Extracto
Antecedentes
Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es una heterogénea grupo de trastornos con un número de alteraciones genéticas y proteómicos. c-CBL es una ligasa de ubiquitina y el adaptador molécula E3 importante en la homeostasis normal y cáncer. Determinamos las variaciones genéticas de c-
CBL
, la relación con los receptores tirosina quinasas (EGFR y MET), y la funcionalidad en el CPNM.
métodos y las conclusiones
El uso de formol archivo parafina -fixed incorporado (FFPE) extrajo ADN genómico, mostramos que las mutaciones c-CBL se producen de forma somática para los cánceres de pulmón. mutaciones c-CBL no eran mutuamente excluyentes de MET o mutaciones de EGFR; sin embargo, eran independientes de las mutaciones de p53 y KRAS. En el análisis de lo normal /tumoral por parejas, hubo una pérdida significativa de heterocigosidad (LOH) para el c-
CBL
locus (22%, n = 8/37) y ninguna de estas muestras reveló ninguna mutación en la copia restante de c-CBL. El c-
CBL
LOH también una correlación positiva con mutaciones EGFR y MET observada en las mismas muestras. El uso de selectos mutaciones somáticas c-CBL como S80N /H94Y, Q249E y W802 * (obtenido de raza caucásica, muestras taiwaneses y afroamericanos, respectivamente) se transfectaron en líneas celulares de cáncer, hubo una mayor viabilidad celular y la motilidad celular.
Conclusiones
Tomando la tasa de mutación general de c-CBL ser una combinación como mutación sin sentido somático y LOH, está claro que c-CBL es altamente mutado en los cánceres de pulmón y puede desempeñar un papel esencial en el pulmón tumorigénesis y metástasis
Visto:. Tan y-HC, Krishnaswamy S, S Nandi, Kanteti R, S Vora, Onel K, et al. (2010) CBL se altera frecuentes en los cánceres de pulmón: Su Relación con mutaciones en MET y EGFR tirosina quinasas. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10.1371 /journal.pone.0008972
Editor: José Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2009; Aceptado: 9 Enero 2010; Publicado: 29 Enero, 2010
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. con el apoyo de los Institutos nacionales de Salud (NIH) /Instituto Nacional del cáncer (NCI) Subvenciones: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-Fundación, Fundación para la Investigación del cáncer y la Asociación Americana de Salud respiratoria de América (RS) y otorgan NSC96-2628-B-006-048-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia , Taiwán. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer. Los agenices de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Sólo en los EE.UU., cada año aproximadamente 219.400 personas son diagnosticadas con cáncer de pulmón, de los cuales más de 145.000 de ellos sucumben a la enfermedad [1]. Este número es aproximadamente equivalente a las tasas de mortalidad combinadas de los cánceres de mama, próstata, colon, hígado, riñón y melanoma [1]. Además, el pronóstico es generalmente pobre y la tasa de supervivencia a cinco años es inferior al 15%. También hay importantes diferencias étnicas para el cáncer de pulmón, y el resultado es peor para los negros en comparación con los blancos. Las diferencias de género también son sorprendentes con las mujeres que tienen pronóstico significativamente mejor en comparación con los hombres. Hay una serie de alteraciones genéticas que pueden ocurrir en el cáncer de pulmón. Como ejemplo, en NSCLC, se han identificado mutaciones en KRAS, p53, EGFR y MET. Muchas de estas vías, especialmente tirosina quinasas del receptor (RTK) son controlados por c-CBL.
CBL gratis (Casitas de linaje B linfoma) es un gen de mamífero se encuentra en el cromosoma humano 11q23.3 [2] y está implicado en la señalización celular y la proteína ubiquitinación [3]. CBL proteínas pertenecen a la clase dedo anular de ubiquitina ligasas (E3) y hay tres homólogos
C-CBL
,
CBL-b
,
CBL-3
[4 ]. El
C-CBL
y
CBL-B Opiniones genes se expresan de forma ubicua, con los niveles más altos en los tejidos hematopoyéticos [5].
c
-CBL consta de cuatro regiones que codifican para los dominios de proteínas funcionalmente distintas: la tirosina quinasa N-terminal de dominio (TKB), la región de engarce, el dominio de tipo dedo RING catalítica, la región rica en prolina y el c de unión -terminal (UBA) dominio de ubiquitina-asociado que también se solapa con un dominio de cremallera de leucina (LZ) [3]. Ambos dominios TKB y el dedo anular son esenciales para la ubiquitinación inducida por ligandos de las RTK [6], [7], [8], [9]. Se requiere el dominio dedo anular para la contratación de E2 enzimas ubiquitina-conjugación. El dominio TKB incluye haz de cuatro hélices (4H), un EF mano de calcio-presagiar, y un dominio SH2 modificado, que se une a los residuos de fosfotirosina [3], [10], [11], [12]. Además, la región rica en prolina de c-CBL puede asociarse con el dominio SH3 de Grb2, que indirectamente puede reclutar c-CBL a RTK a través de la proteína adaptadora GRB2 [7], [13], [14].
c-CBL también se une a EGFR y actúa como la E3 que se dirige a EGFR para la ubiquitinación y la degradación. Además, CBL desensibiliza la señalización de EGF y se opone a la proliferación celular inducida por EGF [15]. la activación de EGF también parece activar la tirosina quinasa SRC, que fosforila c-CBL y a su vez activa la ubiquitinación y degradación de EGFR [16], [17], [18]. Un estudio reciente muestra que la endocitosis defectuosa de EGFR se caracteriza por un mutante de deleción y la L858R punto de mutación, con lo que su asociación con c-CBL y posterior ubiquitinación se vean afectados [19]. Recientemente, se informó de las primeras mutaciones c-CBL humanos en la leucemia mieloide (LMA) de los pacientes agudos [20]. El R420Q mutación inhibe FMS tirosina quinasa 3 (FLT3) internalización y ubiquitinación [20].
No sólo puede la actividad E3 ser importantes en la oncogénesis, c-CBL tiene una doble función, pero separado como una molécula de transducción de señales . Hemos demostrado previamente que el c-CBL es importante en CRKL y BCR /ABL unión en las células hematopoyéticas. Además, se puede unir y modular las funciones de citoesqueleto mediante la unión a proteínas como talina y paxilina. El dominio TKB es importante en la unión a un número de moléculas, y que a continuación, funciona en la transducción de señales.
Dado el papel crítico de CBL en la homeostasis normal y cáncer, la hipótesis de que podría ser mutado en los cánceres de pulmón. En este estudio, se presenta novedosos c-CBL mutaciones somáticas S80N /H94Y, Q249E y W802 * en el Cáucaso, los pacientes con cáncer de pulmón taiwaneses y afroamericanos, respectivamente. Expresando estas mutaciones en las líneas celulares de NSCLC conduce a aumento de la proliferación y motilidad de las células. Se demuestra que las mutaciones c-CBL ocurren con o sin MET o mutaciones de EGFR, pero son mutuamente excluyentes de un LOH en el
CBL
locus c-. Además, c-
CBL
LOH se asocia con cualquiera de las mutaciones de EGFR o MET. por tanto, planteamos la hipótesis de que las mutaciones de c-CBL pueden contribuir a la potencial oncogénico de MET y EGFR en cáncer de pulmón.
Métodos
Declaración de Ética
El consentimiento por escrito de todas las investigaciones sobre humana los sujetos se han obtenido de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Chicago y cubre todas las investigaciones realizadas en el laboratorio. La siguiente es la información de contacto: Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Chicago, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2 ° piso, Chicago, IL 60637. consentimiento informado por escrito se recibieron de todos los pacientes cuyas muestras de tejido fueron utilizados para este estudio .
muestras de tejido
tejido canceroso
pulmón y los tejidos pulmonares normales adyacentes apareados se obtuvieron a partir de 50 caucásicos, 29 afroamericanos y 40 pacientes con CPNM taiwaneses que fueron reclutados en la Universidad de Chicago (Chicago hospital , EE.UU.) (de raza blanca y pacientes afroamericanos) y Taipei Veterans hospital general de Taiwán (Taiwán pacientes) después de obtener el permiso apropiado Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado de los pacientes. Fuera de 119 muestras, 77 eran hombres, 38 eran mujeres y 4 eran desconocidos con la edad al momento del diagnóstico que van desde 47 a 90 años. En términos de tipos de tumores, 53 fueron adenocarcinoma, 32 eran carcinoma de células escamosas y 34 eran carcinoma de células grandes. 49 fueron estadio I, 14 estaban en estadio II, 34 eran en estadio III y 13 estaban en estadio IV (Tabla S1).
Cell Cultura y
Humano no microcítico de pulmón de células de carcinoma de células A549 y H358 se mantuvieron en DMEM y RPMI-1640, respectivamente. Las células 293T de riñón embrionario humano se cultivaron en DMEM. Los medios se suplementaron con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 g /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2.
c-
CBL
génica análisis mutacional
Los exones 2 a 16 de la c -
CBL
genes fueron amplificados por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores se enumeran en la Tabla S2. condiciones de PCR fueron 1 ciclo de 95 ° C durante 5 minutos; 35 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 2 minutos; y un ciclo de 72 ° C durante 10 minutos. Los productos de PCR fueron tratados con ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH) y secuenciados por Big-Dye Terminator química (Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuenciación se realizó en la cadena codificante adelante con la confirmación de
C-CBL
alteraciones realizadas por secuenciación de la cadena inversa también. Los cromatogramas se analizaron en busca de mutaciones utilizando Mutación Surveyor v2.61 (SoftGenetics, State College, PA).
Construcciones de plásmidos y mutagénesis dirigida
El tipo salvaje c-
CBL
inserto de ADNc se subclonó en el vector de expresión pAlterMax utilizando
Xho I y
Sal
sitios de enzimas de restricción I (Promega, Madison, WI). El uso de este plásmido parental pAlterMax-c-
CBL
, el dominio TKB doble mutación (S80N /H94Y), el punto de mutación (Q249E), y el C-terminal de punto de mutación W802 * de c-
CBL
fueron creados usando los siguientes cebadores: 5'-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 'y 5'-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3' de la doble mutación S80N /H94Y; 5'-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 'para Q249E, y 5'-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3' para W802 * junto con sus cebadores complementarios utilizando el kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis XL (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. Las construcciones fueron confirmadas por las mutaciones puntuales mediante secuenciación de ADN estándar de ambas cadenas.
La pérdida de heterocigosidad (LOH) Análisis
cinco microsatélites en el cromosoma 11 (3 en 11q en o dentro de 200 kb hasta o aguas abajo de la c-
CBL
gen y 2 marcadores de control en 11 p) fueron seleccionados para el análisis (Tabla S3). marcadores de microsatélites establecidos y secuencias de los cebadores respectivos fueron seleccionados de la base de datos GeneLoc (http://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Instituto de Ciencia Weizmann, Rehovot, Israel). Los cebadores se diseñan a medida y cada cebador directo fue marcado con fluorescencia en el extremo 5 'con FAM, PET, NED, o VIC (Applied Biosystems). temperaturas de hibridación de cebadores y las puntuaciones dúplex fueron evaluados con herramientas de cebadores (NIST http://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do; Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, MD). Los cebadores se verificaron mediante la realización de PCR con ADN de control (aislado a partir de células TK6) y la solución de los productos en geles de agarosa. Las bandas se visualizaron con un transiluminador UV. ADN genómico fue extraído de muestras de tumor y vinculado tejido pulmonar normal. Los cebadores se agrupan en combinaciones multiplex que se muestran en la Tabla S4. Marcador D11S929 sirvió como un control interno para comprobar la consistencia de PCR y de los picos de electroforesis capilar. Multiplex PCR se llevaron a cabo en un volumen de 10 l que contenía 1 l de ADN genómico (20 a 50 ng), 0,5 M de cada cebador (1,0 M total para cada par de cebadores), 400 mM dNTPs, 1X tampón de PCR que contiene MgCl
2, y 0,2 U
Taq ADN polimerasa
. PCR se realizó en el sistema de PCR ABI GeneAmp 9700 en las siguientes condiciones: 5 min a 94 ° C; 30 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 min a 60 ° C, 1 min a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis capilar en un analizador de ADN ABI 3130xl. Los cromatogramas fueron analizados con escáner de pico 1,0 y 3,7 GeneMapper software (Applied Biosystems) para alteraciones alélicas. El área de los picos producidos por los productos de PCR de ADN se cuantificó para cada alelo. La relación de las áreas alélicas se calculó para cada tumor y vinculado muestra de ADN normal. Cuando el qLOH (relación alélica para los picos de tumor dividido por la relación alélica de muestra normal emparejado) era ≤0.5 o ≥2.0 para c-
CBL
y al menos otro marcador 11q en al menos dos experimentos separados, la muestra se considera que tiene un desequilibrio alélico y se interpreta como LOH. Las muestras se evaluaron en al menos dos experimentos y muestras separadas mostrando prospectivo LOH en c-
CBL
repitió una tercera vez, que incluía un nuevo marcador de control en los
BAX
locus (datos no mostrados) en el cromosoma 19 para verificar la integridad del ADN de la muestra.
la transfección de c-
Cbl
constructos
la línea celular A549 se transfectaron usando el Fugene HD (Roche, Nutley, NJ) reactivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ocho g de ADN plásmido, que contiene o bien sin inserto (vector vacío), de tipo salvaje c-
CBL
, S80N /H94Y c-
CBL, España Q249E c-
CBL
o W802 *
CBL
se utilizó para la transfección en una placa de cultivo de 6 pocillos. Las células se recogieron 48 h después de la transfección y se analizaron para la expresión.
c-
CBL
Derribo
c-
CBL
caída se ha realizado mediante transducción lentiviral usando MISSION partículas lentiviral transducción (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, 1 × 10
5 H358 células /pocillo fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se infectaron al día siguiente con c-
CBL
lentiviral shRNA construye. Para generar líneas celulares knockdown c-CBL estables, se seleccionaron las células durante 2 días con 1 mg puromicina /ml. los niveles de c-CBL se determinaron usando lisados de células enteras mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-CBL (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA).
viabilidad celular Ensayo
Las células se transfectaron como se describe anteriormente en el ensayo de transfección. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, viabilidad de las células se evaluó mediante exclusión de azul de tripano.
Curación de Heridas Ensayo
Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 48 h hasta que el 100% de confluencia . El medio se cambió y se transfectaron las células como se describe en el ensayo de transfección. Doce horas después de la transfección, un rasguño recta se hace a través de la capa de células usando una punta de pipeta de 1 ml. Después, las células se lavaron suavemente con 1 × PBS para eliminar los desechos celulares y se reemplazó el medio. Se tomaron fotografías de la región de la herida cada 12 h hasta las 48 h.
Análisis Western Blot
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células y se lavaron dos veces en 1X PBS, después se lisaron en hielo tampón de lisis frío (0,5 M Tris-HCl con pH 7,4, 1,5 M de NaCl, ácido desoxicólico al 2,5%, EDTA 10 mM, 10% de NP-40, DTT 0,5 mM, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5 mg /ml de leupeptina, y 10 g /ml de aprotinina) durante 5 minutos. El lisado se centrifugó a 13.000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C, y se midió el contenido de proteína del sobrenadante. lisados de células totales (50 g /pocillo) se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE y los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman, Piscataway, NJ). Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% no grasa en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 (PBST) (1X PBS, 0,1% Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con el anticuerpo primario adecuado a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron a continuación tres veces con PBST y se sondaron con apropiado peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron de nuevo tres veces en PBST y las bandas se visualizaron usando el reactivo de quimioluminiscencia Western blot (BioRad, Valencia, CA) en un sistema de documentación Gel ChemiDoc (BioRad, Valencia, CA). Los anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz biotecnologías y se utilizan en las siguientes diluciones (c-CBL, 1:5000; c-MET, 1:5000; EGFR, 1:5000; ubiquitina, 1:1000; HA, 1:5000 y ß- actina, 1:10,000).
citometría de flujo
El análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Aproximadamente el 2 × 10
6 células fueron cultivadas en medios que contienen 10% de FBS. Las células se recogieron por tratamiento con tripsina /EDTA, se lavaron con 1X PBS tres veces y se fija con helado de etanol 70% durante 2 h. Las células se lavaron de nuevo con PBS frío y se tiñeron con una solución que contiene 25 mg /ml de yoduro de propidio, 200 mg /ml de RNasa A, y 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos en la oscuridad. El análisis del ciclo celular se realizó con un flujo de guayaba PCA-96 citómetro (Guava Technologies, Millipore, Billerica, MA).
La ubiquitina ligasa Actividad
293T células se mantuvieron en cultivo en DMEM complementado con un 10 % de FBS y 1% de penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) fueron transfectadas con 0,2 g EGFR-pcDNA3 y 2 g HA-tagged c-
CBL
construye como se indica utilizando fosfato de calcio de acuerdo con el protocolo del fabricante (Profection, Promega, Madison, WI). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se mueren de inanición durante la noche en DMEM suplementado con 0,5% de FBS, y después se trataron con o sin EGF (100 ng /ml) durante 15 min. Las células se recogieron y se lavaron dos veces en ortovanadato de sodio 0,2 mM PBS que contenía enfriado en hielo después se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (10 mM Tris HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% de Triton X100, 10% El glicerol, ortovanadato de sodio 2 mM e inhibidores de proteasa). Lisados fueron aprobados de los desechos mediante centrifugación a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C. inmunoprecipitaciones EGFR se realizaron en 200 g de lisado aclarado usando 250 ng de conejo-anti-EGFR y Proteína A /G Plus Sepharose durante la noche a 4 ° C. Las precipitaciones se lavaron 5 veces en tampón de lisis antes de la ebullición en tampón de Laemmli. Las eluciones se inmunotransfirieron con anti-ubiquitina y EGFR. Veinte microgramos de lisado aclarado se immunoblotted para cada uno de los extremos C
CBL
constructos utilizando anti-HA.
Análisis estadístico
Las tasas de mutación entre los diferentes grupos se compararon mediante la prueba exacta de Fisher prueba. Para las variables continuas, comparaciones de grupos se realizaron mediante análisis de la varianza (ANOVA) seguido de un ajuste de Sidak para comparaciones múltiples. Experimentos con mediciones repetidas en el tiempo se analizaron utilizando ANOVA de medidas repetidas con el ajuste Greenhouse-Geisser a los grados de libertad. Los análisis se realizaron utilizando el software STATA (versión 10.1) (Stata Corporation, College Station, TX).
Resultados
c-
CBL
mutaciones genéticas en el cáncer de pulmón
Para investigar el papel de c-
CBL
en el cáncer de pulmón, se analizó su ADN genómico en muestras tumorales y normales emparejados procedentes de múltiples etnias. Las muestras de tumores de pulmón representados los caucásicos (n = 50), los afroamericanos (n = 29), y taiwaneses (n = 40) pacientes con cáncer de pulmón. Diseñamos 12 pares de cebadores para secuenciar la región de codificación de c-
CBL
gen que abarca los exones 2 a 16 (Tabla S2). Se identificaron 8 mutaciones somáticas únicas en c-
exones CBL Estar entre 8 pacientes diferentes. También se detectó una variación L620F, un SNP conocida (rs2227988) en el exón 11. Es importante destacar que los ocho nuevas mutaciones no sinónimas se confirmaron por secuenciación de ambas cadenas de c-
CBL
ADN genómico obtenido de las muestras de tumor de pulmón (Tabla 1). Por otra parte, no se detectó ninguno de los 8 mutaciones en el tejido normal correspondiente, lo que indica que estos eran mutaciones somáticas. También se identificaron cuatro variaciones de nucleótido único sinónimas (SNVS), pero no fueron utilizados más adelante en este estudio.
Tres de los 8 nuevas mutaciones no sinónimas se localizaron en el TKB (unión de la tirosina quinasa) dominio ( S80N, H94Y, y Q249E), uno en el dominio dedo anular (V391I), uno en la región rica en prolina (72515_72517 del ATG), y tres en la región C-terminal (W802 *, R830K, y A848T) de la c-CBL proteína (Figura 1A y la Figura S1). En la Figura 1B, se muestra cromatogramas modelo de muestras representativas.
(A) Ilustración esquemática de los diversos mutantes c-CBL con respecto a los diferentes dominios funcionales. Tres mutaciones: S80N, H94Y, Q249E se encuentran en el dominio TKB; V391I se encuentra en el dominio de dedos de anillo; 72515_72517 del ATG (una deleción del marco de lectura no) y L620F (a SNP conocido, rs2227988) se localizaron en Pro-región rica y W802 *, R830K, y A848T fueron encontrados en la región C-terminal de c-CBL. Los números mostrados representan posiciones de aminoácidos. Asociación de mutaciones c-CBL entre las diferentes poblaciones étnicas se muestra en la tabla (∧ conocido SNP). (B) Los ejemplos representativos de cromatogramas de secuenciación de la región de mutación en normal (N) y muestras de tumor (T). Las flechas indican la mutación heterocigota en la muestra de tumor. (C) La pérdida de análisis de heterocigosidad (LOH) de 37 muestras tumorales y normales apareados de pacientes taiwaneses. Un valor de & lt; 0,5 indica una LOH en el c-
CBL
locus. (D) Esquema del cromosoma 11 marcadores elegidos para el análisis de LOH y ejemplos representativos de análisis cromatograma LOH. Después de la amplificación utilizando el cromosoma 11 cebadores de microsatélites específicos, el producto de PCR se separaron por electroforesis capilar y se cuantificaron las bandas de acuerdo a la intensidad.
11q LOH de c-
CBL
Gen
tumor de pulmón normales apareadas y muestras de tejido pulmonar de los pacientes taiwaneses (n = 37) fueron investigados por LOH. Ocho (21,6%) mostraron LOH en el c-
CBL
locus en el cromosoma 11, mientras que 29 muestras (78,4%) revelaron contribución alélica normal en los marcadores de microsatélites (figuras 1C y D).
c-CBL las mutaciones en diferentes grupos étnicos
el C-CBL doble mutante S80N /H94Y fue encontrado en el mismo paciente y la tasa de mutación general de c-CBL en tumores de pulmón fue del 6,7% (8/119). La frecuencia de c-CBL mutación fue más alta en el carcinoma de células grandes (14,7%; 5 de 34 pacientes), seguido de carcinoma escamoso (6,3%; 2 de 32 pacientes) y el menos se observó en adenocarcinoma (AD) (1,8%; 1 de 53 pacientes), aunque estas tasas no fueron estadísticamente significativas (p = 0,292). Las tasas de mutación fueron 6,0% entre los caucásicos (0 de 20 en AD; 0 de 10 en SQ, y 3 de 20 en LC), el 13,8% de los afroamericanos (1 de 10 en AD; 1 de 10 en SQ, y 2 de 9 en LC), y el 2,5% (0 de 23 en AD; 1 de 12 en SQ, y 0 de 5 en LC) en la población taiwanesa. Además dos pacientes taiwaneses con cáncer de pulmón (uno escamosas y el adenocarcinoma uno) tuvieron el conocido SNP L620F. Las diferencias étnicas no fueron estadísticamente significativas, sin embargo, el poder para detectar diferencias fue baja.
Las mutaciones en
MET
y
EGFR
puede hacerse Asociada CO con C-CBL Alteraciones
Dado que los asiáticos orientales con cáncer de pulmón tienen una mayor frecuencia de
EGFR
y
MET
mutaciones en los tumores de pulmón [21], [22], también se determinó mutaciones en
EGFR
y
MET
en las mismas muestras de cohortes taiwanés y compararon los resultados con los observados c-
CBL
alteraciones (LOH y /o mutaciones). En las 37 muestras analizadas, no hemos encontrado ninguna coincidencia entre C-
CBL
mutaciones y c-
CBL
LOH (Figura 2). De los tres mutantes de c-CBL (incluyendo el conocido L620F SNP, rs2227988), una de las muestras tenía una mutación MET (N375S) y la otra tenía una mutación de EGFR (L858R). Entre las 8 muestras que tenían una LOH en el c-
CBL
locus 5 tenían una mutación adicional en MET (N375S) y 2 tenían un
EGFR
exón 19 de su eliminación. Veintiséis muestras tenían ni c-
CBL
mutación ni c-
CBL
LOH (3 pacientes tenían una c-
CBL
mutación, pero no c-
CBL
LOH). Entre estas 26 muestras 9 tenían una mutación MET (8 N375S, 1 L211W), 13 tenían un
EGFR
mutación (7 exón 9 eliminación, 6 L858R) y 4 tenían ninguna otra mutación de EGFR o MET. Así, la tasa de MET o EGFR mutaciones entre los pacientes con LOH en el c-
CBL
locus (7 de 8) fue similar a la observada en pacientes sin c-
CBL
mutación o LOH ( 22 de 26 pacientes) (p = 0,99). Estos 4 pacientes sin mutación identificada en c-
CBL
,
MET
o
EGFR
representó el 10,8% de los 37 pacientes analizados en la cohorte de pacientes taiwaneses. Por el contrario, el 89,2% taiwaneses pacientes con cáncer de pulmón tienen una mutación identificable en cualquier c-
CBL
,
MET
o
EGFR
o una combinación de los tres genes (Figura 2) . Además, se determinó
p53 Opiniones y
KRAS
mutaciones en estas cohortes taiwaneses. Dos
p53 Opiniones y 1
se detectaron KRAS
mutación. La única
KRAS mutación
solapada con un
p53
mutación. Este paciente también tenía el
EGFR
exón 19 de su eliminación, pero no tenía c-
CBL
mutación. El otro
muestra de p53
mutación tenían un c-
CBL
LOH concurrente con la mutación N375S MET. Por lo tanto, en las muestras analizadas taiwaneses,
p53 /KRAS
mutaciones y c-
CBL
mutaciones eran mutuamente excluyentes (datos no mostrados).
Se analizaron
37 muestras de taiwaneses mutaciones en c-
CBL
,
MET
y
EGFR Opiniones y para el análisis de LOH en el c-
CBL
locus. Los datos muestran un 21,6% (8/37) presentaron LOH, mientras que el 8% (3/37) tenían una mutación c-CBL (incluyendo el conocido SNP L620F), estas muestras eran mutuamente excluyentes. Además, 5 de 8 muestras LOH también se reunió mutación N375S y 2 tenían
EGFR
exón 19 de su eliminación. En las muestras que tienen c-
CBL
mutación, 1 también se reunió mutación N375S, mientras que otro tenía EGFR L858R mutación. En muestras que no albergan ninguna c-
CBL
mutación (70%, 26/37), 22 tenían ya sea un
MET
o un
EGFR
mutación y sólo el 4 no tienen una mutación en cualquiera de estos 3 genes.
funciones celulares de c-
CBL
las alteraciones en el contexto de pulmón Tumorigénesis
a. actividad E3 está intacta en las proteínas c-CBL mutantes.
Para investigar si las diferentes mutaciones c-CBL afectan a la actividad de E3, EGFR fue elegido como un sustrato modelo para la función de c-CBL E3. Todos los mutantes de c-CBL ensayados mejorado ubiquitinación del EGFR activado similar a la proteína c-CBL de tipo salvaje. Este resultado demuestra que la actividad catalítica de los mutantes de c-CBL no se altera cuando EGFR fue el sustrato. (Figura 3A).
(A) mutantes c-CBL no alteran la ubiquitinación de EGFR. Las células fueron co-transfectadas con EGFR y diferentes mutantes c-CBL fueron estimuladas con EGF, se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-EGFR y la inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina. Inmunotransferencia con el anticuerpo anti-EGFR sirvió como control IP, mientras que el blot anti-HA se utilizó como el control de entrada. viabilidad (B) de la célula se midió por exclusión de azul de tripano y se comparó con el control de vector vacío. c-CBL de tipo salvaje (WT) y mutantes S80N /H94Y, Q249E, y W802 * mostraron 66,7%, 132,3%, 120,8% y 147,9%, respectivamente, la viabilidad celular en las células A549 48 horas después de la transfección. Los experimentos se realizaron por triplicado y se muestran los datos de la media. Las barras de error indican la desviación estándar. los niveles de (C) expresión de la proteína de los diversos mutantes se analizaron por transferencias de Western utilizando anticuerpo c-CBL. análisis (D) del ciclo celular de diferentes mutantes de c-CBL 48 h después de la transfección en células A549.
B. Efecto sobre la viabilidad de células de cáncer de pulmón
.
Se determinó el efecto de un representante mutante c-CBL de cada uno de los tres grupos étnicos en la viabilidad de células de cáncer de pulmón en las líneas celulares. S80N /H94Y doble mutación, Q249E, y W802 * fueron identificados en muestras de tumores de pulmón obtenidas de un caucásico, un taiwanés y un afroamericano, respectivamente. Como se describe en métodos, el de tipo salvaje c-CBL (WT) y los tres mutantes anteriores se expresaron después de la clonación en ellos pAlterMax vector en las células A549. Estas células expresan relativamente bajos niveles basales de endógenas c-CBL (datos no mostrados). La eficacia de transfección fue comparable entre los diferentes grupos y el número de células transfectadas con c-
CBL
de tipo salvaje constructo fue alrededor del 70% en comparación con las células control que fueron transfectadas con el vector vacío. Las células transfectadas con S80N /H94Y, Q249E y W802 * c-CBL mutante construcciones resultaron en mayor número de células viables que fue 132,3%, 120,8% y 147,9% mayor, respectivamente, en relación con las células control de vector vacío transfectadas y significativamente diferente de la naturaleza de tipo construir (p = 0,022, p = 0,049 y p = 0,008, respectivamente) (Figura 3B). Los niveles relativos de proteína c-CBL en lisados de células completas preparados a partir de muestras obtenidas de un experimento paralelo fue determinada. Los niveles de proteína C-CBL en muestras que representan las células transfectadas vector no transfectadas y vacíos eran comparables y los que representan a la c-CBL WT y los mutantes tres c-CBL fueron comparables (Figura 3C).
C. Efecto sobre el ciclo celular.
Para investigar si los aumentos en la viabilidad celular en diferentes mutantes c-CBL son debido al aumento de la proliferación celular, se realizó un análisis del ciclo celular. Las células A549 se transfectaron con el c-CBL WT o los tres mutantes diferentes: S80N /H94Y, Q249E y W802 *. El transfectante vector vacío fue utilizado como control. Cuarenta y ocho horas después de la transfección análisis del ciclo celular se realizó como se describe en materiales y métodos. No hubo ningún cambio significativo en la subG1, G1 o la fase S del ciclo celular entre los diferentes mutantes en comparación con el constructo WT (p = 0,64, p = 0,40 y p = 0,28, respectivamente). La fase G2 /M del ciclo celular mostró un aumento en el número de células para los tres mutantes, S80N /H94Y, Q249E y W802 *, en comparación con el WT, pero de nuevo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,25) (Figura 3D ).
D. Efecto sobre la motilidad celular.
Para investigar el efecto de la expresión de los mutantes anteriores tres c-CBL en la migración celular, se realizó un ensayo de cicatrización de la herida como se describe en materiales y métodos. El cierre de la cero o la herida se monitorizó a los 0, 12, 24, 36 y 48 h. (Figura 4A). En todas las muestras, que representaban células transfectadas con los mutantes, la brecha de la herida fue mucho menor que la observada en la muestra que representa las células transfectadas con c-CBL WT (p & lt; 0,001). También se determinó la tasa de cierre de la herida para todos los cinco grupos. A las 48 h, de tipo salvaje transfectantes c-CBL mostraron 61,1% herida abierta mientras que los /H94Y, Q249E y W802 * mutantes S80N mostraron un 18,7%, 23,9% y 34,3% herida abierta, respectivamente (p & lt; 0,001). (Figura 4B)
(a) herida ensayo de curación se llevó a cabo en las células A549 transfectadas con WT C-CBL o diferentes mutantes. vector vacío (EV) se utilizó como control. se muestran imágenes representativas (campo claro y contraste de fase) de cada punto de tiempo.