549 y células LC-2 /ad derivado de AD de pulmón fueron adquiridos de la Investigación del Cáncer del Banco de Recursos japonesa (Tokio, Japón) y RIKEN de bio Center (Ibaraki, Japón), respectivamente. Las células RERF-LC-AI derivados de pulmón SCC se adquirió en el Centro RIKEN de bio. Las células N231 derivados de SCLC se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). LCN1, una línea CNECG (CNECG), se estableció en nuestro laboratorio [14]. Estas células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Sigma, Steinheim, Alemania) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; BioWest, Miami, FL, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina ( GIBCO, Auckland, Nueva Zelanda). Después de la recolección y lavado dos veces con solución salina tamponada con fosfato sin iones divalentes (PBS), las células sub-confluentes se almacenaron a -80 ° C para el análisis de proteómica o fijaron en 10% de formalina y embebidos en parafina para inmunohistoquímica. Las células A549 se fijan también Amex-[15] para la detección inmunohistoquímica. Las células SP2 /O-Ag14 derivados de un mieloma de ratón se adquirieron de la de bio Center RIKEN, y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 1 × 8-azaguanina (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% de FBS, penicilina y estreptomicina.
2. Ética declaración
Todas las muestras se recogieron de acuerdo con las normas éticas y el consentimiento escrito mandato, y este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kitasato. Todos los pacientes y controles sanos fueron abordados en base a las directrices éticas aprobados, y los que aceptaron participar en este estudio fueron obligados a firmar los formularios de consentimiento. Los pacientes podían rechazar la entrada y dejar de participar en cualquier momento. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento por escrito.
2.1. Sera
Los sueros de 70 pacientes con cáncer de pulmón. (AD: 29, SCC: 21, CEP: 17, y CNECG: 3) y 30 controles sanos fueron utilizados en el conjunto de entrenamiento. Además, la validación del conjunto formado por los sueros de 26 pacientes con cáncer de pulmón (AD: 20, SCLC: 5, y CNECG: 1) y 30 controles sanos también se estudió. Las características clínico-patológicas de los datos de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
Los sueros de paciente se recogieron en el Hospital de la Universidad de Kitasato, y los sueros de controles sanos fueron proporcionados por Kyowa Medex Co., Ltd. (Tokio, Japón) y se mantiene a -80 ° C hasta su uso.
3. Generación de anticuerpos monoclonales
lisado de células A549 se preparó con PBS (-) usando un homogeneizador ultrasónico (UH-50; SMT Company, Tokio, Japón). ratones BALB /c hembra de cinco semanas de edad se inmunizaron intraperitonealmente con 50 mg humedales peso de lisado de células A549 en 500 l de PBS (-) 3 veces con un intervalo de dos semanas. El título de anticuerpos se ensayó por IHC usando 100 veces suero diluido de los ratones inmunizados como primer anticuerpo en las células A549 fijos-Amex. Tres días antes de la fusión celular, el animal con el título más elevado era intraperitoneal impulsado por la misma cantidad de lisado de células A549. preparación de hibridomas y la detección de IHC con células A549 fijos-Amex fueron descritas anteriormente [4], [5].
4. análisis de proteómica
4.1. dodecil de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Las proteínas se extrajeron de cada uno de A549, LC-2 /ad, RERF-LC-AI, N231, y LCN1 células con tampón de lisis de detergente [16 ] usando un homogeneizador ultra-sónico. Diez mg cada una de las proteínas extraídas fueron hervidos y separados por SDS-PAGE con gel de poliacrilamida al 10% a una corriente constante de 20 mA. Después de SDS-PAGE, las proteínas en los geles se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.) para inmunotransferencia.
4,2. Inmunotransferencia.
secantes membranas se bloquearon con 0,5% de caseína de la leche bovina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se hicieron reaccionar con sobrenadante de hibridoma no diluido durante 1 hora a RT, seguido de incubación con 1.000 veces de rábano picante diluido conjugado con peroxidasa de conejo anti-ratón IgG anticuerpo policlonal (Dako, Glostrup, Dinamarca) con 0,025% de caseína de 45 min a TA. Por último, las señales fueron desarrollados usando el reactivo Immobilon occidental HRP (Millipore Corp.).
4.3. Determinación del isotipo de anticuerpo.
Para determinar el isotipo del-5 KU-Lu anticuerpo establecido, se utilizó el Kit ™ Isostrip anticuerpo monoclonal de ratón Isotyping (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4.4. La inmunoprecipitación
.
El método de inmunoprecipitación utilizado en este estudio se describió anteriormente [17]. En resumen, las células A549 se lavaron con PBS (-) y se trataron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contiene completa-mini libre de EDTA (Roche Diagnostics) en hielo durante 30 min. Después de centrifugación a 15.000 rpm durante 30 min a 4 ° C, se recogió el sobrenadante y precleared con sefarosa de proteína G (50% suspensión) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. Para conjugar el anticuerpo primario, 250 l de anticuerpo primario (KU-Lu-5 hibridoma sobrenadante) y 20 l de proteína G perlas de sefarosa en suspensión en tampón RIPA se incubaron con la mezcla a 4 ° C durante la noche. Después de la centrifugación, el conjugado anticuerpo-Sepharose y 500 g de proteína celular total a partir del sobrenadante precleared se incubaron con la mezcla a 4 ° C durante 4 horas. Los inmunoprecipitados se recogieron por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Después de lavar cuatro veces con tampón RIPA, el sobrenadante fue cuidadosamente eliminado y los pellets se resuspendieron en 15 l de 1 x tampón de Laemmili. A continuación, 15 l de muestras se hirvieron y se separaron por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida con 10%. Después de SDS-PAGE, los geles se Zn-tiñó con el kit Gel Negativo manchas MS (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4,5. La identificación de la proteína antigénica.
4.5.1. En la digestión-gel. México La mancha de proteína se escindió del gel de SDS-PAGE y picada a 1 mm
3, se destiñó con solución decolorante (Wako Pure Chemical), se deshidrató con 100% (v /v) ACN, y se secó en condiciones de vacío. digestión tríptica se llevó a cabo con un volumen mínimo de solución de digestión que contenía 20 ng /l de tripsina (tripsina oro, espectrometría de masas Grade, Promega, Madison, WI, EE.UU.) y NH 25 mM
4HCO
3 por 24 hrs a 37 ° C. Después de la incubación, se recogieron los fragmentos de proteínas digeridas eluidas en solución, y los geles se lavaron una vez en 5% (v /v) de ácido trifuloroacetic /50% (v /v) ACN y se recogen en el mismo tubo.
4.5.2. . Identificación de proteínas México La fragmentos peptídicos obtenidos fueron analizados utilizando Autoflex III asociados a matriz láser de desorción /ionización de tiempo de vuelo /tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF /TOF MS; Bruker Daltonik, Bremen, Alemania). Un plato desechable, manchado matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico para muestras, y el PAC Péptido Calibstandard para la calibración (96 Prespotted AnchorChip conjunto de Proteómica, Bruker Daltonik) se utilizaron. Se midieron las huellas dactilares péptido masa (PMF), y luego unos picos obtenidos a partir de PMF se midieron más de sus espectros de masas en tándem como masas de padres. MASCOT (http://www.matrixscience.com) usando la base de datos del IPI Humano (93,289 secuencias; 36,994,704 residuos), publicado el 3 de mayo de 2011 (http://www.matrixscience.com), se utilizó para determinar las proteínas de PMF y los datos de masas en tándem.
5. El análisis por inmunotransferencia con la proteína recombinante CAXII
proteína recombinante y la proteína CAXII Venus como un control negativo con GST-tag se prepararon usando un sistema libre de células de germen de trigo [18]. Catorce g cada una de CAXII recombinante y proteínas Venus se hierve y se separó con SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia con KU-Lu-5 de anticuerpos, como se ha mencionado en el punto 2.4.1.
6. La tinción inmunohistoquímica
secciones de tres micras de espesor, hecho de 10% fijado en formol líneas celulares de cáncer de pulmón incluidos en parafina y 37 y resecado quirúrgicamente de cáncer de pulmón (AD: 28, SCC: 9) se deparaffinized en xileno, rehidratada en una serie de etanol descendente, y entonces se trató con peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 min. Después de que el antígeno fue recuperado por tratamiento en autoclave en 0.01 de tampón /L de citrato mol (pH 6,0) con 0,1% de Tween 20 a 121 ° C durante 10 min, se hicieron reaccionar las secciones con no diluida KU-Lu-5 sobrenadante de hibridoma para 16-18 horas a temperatura ambiente (RT). Después de aclarar en TBS tres veces durante 5 min cada uno, se hicieron reaccionar las secciones con reactivo ChemMate Envision (Dako) durante 30 min a TA. Por último, las secciones se visualizaron con una solución de DAB estable (Invitrogen Corp.) y de contraste con hematoxilina de Mayer.
7. análisis de transferencia puntual
7.1. Preparación de la muestra.
7.1.1. La eliminación de la albúmina y la IgG a partir de muestras de suero.
La eliminación de la albúmina y la IgG a partir de sueros se realizó utilizando un kit de eliminación de ProteoExtract albúmina /IgG (Merck, Darmstadt, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Una muestra de 60 l de cada suero se diluyó con 540 l de tampón de unión, y se dejó pasar a la columna por flujo por gravedad. La fracción de flujo a través se recogió en un tubo de recogida. Para lavar la columna, de tampón de unión se permite pasar a la columna por flujo por gravedad. La fracción de flujo continuo se recogió en el mismo tubo de recogida.
7.1.2. La desalación y concentración por ultrafiltración.
Las muestras de albúmina y empobrecido-IgG eran un intercambio de tampón y se concentraron usando 10-kDa peso molecular de corte VIVASPIN ultra-filtración 2 (Sartorius, Göttingen, Alemania). Las muestras se centrifugaron a 6000 × g a 4 ° C hasta menos de 100 l, y después el tampón se intercambió por PBS (-) con la concentración en 6.000 × g a 4 ° C hasta que se concentró hasta menos de 50 mL. Las muestras concentradas se ajustaron a un volumen final de 60 l con PBS (-).
7,2. El análisis de transferencia Dot
Una l cada una de las muestras de albúmina y empobrecido-IgG diluidas a 1:20 con PBS. (-) y IgG de ratón (purificado en nuestro laboratorio) para un control positivo fueron vistos en una membrana de PVDF (Millipore Corp.) utilizando el sistema de transferencia de mancha automático con una configuración de pines 256-sólido (Kakengeneqs Inc., Chiba, Japón). Dos hojas de membrana se prepararon para un conjunto de experimento. membranas manchados se lavaron en TBS durante 10 min, y se bloquearon con 0,5% de caseína (Sigma) durante 1 hora a RT. Entonces, una membrana se hizo reaccionar con no diluida KU-Lu-5 sobrenadante de hibridoma, y la otra membrana se hizo reaccionar con una solución de dilución de anticuerpos [20 veces diluyeron 0,5% de caseína con 0,1% de Tween 20 añadido TBS (TBS-T)] para 30 min a TA. Después de aclarar en TBS-T 3 veces durante 5 minutos cada uno, las membranas se incubaron con el conejo de 1.000 veces de rábano picante diluido conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón anticuerpo policlonal (Dako) durante 30 min a TA. Finalmente, las señales se desarrollaron con Immobilon reactivo Western (Millipore Corp.). Los datos se analizaron utilizando DotBlotChipSystem Ver. 4,0 (Dynacom Co., Ltd., Chiba, Japón). Cada señal normalizada se presentó como la relación de la intensidad positiva frente a la intensidad de fondo negativa.
8. El análisis estadístico
Los niveles séricos de CAXII en pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba de Mann-Whitney
T-test
. La sensibilidad, especificidad, valores predictivos y se calcularon con el paquete de software SPBs (Ver. 9.42 para Windows) para cada variable a la que corresponde corte. Se realizó un análisis de función discriminante para clasificar a los pacientes en el "cáncer de pulmón" vs. grupo de "control sano", de acuerdo con el estado de los biomarcadores, utilizando el paquete de software SPBs. El área bajo la curva (AUC) y el mejor punto de corte se calcularon empleando el receptor de funcionamiento característico análisis (ROC). Los resultados se consideraron significativos cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
1. La confirmación del título de anticuerpos en sueros de ratón
El título de anticuerpos se ensayó por IHC con 1.000 veces diluida sueros de ratones inmunizados como el primer anticuerpo en las células A549 fijos-Amex. Como resultado, los sueros de ratones inmunizados contenía anticuerpos que reaccionaban con diversos componentes de las células A549.
Uso de preparaciones de células A549 Amex-fijado para la detección inmunohistoquímica de hibridomas, que finalmente establecidos 188 MoAbs en total y una mayor estudio se realizó con el clon KU-Lu-5, que mostró una tinción intensa en las células A549 (Fig. 1 a).
(a) el título de anticuerpos se ensayó inmunohistoquímicamente usando 1.000 veces diluido sueros de ratones inmunizados como el primer anticuerpo en las células A549 fijos-Amex, que se utilizaron como inmunógeno. Los sueros de los ratones inmunizados contiene anticuerpos que reaccionaron con diferentes componentes celulares, tales como el núcleo (↑), la membrana plasmática (▴), y el citoplasma (↑↑). (B) La inmunoprecipitación con KU-Lu-5 de anticuerpos. El análisis por inmunotransferencia usando KU-Lu-5 sobrenadante de hibridoma como primer anticuerpo [carril 1: lisado A549, carril 2: lisado A549 combinado con la proteína G, carril 3: KU-Lu-5 anticuerpo combinado con la proteína G, carril 4: lisado A549 combinado con KU-Lu-5 anticuerpo]. Los carriles 2 a 3 son controles negativos, y no se detectó producto inmunoprecipitado con KU-Lu-5 anticuerpo en el carril 4 (↑). (C) La confirmación de la proteína del antígeno identificado. KU-Lu-5 anticuerpo reaccionó con la proteína recombinante CAXII (64 kDa), pero no con la proteína recombinante de Venus.
2. Identificación de proteína de antígeno
Con el fin de identificar la proteína antígeno reconocido por el anticuerpo KU-Lu-5, se realizó IP con lisado de células A549. Los resultados de IP se muestran en la Fig. 1 B, se observó C. La proteína antigénica en aproximadamente 40 kDa. Para determinar la proteína antigénica reconocida por KU-Lu-5 de anticuerpos, se cortó y se recogió el punto a partir del gel de Zn-manchado, y procedió a la digestión en gel. Después de un análisis que emplea una MALDI-TOF /TOF MS y una búsqueda MASCOT, la proteína se determinó como la isoforma 2 de carbónico anhidrasa XII (CAXII, la adhesión: IPI00221392), que se compone de 343 aminoácidos con un P.M. predicho de 38.384 Da. El resultado se confirmó por análisis de inmunotransferencia con la proteína recombinante utilizando CAXII KU-Lu-5 hibridoma sobrenadante como el primer anticuerpo (Fig. 1 D). El isotipo de inmunoglobulina de KU-Lu-5 de anticuerpos IgG se determinó como
1, κ.
3. se detectó análisis por inmunotransferencia
Expresión de CAXII sólo en las células A549 como una proteína de aproximadamente 40 kDa, y no se detectó ninguna banda clara en otras células utilizadas en este estudio (Fig. 2 A).
(a) por inmunotransferencia análisis de CAXII en líneas celulares de cáncer de pulmón. CAXII se detectó como una proteína de aproximadamente 40 kDa con células A549. (B) La inmunotinción de CAXII en células A549 (a), adenocarcinoma (b), y carcinoma de células escamosas (c) del pulmón, y cada mostraron tinción membranosa de CAXII.
4. La tinción inmunohistoquímica para CAXII
Por inmunohistoquímica, se observó la expresión membranosa de CAXII sólo en las células A549 (Fig. 2 B). Se detectó tinción membranosa en 2 de los 28 AD (7,1%) y en 2 de los 9 SCC (22,2%) (Fig. 2 C, D).
5. Suero CAXII en pacientes con cáncer de pulmón
Los niveles séricos CAXII fueron significativamente mayores en los pacientes con cáncer de pulmón que en los controles sanos en el conjunto de entrenamiento (P & lt; 0,0001). Los valores relativos de los niveles en suero oscilaron CAXII 0,101-4,01 (mediana: 1,520) en pacientes con cáncer de pulmón, pero 0,006-1,679 (mediana: 0,290) en los controles sanos (Fig. 3 A). En el cáncer de pulmón, CAXII niveles en suero de pacientes de SCC fueron significativamente más altos que los de los pacientes con AD (P = 0,03) (Fig. 3 A). El área bajo la curva ROC (AUC) entre los cánceres de pulmón y controles sanos fue de 0,794 (Fig. 3 B). Cuando se aplica un valor de corte óptimo de 0,387 para CAXII, la sensibilidad y especificidad de diagnóstico para el cáncer de pulmón eran 82,9 y 70,0, respectivamente, y los valores predictivos positivos y negativos fueron 0,617 y 0,863, respectivamente. Por otra parte, dentro de los CE, los niveles séricos CAXII fueron significativamente mayores en los pacientes con tumores bien diferenciados y moderadamente que aquellos con los pobremente diferenciados (p = 0,027) (Fig. 4 A), y tendían a ser mayores en los pacientes con un tumor de tamaño menos de 3 cm en lugar de más de 3 cm (P = 0,0538). Sin embargo, no hubo diferencias en la historia de tabaquismo de los pacientes (Fig. 4 B). niveles CAXII en estadio I, II, y III anuncios fueron 1.501, 0.704 y 1.001, respectivamente, y los niveles de CAXII en estadio I, II SCC, y III fueron 1.764, 2.093 y 1.854, respectivamente. Estos datos se resumen en la Tabla 2. No se identificaron las relaciones entre los niveles séricos CAXII y el estadio del tumor o presencia de metástasis de los anuncios o los SCC. Para confirmar aún más la utilidad de los niveles de CAXII suero como un marcador de diagnóstico serológico, 56 muestras adicionales de suero se analizaron por análisis de transferencia puntual como un estudio de validación. Los niveles en suero CAXII también fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer de pulmón que en los controles sanos en el conjunto de validación (P = 0,030). Los valores relativos de los niveles en suero oscilaron CAXII 0,000-8,023 (mediana: 3,921) en pacientes con cáncer de pulmón, pero 0,000-8,331 (mediana: 2,806) en los controles sanos (Fig. 5). Cuando un valor de corte óptimo de 3.086 a aplicarse, la sensibilidad y especificidad de diagnóstico para el cáncer de pulmón eran 65,4 y 70,0, respectivamente.
Los niveles séricos de CAXII en pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos. (A) La mediana del nivel CAXII en los sueros de los controles sanos fue de 0,29, y que en el suero de pacientes con cáncer de pulmón fue de 1,52. Los niveles séricos de CAXII fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer de pulmón (* P & lt; 0,001). Por otra parte, los niveles séricos CAXII fueron mayores en los CE que los anuncios (** p = 0,0381). (B) Receptor-análisis de curva ROC de CAXII como un marcador de suero para el cáncer de pulmón. Las áreas correspondientes bajo las curvas eran 0,794 por CAXII. Con una especificidad de 70,0%, la sensibilidad de CAXII para el cáncer de pulmón fue de 82,9%, con un valor de corte correspondiente a 0,387.
(A) los niveles CAXII en sueros de pacientes con AD y CE con un enfoque en el escenario y la diferenciación. En los CE, los niveles CAXII fueron significativamente mayores en tumores bien diferenciados y moderadamente que en los pobremente diferenciados (*** P = 0,0272). En los anuncios, no se detectaron diferencias significativas en función del grado de diferenciación. (B) la historia de fumar en pacientes con cáncer de pulmón. La mediana del nivel CAXII en los sueros de los no fumadores fue de 1,56, y que en los fumadores fue de 1,54, que no muestran diferencias significativas.
Para confirmar la utilidad de los niveles de CAXII suero como un marcador de diagnóstico serológico, 56 sueros adicional se analizaron por análisis de transferencia puntual como un estudio de validación. Los niveles en suero CAXII también fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer de pulmón que en los controles sanos (P = 0,030). Los valores relativos de los niveles séricos CAXII variaron de 0.000 a la 8.023 (promedio: 3,921) en pacientes con cáncer de pulmón, pero 0,000-8,331 (mediana: 2.806) en los controles sanos
Discusión
.
En este estudio, con el objetivo de descubrir marcadores sero-diagnóstico útil para el cáncer de pulmón, se generaron anticuerpos monoclonales utilizando células A549 derivadas AD-pulmonar como antígenos. De los 188 anticuerpos obtenidos, nos centramos en un anticuerpo que reconoce CAXII, y exploramos su utilidad clínica como un marcador serológico de diagnóstico para el cáncer de pulmón. Se espera que este método de inmunización al azar para producir anticuerpos contra las proteínas específicas de tumor con modificaciones después de la traducción, que son difíciles de obtener por métodos de inmunización convencionales. En realidad, varios autores han informado de que los anticuerpos monoclonales generados por este método son útiles como marcadores de diagnóstico y pronóstico para el cáncer [5], [17], [19]. Battke
et al.
[20] estableció un anticuerpo 6A10 reconocer CAXII utilizando una metodología de inmunización similar. Sin embargo, los anticuerpos obtenidos se limitan a los que solamente reaccionar con antígenos de superficie celular porque de la utilización de citometría de flujo para la selección de hibridomas. En el presente estudio, los hibridomas se rastrearon inmunohistoquímicamente que facilitó la obtención de anticuerpos que reaccionan con las proteínas asociadas a tumores localizados en varios compartimentos intra-celulares. Las AC constituyen una familia de enzimas ubicuas con un papel importante en muchos procesos fisiológicos y patológicos que en sentido inverso a catalizar la conversión de CO
2 + H
2O a HCO
3
- y H
+ , lo que contribuye a la regulación del pH intracelular [6] - [11], [19]. Varios estudios clínicos han demostrado una clara relación entre la alta CAXII niveles de expresión en las células tumorales y un pronóstico favorable.
Watson
et al.
[12] informó de que CAXII se expresó en el 75% de los invasiva casos de carcinoma de mama, y se asoció significativamente con un menor grado histológico (p = 0,001), el estado del receptor de estrógeno positivo (P & lt; 0,01), y la negativa de crecimiento epidérmico sobreexpresión del receptor del factor (P & lt; 0,001). Utilizando el análisis univariado, los tumores CAXII-positivos se asociaron con una menor tasa de recaída (P = 0,04) y una mejor SG (P = 0,01). Por otro lado, aunque 98% de los astrocitomas eran inmunohistoquímica positiva para CAXII, los niveles de expresión más alto CAXII se correlacionaron con un grado histológico alto y un peor resultado paciente, ya sea por análisis de supervivencia univariante (P = 0,010) o multivariado (P = 0,039) [ ,,,0],9].
Un estudio inmunohistoquímico de la expresión de CAXII en el cáncer de pulmón se informó de Ilie
et al.
[13]. Se observó CAXII sobreexpresión en 105/555 casos, y se asoció significativamente con una mejor diferenciación (p = 0,015) y SCC tipo histológico (P & lt; 0,001). Por otra parte, la expresión de alto CAXII también se correlacionó significativamente con una mejor supervivencia global y específica de la enfermedad. A partir de nuestros resultados, los niveles CAXII fueron mayores en el suero de los pacientes que los anuncios de SCC (Fig. 3 A). Además, se correlacionan de manera más favorable con la diferenciación (Fig. 4 A). La integración de estos resultados, CAXII no sólo puede ser un marcador de tejido candidato, sino también un marcador serológico de diagnóstico para el cáncer de pulmón
.
Aunque la asociación de la expresión CAXII y factores clinicopatológicos y el resultado del paciente en diferentes tumores se ha informado, a nuestro entender, se ha reportado ningún estudio relativo a los niveles de proteína de suero CAXII o sus niveles de autoanticuerpos en pacientes con tumores.
para confirmar la posibilidad de CAXII como un marcador de diagnóstico serológico, que mide sus niveles séricos en pacientes con cáncer de pulmón y los controles sanos. Hemos demostrado que la proteína CAXII fluyó hacia fuera en los sueros y sus niveles en pacientes con cáncer de pulmón fueron significativamente mayores que en los controles sanos, tanto en el conjunto de entrenamiento (P & lt; 0,0001) y conjunto de validación (P = 0,030). Es posible que la diferencia en el valor de p entre el conjunto de entrenamiento y validación del conjunto es causada por el hecho de que los niveles séricos de CAXII de los pacientes SCC fueron generalmente más altos que los de los pacientes con otras histologías, y el conjunto de validación incluyen ningún caso SCC . Tomados en conjunto, los niveles séricos CAXII deben ser marcadores aplicables discriminar pacientes con cáncer de pulmón de los controles sanos. En la actualidad, una TC o una radiografía de tórax es el principal método de detección del cáncer de pulmón [21]. Mazzone et al. sugirieron que los análisis de sangre y aliento también deben ser incluidos para la detección del cáncer de pulmón, ya que son a la vez fácil de realizar y libre de riesgos relacionados con la administración de la prueba [21], [22]. En este estudio, se analizaron los niveles de CAXII en sueros de pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos usando anticuerpo monoclonal, y nuestros resultados sugieren que el nivel CAXII sérica es un marcador serológico de diagnóstico útil para el cáncer de pulmón.