Extracto
Antecedentes
Hemos demostrado anteriormente que la expresión de CBX7 se reduce drásticamente en varios carcinomas humanos y que su expresión disminuye progresivamente con la aparición de un fenotipo altamente maligno. El objetivo de nuestro estudio ha sido investigar el mecanismo por el cual la pérdida de expresión CBX7 puede contribuir a la aparición de un fenotipo más maligno.
Métodos
Se analizó el perfil de expresión génica de una tiroides línea celular de carcinoma después de la restauración de CBX7 y, a continuación, se analizó la regulación transcripcional de los genes identificados. Por último, se evaluó la expresión de genes regulados CBX7 y en un panel de carcinomas de tiroides y pulmón.
Resultados
Hemos encontrado que CBX7 negativa o positivamente regula la expresión de varios genes (como SPP1 , SPINK1, STEAP1, y FOS, FOSB, EGR1, respectivamente) asociados a la progresión del cáncer, mediante la interacción con sus regiones promotoras y modulando su actividad transcripcional. análisis de RT-PCR cuantitativa en los tejidos de la tiroides y el carcinoma de pulmón humano reveló una correlación negativa entre CBX7 y sus reguladas por los genes, mientras que una correlación positiva se observó con genes regulados.
Conclusión
en conclusión, la pérdida de expresión CBX7 podría desempeñar un papel crítico en las etapas avanzadas de la carcinogénesis mediante la desregulación de la expresión de genes efectores específicos
Visto:. Pallante P, R Sepe, Federico a, Forzati M, M Bianco, Un Fusco (2014) CBX7 modula la expresión de genes críticos para la progresión del cáncer. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10.1371 /journal.pone.0098295
Editor: Tania V. Kalin, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de octubre de 2013; Aceptado: 30 de abril de 2014; Publicado: 27 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Pallante et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Ministero della Ricerca e dell'Università Scientifica e Tecnologica-MIUR (PRIN 2008), "Progetto di Interesse strategico (Programa PNR-CNR Envejecimiento) Invecchiamento PNR-CNR 2012-2014 "y Progetto PON01-02782:" Nuove strategie nanotecnologiche per la messa un punto di farmaci e Presidi diagnostici diretti reverso cellule cancerose circolanti ". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores confirman que Pierlorenzo Pallante y Alfredo Fusco son Editores Académicos de PLOS ONE. Pierlorenzo Pallante y estatal Alfredo Fusco que esto no altera su adhesión a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
CBX7 es un miembro de la proteína Polycomb Polycomb represivas del complejo 1 (PRC1), un complejo multiproteicos que junto con el polycomb represivas complejo 2 (PRC2), mantiene los genes de desarrollo importantes en un estado transcripcionalmente reprimidos [1] - [3]. Hemos demostrado previamente que el gen CBX7 es drásticamente reducido regulado en los carcinomas de tiroides y su expresión disminuye progresivamente con el grado de malignidad y la etapa neoplásica [4]. Por otra parte, otros estudios han demostrado que la correlación de la pérdida de CBX7 con un fenotipo altamente maligno y el consiguiente mal pronóstico es un evento en general en oncología. De hecho, la pérdida de expresión CBX7 ha sido recientemente demostrado que se asocia con el aumento de grado de malignidad en el colon [5], la vejiga [6], de páncreas [7], de mama [8], gástrico [9] y el carcinoma de pulmón [10] , mientras que la retención de expresión CBX7 se correlaciona con una supervivencia más larga del colon y pacientes con cáncer pancreático [5], [7]. La restauración de la expresión CBX7 en la tiroides, las líneas celulares gástricas y de carcinoma de colon inhibe el crecimiento celular con una acumulación de la población de células en la fase G1 del ciclo celular, lo que sugiere un papel negativo de CBX7 en el control de la transición G1 /S de la ciclo celular.
recientemente se ha demostrado que CBX7 es capaz de regular positivamente la expresión del gen que codifica la e-cadherina [11] que se sabe que juega un papel crítico en el mantenimiento de la morfología celular epitelial normal y cuya pérdida de expresión representa una característica general de la transición epitelial-mesenquimal [12], [13]. De hecho, se ha demostrado que CBX7 es capaz de preservar la expresión de E-cadherina mediante la interacción con la histona desacetilasa 2 y la inhibición de su actividad sobre el promotor CDH1 [11]. En consonancia, una correlación directa entre los niveles de E-cadherina y expresión CBX7 se ha informado en la tiroides y carcinomas pancreáticos [7], [11]. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la pérdida de la expresión del gen CBX7 puede jugar un papel crítico en las últimas etapas de la progresión del carcinoma humano
.
El papel supresor de tumor de CBX7 se ha confirmado muy recientemente por el fenotipo de cbx7 ratones knockout. De hecho, estos ratones desarrollar adenomas y carcinomas del hígado y de pulmón, y en consecuencia, los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) derivadas de los ratones knockout cbx7 tener una mayor tasa de crecimiento y una susceptibilidad reducida a la senescencia que sus homólogos de tipo salvaje [10]. Ciclina E sobreexpresión, debido a la falta de cbx7 que regula negativamente su expresión, probablemente representa el fenotipo de los ratones knockout cbx7. Un mecanismo similar es probable que participan en la carcinogénesis de pulmón humano desde Ciclina E regulación, asociado con la pérdida de expresión CBX7, se ha observado en la mayoría de los carcinomas de pulmón humano analizada [10].
El objetivo de la Este estudio ha sido investigar otros mecanismos por los que la pérdida de expresión CBX7 puede contribuir a la aparición de un fenotipo altamente maligno. En primer lugar, generamos clones de células de carcinoma de seis tiroideas en el que la expresión de CBX7 ha sido restaurados, y luego, mediante el uso de la poderosa técnica de hibridación de microarrays de oligonucleótidos, se analizó el perfil de expresión génica de la línea celular FRO en la que se restauró la expresión de CBX7, en comparación a la misma línea de células que no expresan CBX7.
Hemos encontrado que CBX7 era capaz de regular positivamente 120 genes y 196 genes regular negativamente. Entre ellos, se identificaron varios genes específicos efectoras, tales como SPP1 (que codifica la proteína de la osteopontina), cuya función se sabe que es esencial para la adquisición de un fenotipo totalmente maligno. experimentos de inmunoprecipitación de cromatina demostraron que la proteína CBX7 se une directamente a los promotores de estos genes regulados y estudios funcionales confirmó que la expresión CBX7 era capaz de modular los promotores de los genes CBX7 regulado. Por último, RT-PCR cuantitativa análisis mostró una correlación inversa entre CBX7 y sus reguladas por los genes y una correlación positiva con sus queridos hasta reguladas en muestras de tiroides y carcinoma de pulmón humano en diferente grado de malignidad.
En su conjunto , los datos presentados aquí indican que CBX7 controla positiva o negativamente la expresión de varios genes que codifican para proteínas que tienen un papel crítico en la progresión del cáncer humano.
Materiales y Métodos
Microarray análisis
GeneChip Human gene 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), que consta de 764,885 conjuntos de sondas que cubren más de 28.869 genes, se utilizó para evaluar los genes expresados diferencialmente. El procedimiento de hibridación entera se realizó siguiendo las instrucciones de Affymetrix. Los procesos de amplificación y etiquetado se verificaron usando un equipo de GeneChip eucariótica poli-A de Control de ARN (Affymetrix) con controles positivos exógenos. 15 g de cada preparación de biotina cRNA fue fragmentada y se coloca en mezcla de hibridación que contiene controles de hibridación con biotina (controles de expresión GeneChip hibridación, Affymetrix). Las muestras fueron luego hibridó en un GeneChip Human Gene 1,0 ST matriz a 45 ° C durante 16 horas a la rotación constante (60 rpm) en un horno de hibridación (Affymetrix). Microarrays imágenes escaneadas se obtuvieron con un escáner GeneChip (Affymetrix) utilizando la configuración predeterminada. Las imágenes se analizaron con Affymetrix gen Software de Análisis de Expresión (Affymetrix). Se realizaron comparaciones entre FRO-EV-1 y FRO-CBX7-1 muestras, teniendo en cuenta FRO-EV-1 como línea de base. Los valores de cambio veces, lo que indica el cambio relativo en los niveles de expresión entre FRO-EV-1 y FRO-CBX7-1, se utilizaron para identificar los genes expresados diferencialmente.
están disponibles en la base de datos ArrayExpress datos de microarrays (www .ebi.ac.uk /ArrayExpress) con el número de E-MTAB-2420.
muestras de tejidos humanos
Los tejidos de cáncer de tiroides humanos, los tejidos normales adyacentes o lóbulos contralaterales normales, obtenidos a partir quirúrgica especímenes, se recogieron en el Servicio de Patología d'anatomo-, Centro Hospitalario Lyon Sud, Pierre Bénite, Francia, de acuerdo con las directrices del comité de ética de este instituto, y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para realizar posteriormente la extracción del ARN.
"TissueScan en tiempo real de pulmón cáncer de la enfermedad Panel III" de cDNAs se adquirió de Origene (Origene Technologies Inc., Rockville, MD). Este panel de ADNc de cáncer de pulmón (HLRT103) contiene 8 muestras de pulmón normales y 40 muestras de cáncer de pulmón de diferente histotype, cuyas características clínico patológica están libremente disponibles en la siguiente dirección: http://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.
la extracción de RNA, PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) y análisis de microarrays
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares y tejidos utilizando el kit RNAeasy Mini (Qiagen, Valencia, CALIFORNIA). La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa. Para generar ADNc, se utilizó QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) para invertir-transcribir 1 g de ARN total de cada muestra. Se utilizó una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores aleatorios.
Real-Time PCR cuantitativa se llevó a cabo con el CFX 96 termociclador (Bio-Rad, Hercules, CA) en placas de 96 pocillos usando un volumen final de 20 l. Para la PCR se utilizó 10 l de 2 × SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 nM de cada cebador, y el ADNc generado a partir de 20 ng de RNA total. Los cebadores usados se indican en conjunto de datos S1. protocolo térmica fue la siguiente: 2 min 95 ° C; luego 45 ciclos de 20 s 95 ° C y 1 min 60 ° C. Cada reacción se llevó a cabo por duplicado y se empleó el 2
método -ΔΔCT para calcular niveles relativos de expresión [14]. G6PD se utilizó como gen de referencia.
Los cultivos celulares y transfecciones
células de carcinoma de tiroides FRO [15] disponibles en nuestro laboratorio y HEK 293 células (American Type Culture Collection, LGC Standards Srl, Sesto San Giovanni, Italia) se cultivaron en DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Life Technologies), 1% de glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) en un 5% de CO
2 atmósfera. FRO y HEK 293 células fueron transfectadas usando el reactivo Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) y de neón Sistema de electroporación (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Para generar CBX7 estable células que expresan, se seleccionaron las células transfectadas en un medio que contiene geneticina (Life Technologies), varios clones se seleccionaron y se expandieron para análisis adicionales. células CL3 tiroides PC normales de rata [16] se cultivaron en medio F12 modificado suplementado con 5% de suero de ternera (Life Technologies) y seis factores de crecimiento (hormona tirotrópica, la hidrocortisona, la insulina, la transferrina, la somatostatina y glicil-histidil-lisina; Sigma, St . Louis, MO). Las células PC CL3 fueron transfectadas con siRNA control y siRNA contra cbx7 rata como se informó anteriormente [11]. Se establecieron alfombrillas de fibroblastos de embriones (MEFs) a partir de ratones knockout cbx7, cultivadas y transfectadas (P3 y P4 pasaje) como se describe en otra parte [10].
extracción de proteínas y análisis de transferencia Western
extracción de proteínas y procedimiento de transferencia de Western se realizaron como se informó anteriormente [11]. Después de los procedimientos de electroforesis y transferencia, las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario en una habitación fría (4 ° C). Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa de rábano picante, 1:3000) durante 60 min (a temperatura ambiente) y se detectó la reacción con un western blot sistema de detección (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Los anticuerpos utilizados fueron anti-HA (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania), anti-CBX7 (sc-70232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, Reino Unido) , anti-His-sonda (sc-804, Santa Cruz Biotechnology), anti-Egr1 (sc-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Fos (sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Fos B (sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), γ anti-tubulina (sc-17787, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y anti-β-actina (clon AC-15 A5441, Sigma-Aldrich Co ., St. Louis, MO).
ensayo
La actividad de luciferasa
ensayo de transactivación de la luciferasa se realizó según lo informado en otras partes [11]. Una región que abarca 1000 pb aguas arriba del sitio de inicio tanscriptional (TSS) de los genes CBX7 reguladas (secuencias de cebadores están disponibles en conjunto de datos S1) se amplificó por PCR, y se insertó aguas arriba al marco de lectura abierto del gen de la luciferasa contenido en el pGL3 vector (Promega, Fitchburg, WI). Todos los constructos indicadores generados se verificaron para las mutaciones por secuenciación directa. vector de expresión CMV-β-galactosidasa se utilizó para normalizar la actividad de transfección de acuerdo con la actividad de galactosidasa. Proteína lisados se obtuvieron 36 horas después de la transfección de células HEK 293 y la actividad de luciferasa se midió para cada punto mediante el uso de un luminómetro Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) y el kit del sistema de luz doble (Life Technologies). Todos los ensayos se realizaron por duplicado y los resultados son la media de tres experimentos independientes.
ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
muestras de cromatina obtenidos a partir de células y tejidos se procesaron para la inmunoprecipitación de la cromatina como se informó en otro lugar [ ,,,0],10], [11]. Las muestras se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-CBX7 (ab21873, Abcam). No relacionados con IgG se utilizó como control negativo de la inmunoprecipitación. Para qPCR se utilizó 3 l de ADN IP 150 l de ADN de entrada y los valores fueron utilizados para normalizar los valores de las muestras de chip cuantitativos. Se calculó el porcentaje de entrada de acuerdo a la fórmula 2
3 ×? Ct, donde Ct es la diferencia entre Ct
entrada y Ct
IP [10]. Todos los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, y para cada experimento qPCR se realizó por triplicado. Las secuencias de los cebadores utilizados se presentan en conjunto de datos S1. El promotor del gen GAPDH humano y de ratón se utilizó como control negativo de la interacción CBX7 cromatina [4].
Ética
El Comité de Ética de la Facultad de Medicina y de la junta médica del estado del Centro hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Francia, estuvo de acuerdo en estas investigaciones, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes incluidos en este estudio.
los análisis estadísticos
el análisis estadístico se realizó mediante el uso Graph Pad Prism. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación entre dos grupos de experimentos. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar y las diferencias se consideraron significativas si p & lt; 0,05. Se obtuvieron distribución de QRT-PCR doble cambio valores relativos a cada gen en los carcinomas papilares de tiroides y los carcinomas de pulmón y representa mediante el uso de la caja y bigotes (mínimo al máximo) y el método de percentil. Para el análisis de correlación, se utilizaron los valores de cambio de doblez para construir diagramas de dispersión, para obtener una línea de tendencia y para calcular el valor de r de Pearson.
Resultados
Perfil de expresión génica de células de carcinoma de tiroides después de re- expresión de CBX7
para investigar el mecanismo por el que la pérdida de expresión CBX7 puede contribuir a la adquisición de un fenotipo maligno, que analiza el perfil de expresión génica de una línea celular de carcinoma de tiroides (FRO) en el que la expresión de CBX7 fue restaurada (FRO-CBX7, Figura 1A). ARN extraídos de FRO-EV-1 (un clon transfectado de forma estable con el vector vacío) y FRO-CBX7-1 clon, se hibridaron con una matriz de oligonucleótidos Affymetrix que contiene varios miles de transcripciones. El perfil de expresión de las células FRO-CBX7-1 luego se comparó con la de la FRO-EV-1. Varias transcripciones, produjeron cambiar en su nivel de expresión entre los FRO-CBX7-1 y FRO-EV-1 (Tabla 1 y 2, el cuadro S1 y S2). 53 transcripciones (17 hasta reguladas y 36 abajo reguladas) tenían un valor de factor de cambio absoluto mayor de 2,0 (Tabla 1 y 2), mientras que 263 transcripciones (103 hasta reguladas y 160 las reguladas) muestran un valor absoluto cambio veces compuestas 1,5 a 2,0 (Tabla S1 y S2). Como control de análisis de microarrays, se observó que CBX7 fue altamente expresado en el FRO-CBX7-1 (Tabla 1).
A) CBX7 expresión se evaluó por análisis de QRT-PCR en FRO (en peso), y varios FRO-EV (vector vacío) y FRO-CBX7 clones de células. Los valores se expresan como la expresión relativa con respecto a la muestra FRO que se estableció igual a 1. B, C) Los genes regulados CBX7 seleccionados se analizaron mediante análisis de QRT-PCR en FRO (en peso), y varios FRO-EV y FRO- clones de células CBX7. FOS, FOSB y la expresión del gen EGR1 fue más abundante en clones de células FRO-CBX7 que en las células FRO-EV, por el contrario, SPP1, SPINK1 y expresión STEAP1 fue menos pronunciado en las células FRO-CBX7 en comparación con el FRO-EV y FRO (wt ) Células. Los valores se expresan como la expresión relativa con respecto a la muestra FRO que se estableció igual a 1. D) La expresión de FOS, FOSB y EGR1 se evaluó en un clon FRO-CBX7 celular (FRO-CBX7-1), uno FRO-EV (FRO-EV-1) y las células de tipo salvaje FRO. ß-actina se evaluó como control de carga. Las flechas indican las bandas correspondientes a los FOS y EGR1.
Entre los genes regulados por CBX7 en células de carcinoma de tiroides humanos nos hemos centrado nuestra atención en FOS, FOSB y EGR1 (Tabla 1) que son regulados positivamente, y SPP1, SPINK1 y STEAP1 (Tabla 2), que fueron, por el contrario, regulada negativamente por CBX7, ya que se sabe que estos genes juegan un papel relevante en la adquisición de un fenotipo maligno totalmente. De hecho, FOS, FOSB y EGR1 son proteínas que han sido reportados como las reguladas en varios carcinomas humanos que sugieren un papel crítico de estas proteínas en la progresión del cáncer [17] - [19]. Por otro lado, SPP1, SPINK1 y STEAP1 son proteínas que están regulados en varios carcinomas humanos y su sobreexpresión se asocia también a la progresión del cáncer [20] - [22]. Se evaluó la expresión de estas transcripciones de QRT-PCR en varios clones que expresan FRO CBX7 (Figura 1B y C) en comparación con los clones FRO-EV y con las células FRO (WT). Para todos ellos, el análisis de QRT-PCR confirmó la expresión diferencial asociada con la expresión de la proteína CBX7 (Figura 1B y C). Además, los experimentos de Western blot confirmó un incremento en la expresión de las proteínas FOS, FosB y EGR1 en un clon de células que expresan establemente FRO CBX7 (FRO-CBX7-1) en comparación con FRO-EV (FRO-EV-1) y las células FRO en peso ( Figura 1D).
Análisis de los genes regulados CBX7 en células de la tiroides de rata y MEF expresar o no el gen cbx7
a continuación comprobado si los genes expresados diferencialmente en las células FRO-CBX7 mostró una la expresión diferencial también en MEFs aislados de ratones knockout cbx7 [10]. Como se muestra en la Figura 2, el análisis de QRT-PCR confirmó la modulación de los genes CBX7 reguladas seleccionados también en este sistema de células, de hecho, no se encontraron genes regulados positivamente por cbx7 abajo-regulada en cbx7
- /- MEFs (Figura 2A), mientras que los genes regulados negativamente por cbx7, se encontraron hasta reguladas en el cbx7
- /- MEF, en comparación con cbx7
+ /+ MEFs (Figura 2B). experimentos de Western blot mostraron que la expresión de fos y proteínas Egr1 disminuye en cbx7
- /-. MEFs, si se compara con cbx7
+ /+ MEFs (Figura 2D)
El análisis cuantitativo de RT-PCR se realizó para analizar los niveles de expresión de los genes regulados por cBX7 en cbx7
+ /+ y cbx7
- /- MEF. Los valores se expresan como la expresión relativa con respecto a la cbx7
+ /+, que se ajusta igual a 1. A) Fos, FosB y EGR1 fueron menos expresado en cbx7
- /- MEFs en comparación con el cbx7
+ /+ MEFs. B) En los genes contrario, SPP1, SPINK1 y steap1 se expresa en más MEFs cbx7
- /- en comparación con los MEFs cbx7
+ /+. C) Cbx7
- /- MEFs fueron transfectadas transitoriamente con un vector que expresa cbx7 ratón de mamíferos (myc-His-etiquetados) mRNA (cbx7
- /- R). Restauración de expresión cbx7 es capaz de revertir el fenotipo de la cbx7
- /- MEFs (A, B). Los valores se expresan como la expresión relativa con respecto a la cbx7
+ /+, que se ajusta igual a 1. D) La expresión de fos y proteínas Egr1 se evaluó mediante Western blot en MEFs obtenidos de cbx7
- /- los ratones en comparación con cbx7
+ /+ MEFs. β-actina se evaluó la expresión de normalizar la carga de proteínas
La restauración de la expresión génica en cbx7 cbx7
-. /- MEFs (Figura 2C) condujeron a un aumento de la expresión de fos, y FosB EGR1 (Figura 2A) y una disminución en la expresión de SPINK1, SPP1 y steap1 (Figura 2B) confirmando la regulación de estos genes de expresión CBX7.
a fin de verificar el papel de CBX7 en la modulación de estos genes, se evaluado su expresión en la línea celular de tiroides de rata normal PC Cl3 en el que la síntesis de cbx7 fue suprimida por la interferencia de ARN. El silenciamiento del gen cbx7 verificadas a varias horas después del tratamiento siRNA (Figura 3A), dio como resultado la reducción de la CBX7 genes regulados positivamente (Figura 3B) y en un aumento de la expresión de la CBX7 genes regulados negativamente (Figura 3C), en comparación con las células no tratadas o los tratados con el control no silenciar siRNA (codificado).
A) células PC CL3 fueron transfectadas transitoriamente con pequeños ARN de interferencia (siRNA) contra el ARNm cbx7 rata. Después de la transfección podemos observar una caída eficiente de los niveles de mRNA cbx7, tal como se evaluó mediante análisis de QRT-PCR. B, C) la expresión de genes regulados CBX7 se evaluó mediante qRT-PCR en células de rata PC CL3 después de la transfección con ARNip cbx7 rata. La expresión se evaluó 48 horas después de la transfección. Los valores se expresan como la expresión relativa con respecto a las células PC transfectadas con CL3 un control no silenciamiento siRNA (codificado), que se ajusta igual a 1.
CBX7 se une a promotores de genes regulados y modula su
actividad
Para evaluar si CBX7 estuvo directamente involucrado en la expresión diferencial de estos genes
in vivo
, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP). Entonces, FRO-EV-1-FRO CBX7-1 células y fueron reticulado y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-CBX7 o IgG. La inmunoprecipitación de la cromatina se analizó posteriormente por qPCR utilizando cebadores que abarcan la región de estos genes promotor (conjunto de datos S1). Los resultados mostrados en la Figura 4A demuestran que CBX7 era capaz de unirse a estos promotores. De hecho, los anticuerpos anti-CBX7 precipitaron región del promotor de estos genes en células FRO-CBX7-1, en comparación con Para-EV-1 en las células (Figura 4A). Por otra parte, no se observó el enriquecimiento en muestras inmunoprecipitadas con IgG de conejo normal y cuando se utilizaron cebadores para el promotor de control de GAPDH humano, lo que indica que la unión es específica para estos promotores (Figura 4A). El mismo resultado se logró utilizando la cromatina obtenido a partir de células HEK 293 transfectadas transitoriamente con el vector de expresión CBX7 (Figura S1).
A) células FRO-EV-1 y FRO-CBX7-1 se sometieron a un chip de ensayo usando anticuerpos contra CBX7. Como controles negativos, se utilizaron anticuerpos IgG no relacionados. El ADN asociado se amplificó por qPCR usando cebadores específicos para el promotor del gen correspondiente y, como control de especificidad de chips, cebadores que reconocen el promotor del gen GAPDH humano. B) obtenidos a partir de MEFs cbx7
+ /+ y cbx7
- /- se analizaron para la unión de la proteína cbx7 a los promotores de los genes regulados. Como controles negativos, se utilizaron anticuerpos IgG no relacionados y, como control de especificidad de chip, se utilizaron cebadores que reconocen el promotor del gen de ratón GAPDH. Los datos son reportados como entrada por ciento y se calcularon utilizando la siguiente fórmula: 2
3 ×? Ct, donde Ct es la diferencia entre Ct
entrada y Ct
IP
. para confirmar la unión de la proteína endógena CBX7 a los promotores de estos genes, se aprovechó también MEFs y tejidos obtenidos a partir del ratón knockout cbx7 [10]. chip experimentos se realizaron en MEFs tejidos, riñón y bazo obtenidas de cbx7
+ /+ y cbx7
- /- ratones. Los anticuerpos anti-CBX7 fueron capaces de reconocer cbx7 endógeno y para precipitar la cromatina de cbx7
+ /+ pero no de cbx7
- /- MEFs (Figura 4B) y tejidos (Figura S2) que confirman la unión de cbx7 endógeno a estas regiones promotoras. Estos experimentos chip, por lo tanto, indican que CBX7 interacciona físicamente con las regiones promotoras de estos genes
in vivo
, por lo tanto, la modulación de su expresión directa.
Posteriormente, para evaluar el efecto de la expresión en la CBX7 la transcripción de estos genes regulados, las células HEK 293 fueron transitoriamente co-transfectadas con el vector de expresión que codifica CBX7 y con un vector indicador que lleva el gen de la luciferasa bajo el control de una región promotora 1.000 pb situado aguas arriba de la SAT de cada uno de estos genes. Como se muestra en la Figura 5, CBX7 aumenta la actividad transcripcional de FOS, FOSB y promotores EGR1 (Figura 5A), mientras que reprime la actividad transcripcional de SPP1, SPINK1 y promotores STEAP1 (Figura 5B). Por otra parte, los efectos de CBX7 en estos promotores fue dependiente de la dosis. Por lo tanto, la viruta y de luciferasa de experimentos de ensayo indican que CBX7 es capaz de regular directamente la transcripción de los genes regulados CBX7 seleccionados mediante la unión a sus promotores.
Células
HEK 293 fueron transitoriamente co-transfectadas con cantidades crecientes de expresión CBX7 vector y una cantidad constante de vector que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de los promotores de genes regulados por la CBX7. Cantidades crecientes de CBX7 cumplir la expresión del gen informador bajo el control de los FOS, FosB y EGR1 regiones promotoras (A), mientras que reprimen la actividad del gen informador bajo el control de la SPP1, promotores SPINK1 y STEAP1 (B). La actividad relativa de la expresión de luciferasa de luciérnaga se normalizó a un control de transfección, utilizando β-galactosidasa. Las barras de escala representan la media ± SD (n = 3).
La expresión de los genes regulados CBX7 se correlaciona con la expresión CBX7 también en los carcinomas humanos
Dado que los resultados anteriores mostraron que expresión CBX7 se redujo en la tiroides, colon y pulmón carcinomas [4], [5], [10], con los niveles de expresión casi completamente indetectables en los cánceres de tiroides más avanzados, la hipótesis de que la pérdida del gen CBX7 podrían estar involucrados en las etapas avanzadas de carcinogénesis tiroides por la consiguiente modulación de estos genes. Por lo tanto, se analizaron CBX7 y los genes regulados CBX7 seleccionados en los carcinomas de tiroides y pulmón humano por QRT-PCR. En lo que se refiere a los carcinomas papilares de tiroides, FOS, FOSB y los genes EGR1 se redujeron regulado, como CBX7, mientras SPP1, SPINK1 y STEAP1 fueron reguladas (Figura 6A). De igual modo, el análisis de la expresión de estos genes en los carcinomas de pulmón mostró el mismo comportamiento (Figura 6B). El análisis de correlación en PTC y los carcinomas de pulmón (Pearson r) mostró la correlación entre CBX7 y sus genes regulados (PTC: FOS, p = 0,0438; carcinomas de pulmón: FOS, P & lt; 0,0001; FOSB, p & lt; 0,0001; EGR1, p & lt; 0,0021 , Figura S3 y S4).
Se analizó la expresión de CBX7, FOS, FOSB, EGR1, SPP1, SPINK1 y STEAP1 de QRT-PCR en carcinomas papilares de tiroides (PTC) (a) y muestras de carcinoma de pulmón humano (SEGUNDO). La expresión de FOS, FOSB y EGR1 es regulada hacia abajo, ya que se produce para CBX7, en los tejidos neoplásicos con respecto a las contrapartes normales. Por el contrario, la expresión de SPP1, SPINK1 y STEAP1 fue hasta reguladas en las muestras neoplásicas con respecto a los tejidos normales, que muestra una tendencia opuesta si se compara con la de CBX7. la expresión de genes regulados-CBX7 resultados se expresan como el cambio veces (para PTC) o expresión relativa (para los carcinomas de pulmón) con respecto a un grupo de muestras normales que se establece igual a 1. El rango de variabilidad de CBX7 y normal de la tiroides y pulmón tejidos fue menor que 10%.
por lo tanto, estos datos sugieren fuertemente que la pérdida de la expresión de genes CBX7 podría contribuir a la aparición de un fenotipo maligno mediante la modulación de un conjunto de genes críticos para la etapa de progresión de la carcinogénesis.
Discusión
se ha observado previamente que la expresión CBX7 reducida se asocia con varios carcinomas humanos, y la pérdida completa de su expresión se correlaciona con las fases más avanzadas de malignidades [5] - [10]. Por lo tanto, es razonable plantear la hipótesis de que la pérdida de expresión de CBX7 puede jugar un papel clave en la progresión del cáncer. Consistentemente, CBX7 es capaz de contrarrestar la disminución de expresión del gen de la E-cadherina cuya pérdida de expresión representa una característica de la transición epitelial-mesenquimal [11], que juega un papel crítico en el mantenimiento de la morfología celular epitelial normal [12], [13] .
con el fin de comprender mejor el papel de la pérdida de la expresión de genes en la progresión del cáncer CBX7 nuestro trabajo tuvo como objetivo identificar los genes regulados por CBX7. Luego, utilizando un microarray de Affymetrix cDNA, se analizó el perfil de expresión génica de células de carcinoma de tiroides en los que se restauró la expresión CBX7, y se identificaron varios genes arriba y hacia abajo reguladas. Entre los genes regulados por CBX7 nos centramos nuestra atención en FOS, FOSB y EGR1.
FOS y FOSB son miembros de la AP-1 (proteína activadora de 1) complejo y son capaces de interactuar con los miembros de la familia junio [23]. FOS se ha implicado principalmente en la transducción de señales, la diferenciación celular y la proliferación [24]. Muchos estudios informaron que los FOS modula varios genes importantes para la génesis tumoral, provocando la baja regulación de los genes supresores de tumores [25] y que conduce a un crecimiento invasivo de las células del cáncer [26]. Sin embargo, algunos estudios más recientes sugieren que los FOS también puede tener actividad supresora de tumores y podría tener una función en la apoptosis [17], [27].
Además de FOS, FOSB también se ha demostrado que tienen una función en la progresión de diversos tipos de tumores de ser regulada hacia abajo en carcinomas mamarios pobremente diferenciados [18]. A la inversa, FOSL-1 y FOSL-2, cuya sobreexpresión conduce a la motilidad de las células tumorales mejorada y la invasión en el cáncer de mama, cáncer colorrectal y el mesotelioma [28], no fueron regulados por CBX7 (datos no mostrados).