Extracto
A pesar de la inflamación crónica, lesiones psoriásicas casi nunca se convierten en cáncer de piel. función aberrante del gen CCHCR1 (espiral de la bobina α-helicoidal de proteína varilla 1, HCR) dentro del locus PSORS1 puede contribuir a la aparición de la psoriasis. Como CCHCR1 se expresa en ciertos tipos de cáncer y regula la proliferación de queratinocitos (KC) en un modelo de ratón transgénico, hemos estudiado su relación con la proliferación en el cáncer cutáneo de células escamosas (SCC) las líneas celulares de arrays de expresión y RT-PCR cuantitativa y en tumores de la piel mediante técnicas de inmunohistoquímica . CCHCR1 proteína se detectó en la frontera de empuje de SCC y el revestimiento islas de carcinoma de células basales. Diferente de la psoriasis, Ki67 tenía un patrón de expresión similar a la CCHCR1. La tinción más intensa CCHCR1 se produjo en áreas positivas para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La expresión de ARNm se upregulated CCHCR1 30-80% en las líneas de SCC en comparación con los KC normal y una correlación positiva con la expresión de Ki67. Las líneas celulares de tumores más agresivos e invasivos (RT3 Fadu) expresaron ARNm CCHCR1 menos de células HaCaT no tumorigénicas. Por otra parte, el ácido ocadaico los promotores tumorales y menadiona downregulated CCHCR1 ARNm. Llegamos a la conclusión de que tanto en la psoriasis y las primeras etapas de transformación KC, CCHCR1 puede funcionar como un regulador negativo de la proliferación, pero más allá de un cierto punto en la oncogénesis no puede controlar este fenómeno por más tiempo
Visto:. Suomela S, Elomaa O, Skoog T, Ala-aho R, Jeskanen L, Pärssinen J, et al. (2009) CCHCR1 Is Up-regulada en el cáncer de piel y asociado con la expresión de EGFR. PLoS ONE 4 (6): e6030. doi: 10.1371 /journal.pone.0006030
Editor: Benjamin Rich, Instituto de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Diciembre, 2008; Aceptado: 21 de mayo de 2009; Publicado: 24 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Suomela et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Academia de Finlandia (US-K. concesión no. 115590, SS subvención no. 122236, AR y VM.K. subvención no. 114409, LL concesión no. 108828), la Fundación Sigrid Juselius (US-KJK, VM .K.), el Fondo de investigación del hospital Universitario de Helsinki (TYH 7113), La Fundación finlandesa de investigación del cáncer (VM.K.) y el Programa Marco de la Unión Europea 6 (LSHC-CT-2003 a 503297) (AR y VM.K.) , Turku hospital central de la Universidad EVO subvención (13336 proyecto), y el finlandés Sociedad Dermatológica (SS), Finlandia, el Consejo Sueco de Investigación (US-K., JK) y la Fundación de cáncer de Suecia (US-K., JK), y Finsen- Fundación Welander (TS), Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hemos demostrado previamente que el gen CCHCR1 dentro del locus importante PSORS1 susceptibilidad psoriasis puede funcionar como un regulador negativo de la proliferación de KC [1] - [3]. El gen codifica una proteína CCHCR1 ácido amino 782 (GenBank AY029160) [4] que se expresa de forma diferente en la piel psoriásica lesional en comparación con la piel normal: lesionally CCHCR1 localiza en KC basales y suprabasales donde la epidermis se encuentra en su más delgado. La tinción para el marcador de proliferación de las células Ki67 muestra correlación inversa a CCHCR1 en lesiones de psoriasis, consistente con un papel en la proliferación KC [1], [4]. Además, nuestro modelo de ratón que sobreexpresa el alelo de riesgo psoriasis CCHCR1 * WWCC bajo queratina 14 promotor muestra deterioro de la capacidad de proliferación de KC [3], lo que sugiere proteína menos activo activador 1 (AP-1) de señalización mediada en los ratones de riesgo. la señalización mediada por AP-1 regula los genes asociados con la proliferación celular, incluyendo EGFR también conocido como ErbB1 [5].
lesiones de psoriasis casi nunca progresan a cáncer de piel a pesar de la inflamación crónica que a menudo es un factor de riesgo para el cáncer [6] , [7]. Tanto la psoriasis y el cáncer de la piel se caracterizan por la proliferación incontrolada KC además de la angiogénesis y la inflamación. La proliferación celular y la diferenciación pueden ser mediados a través de la señalización de EGFR [8]. ligandos de EGFR múltiples (TGF-alfa, anfirregulina, factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina) se sobreexpresa en las lesiones de psoriasis, y la expresión transgénica del gen anfirregulina humana induce un fenotipo psoriasis-como [8]. la señalización de EGFR también se ha implicado en la patogénesis de cáncer de piel no melanoma [8] - [10]. Curiosamente, tanto la mejora y la exacerbación de la psoriasis se han reportado en asociación con el tratamiento del cáncer de tirosina quinasa de EGFR inhibidor [11], [12].
En nuestros estudios anteriores, se detectó la expresión CCHCR1 en células no proliferantes de mama y pulmón adenocarcinomas: se ha detectado el marcador de la hiperproliferación Ki67 en adyacente, pero no en las mismas células que CCHCR1 [1]. Por otra parte, EGF regula up-expresión de la proteína en células HaCaT CCHCR1 [2]. Para comprender mejor la función de CCHCR1 en la transformación de KC y cáncer de piel, se estudió su expresión en lesiones premalignas y malignas escamosas y carcinoma de células basales (BCC). Como EGFR y su objetivo abajo de ciclina D1-están involucrados en el desarrollo del cáncer y posiblemente afectadas por las vías CCHCR1 putativos, se analizó su expresión en comparación con CCHCR1. La relación de CCHCR1 a KC hiperproliferación se destacó por tinción de muestras adyacentes con el anticuerpo Ki67. También se estudió la correlación del nivel de expresión CCHCR1 a los de Ki67 y EGFR en cultivos de células con diferentes proliferativa y características invasoras. los niveles de mRNA CCHCR1 se determinaron en cultivos HaCaT incubadas con diversos agentes bioactivos con importancia en la promoción del tumor, el estrés oxidativo o la inflamación psoriásica. Finalmente, los niveles de expresión de CCHCR1, Ki67, y EGFR mRNAs se determinaron en un microarray de oligonucleótidos de líneas de células SCC cutáneas y líneas celulares KC epidérmicos humanos normales. Nuestros resultados sugieren que CCHCR1 se expresa en los cánceres de piel no melanoma en asociación con EGFR y Ki67 en vivo. Sin embargo, en el cultivo celular las células más atípicas expresan CCHCR1 menos de células inmortalizadas HaCaT, y la promoción del tumor y la proliferación inducida de células HaCaT se correlaciona con la expresión CCHCR1 reducida.
Resultados
CCHCR1 se expresa en SCC en asociación con EGFR, ciclina D1, y Ki67
para estudiar el papel de CCHCR1 en la proliferación y la transformación KC, se investigó la expresión de proteínas CCHCR1 por inmunohistoquímica en diferentes tumores de la piel en relación con EGFR, su objetivo abajo ciclina D1, y el marcador de la hiperproliferación Ki67. CCHCR1 células positivas estaban presentes en los CE 20/22 estudiados. células cancerosas proliferativas en el frente invasivo expresaron CCHCR1 (Figura 1A, D, G, S1; la Figura 2A, C, E), mientras que las células de cáncer de cohesión en el medio eran CCHCR1 negativo. consecuencia infiltrativa era típico de las zonas CCHCR1 positivos, sin embargo, las células atípicas fueron heterogéneos para la expresión CCHCR1 (Figura 2A). expresión CCHCR1 en SCC se asoció con la tinción de EGFR positivo en todas las muestras (Figura 1A, C, D, F). Los nidos CCHCR1 cáncer positivo en la dermis inferior eran ciclina D1-positivos, así (Figura 2C-F). Las células positivas para el marcador Ki67 hiperproliferación se encuentra principalmente en las mismas áreas que las células CCHCR1 positivos (Figura 1 B, E; 2B). Sin embargo, en el grado III SCC Ki67 era más abundantemente presente también en las zonas tumorales cohesivos que carecían de expresión CCHCR1 (datos no mostrados). A modo de comparación, una muestra normal de la piel se muestra con los KC basal positivo para CCHCR1 y EGFR, y esparció la positividad para Ki67 (Figura 1H-J).
Las secciones seriadas de grado I SCC (A-C) y normal de la piel (H-J) se immunostained con anticuerpos contra CCHCR1, Ki67, y EGFR. aumentos más altos de A-C también se muestran (D-F, respectivamente). tinción CCHCR1 (G) en una sección adyacente a la tinción de EGFR (F). proteína CCHCR1 (A) se expresa en células de cáncer de proliferación en el frente invasivo de islas de células de cáncer dérmico de un SCC en asociación con el marcador de la hiperproliferación Ki67 (B) y EGFR (C). Las células positivas para Ki67 (E) expresan CCHCR1 (D). tinción de EGFR (F) se asocia con tinción CCHCR1 (G) en las secciones adyacentes. muestras de piel normales expresan CCHCR1 (H) y EGFR (J) en KC basal, mientras que la expresión de Ki67 (I) es más escasa. Las flechas apuntan en las posiciones ilustrativos.
Las barras de escala: Read (A-C) 50 micras; (D-G) 12,5 micras; (H-J) 25 micras.
Las secciones seriadas de grado III (A, B) y grado II (C, D) SCC se tiñeron con los anticuerpos indicados. Mayor aumento de otro SCC grado II (E, F). En el grado III SCC (A, B), la expresión de CCHCR1 es heterogénea: muchas, pero no todas, las células de cáncer expresan tanto CCHCR1 (A) y Ki67 (B). Los recuadros muestran baja magnificación de la misma región, asterisco señala una célula de cáncer con CCHCR1 negativa y la expresión de Ki67. En el grado II SCC (C, D), consecuencia infiltrante es CCHCR1 positivo (C), y los nidos de cáncer positivo CCHCR1 son también ciclina D1-positivos (D). Las secciones adyacentes de grado II SCC (E, F) muestran asociación de CCHCR1 y ciclina D1-células positivas. Las flechas indican las áreas correspondientes.
Las barras de escala: Read (A, B, E, F) 12,5 micras; (C, D), inserciones 50 micras.
CCHCR1 se expresa por las células cancerosas en empalizada en BCC
En BCC, CCHCR1 se expresó sobre todo en el citoplasma de las células cancerosas en empalizada de las islas de carcinoma bien definidos (Figura 3 a, C). Tres de cada 15 muestras eran BCC esclerosante, pero CCHCR1 no fue más abundante en ellos (datos no mostrados). CCHCR1 se expresó en un patrón granular en siete muestras (Figura 3A, C) co-localización con EGFR (Figura 3B, D). Las cinco muestras estudiadas fueron de ciclina D1 positivo: sin embargo, su expresión no era tan fuerte como la de CCHCR1 y más concentrada en el centro de los nidos tumorales (datos no mostrados). la expresión citoplasmática de CCHCR1 en los KC basal en la piel de aspecto normal adyacente a la zona de BCC varió entre las muestras. la expresión de EGFR fue mayor en KC basal de la piel normal que en empalizada células en la mayoría de las muestras.
secciones seriadas de BCC (A, B) se tiñeron con anticuerpos contra CCHCR1 y EGFR. aumentos más altos de A y B también se muestran (C, D, respectivamente). proteína CCHCR1 se expresa en un patrón granular en el citoplasma de las células de cáncer de empalizada de un BCC nodular (A, C). CCHCR1 expresión (C) co-localiza con la tinción de EGFR (D). CCHCR1 y EGFR también se expresan en KC basal (A, B). Las flechas muestran las posiciones correspondientes.
Las barras de escala: Read (A, B) 50 micras; (C, D) 25 micras.
Para estudiar si CCHCR1 y EGFR co-localizar también en el nivel celular, las células transfectadas transitoriamente con un constructo HaCaT CCHCR1 y se visualizaron CCHCR1 y la expresión de EGFR con inmunofluorescencia. CCHCR1 expresión se detectó como un patrón frente al citoplasma en forma de anillo, mientras que la expresión de EGFR fue más o menos unido a la membrana y no co-localizar con la tinción CCHCR1 (Figura 4A-D). Transfectadas y las células no transfectadas mostraron la expresión de EGFR similares, lo que sugiere que CCHCR1 no influye en la expresión de EGFR o la localización (Figura 4B).
CCHCR1 transfectaron células HaCaT (A-D) teñidas con anticuerpos contra CCHCR1 (A) y EGFR (B). Superposición de A y B se muestra en (C), y tinción con DAPI que muestra núcleos en (D). Las células que expresan CCHCR1 (verde) también fueron positivos para EGFR (rojo), pero las dos proteínas no lo hicieron co-localizar (C). CCHCR1 positivo (flecha) y negativo (cabeza de flecha) muestran la expresión de EGFR células similares que sugieren que la sobreexpresión CCHCR1 no afecta a la expresión de EGFR (B).
expresión CCHCR1 en queratoacantomas está asociada con la infiltración de linfocitos
Queratoacantoma (KA), histológicamente una neoplasia maligna, pero comportarse de una manera benigna, a menudo se considera una lesión "precursor" de SCC. Kas generalmente mostró tinción positiva CCHCR1 especialmente en KC de la frontera de empuje en las zonas con un prominente infiltrado de linfocitos que rodean el tumor (Figura 5A, C). células EGFR-positivas estaban presentes en las mismas áreas en las muestras estudiadas (Figura 5 B, D). En el área CCHCR1 positivo, la expresión de Ki67 también se encontró en las tres muestras, pero con menor intensidad que en los CE (Figura 5E, F).
Las secciones seriadas de KA (A, B, E, F) eran teñidas con los anticuerpos contra CCHCR1 y EGFR (A, B) o en contra de CCHCR1 y Ki67 (e, F). aumentos más altos de A y B se muestran (C, D, respectivamente). La frontera de empuje de un KA es CCHCR1 positivo (A) co-localización con EGFR (B). Otra muestra se muestra (E) con un prominente infiltrado de linfocitos y la expresión CCHCR1 citoplásmica de las células del borde de empuje. Más escasa expresión de Ki67 (F) se define a las mismas áreas pero no necesariamente a las mismas células. Las flechas indican las posiciones correspondientes.
Las barras de escala: Read (A, B, E, F) 50 micras; (C, D) 12,5 micras.
enfermedad de Bowen y la queratosis actínica expresan CCHCR1 en zonas espongióticas e inflamatorias
La espongiosis, infiltrado inflamatorio, proliferación capilar y se asociaron con la expresión CCHCR1 en 11 /21 enfermedad de Bowen (SCC in situ) muestras (Figura 6 a, B). Zonas que carecen de la inflamación y espongiosis expresaron menos CCHCR1 (Figura 6C), tampoco lo fue CCHCR1 expresión asociada a KC atipia. En la enfermedad de Bowen, la tinción citoplásmica CCHCR1 se encontró basalmente y suprabasally en papilas dérmicas (Figura 6B) se asemeja a CCHCR1 tinción de la piel lesionada psoriática (Figura 6E), especialmente en muestras hipertróficas. También la expresión de EGFR en la enfermedad de Bowen se parecía al patrón de expresión de CCHCR1 (Figura 6D). En la psoriasis, la expresión CCHCR1 fue más intensa en las zonas con menos KC positivos Ki67 (Figura 6F). Ocho de 11 estudiados queratosis (AK) especímenes actínica tenían CCHCR1 basal positivo o suprabasal KC (Figura 6G). CCHCR1 células positivas se encuentran a menudo en regiones con espongiosis o inflamación.
Secciones de la enfermedad de Bowen (A-D) a inmunotinción con anticuerpos contra EGFR CCHCR1 y como se indica. Las secciones seriadas de la psoriasis (E, F) se tiñeron con anticuerpos para CCHCR1 y Ki67. muestras AK (G, H) se tiñeron con anticuerpos CCHCR1. En la enfermedad de Bowen (A, B), espongiosis, infiltrado inflamatorio, y la proliferación capilar se asocian con la expresión CCHCR1 mientras que las áreas que carecen de la inflamación y espongiosis expresar menos CCHCR1 (C). la expresión de EGFR (D) en basal y suprabasal KC de asociados papilas dérmicas con expresión CCHCR1 (B). También en psoriasis (E), CCHCR1 se expresa basalmente o suprabasally (flechas) que recubre las papilas dérmicas (dp), mientras que las crestas epiteliales (RR) que sobresalen en la dermis son casi negativo para CCHCR1. En contraste, la expresión de Ki67 (F) se localiza en regiones que son casi negativo para células CCHCR1 (puntas de flecha). muestras AK (G) expresan CCHCR1, basales y suprabasally en asociación con KC heterogeneidad, espongiosis o inflamación pero las áreas adyacentes con menos inflamación o espongiosis mancha (H), sólo débilmente.
Las barras de escala: gratis (A-D) 50 micras; (E, F) 25 micras; (G, H) de 12,5 micras.
Expresión de CCHCR1 está regulado y se correlaciona con la expresión de Ki67 de SCC líneas celulares cutáneas
A continuación, se compararon los perfiles de expresión de mRNA CCHCR1 , EGFR, Ki67, y la ciclina D1-en diferentes líneas celulares de SCC cutáneas (cinco primaria y tres metastásico), mediante la realización de experimentos de Affymetrix. El perfil de expresión basado microarrays de oligonucleótidos mostró que el gen CCHCR1 se expresa en células SCC (figura 7A). Los niveles de señal de la sonda fija CCHCR1 eran hasta un 80% mayor en las líneas de células SCC cutáneas (n = 8) que en el de la epidermis humana normal KC (n = 5), pero no hubo diferencias marcadas en CCHCR1 niveles de expresión entre primaria y líneas de SCC metastásico. Los niveles de expresión en las líneas celulares de SCC fueron variables, pero los niveles medios mostraron un ligero aumento (de 30%; p & gt; 0,05) en comparación a KCS normal cuantitativa en tiempo real RT-PCR (TaqMan) (Figura 7C). Los niveles de señal de la sonda fija Ki67 fueron de 3-4 veces mayor en SCC líneas celulares que en los KC epidérmicas normales (Figura 7A). Esta observación también se confirmó mediante TaqMan PCR (Figura 7D). Es importante destacar que los niveles de expresión de CCHCR1 correlacionados con los niveles de Ki67 en los datos de microarrays (Figura 7B). Se observó una ligera correlación (R = 0,46) entre los niveles de ARNm de CCHCR1 y Ki67 en los datos TaqMan, así (Figura 7E). Los niveles de expresión de ARNm del EGFR en los SCC líneas celulares eran entre el 80% y el 180% de los niveles normales de expresión KC en 4 de los 8 conjuntos de sonda (Figura 7A). Ambos conjuntos de sondas de ciclina D1-estaban presentes en todas las líneas celulares y los niveles de señal medias fueron hasta un 60% mayor en las líneas celulares de SCC en comparación con los KC normal. CCHCR1 tenía una ligera correlación negativa con el nivel de expresión de EGFR, pero no se detectó ninguna correlación entre CCHCR1 y ciclina D1 (datos no mostrados)
.
A) Ki67, EGFR, ciclina D1-y CCHCR1 perfil de expresión génica de cinco epidérmica normal de KC y ocho líneas de células cutáneas (SCC mapa de calor). Los valores de señal de la sonda fija se compararon con los valores de la señal media de cada sonda establecidos en los KC. El colorante se basa en los valores log2 del cambio en los valores de la señal. Los genes regulados se muestran en rojo y genes regulados se muestran en verde. B) Correlación entre CCHCR1 y conjuntos de sonda Ki67 se calculó entre los valores de la señal de uno CCHCR1 y una sonda Ki67 establecidos en el HG-U133 Plus 3,0 array. coeficiente de correlación de Pearson R = 0,88. C) CCHCR1 y D) Ki67 los niveles de mRNA de expresión en las líneas celulares de SCC normales KCS y cutáneas como medidos por qRT-PCR (TaqMan). Los niveles de expresión de CCHCR1 y Ki67 en las líneas celulares de KCS y SCC normales fueron analizados por QRT-PCR y corregidos por los niveles de ARNm de beta-actina en las mismas muestras. E) La correlación entre CCHCR1 y conjuntos de sonda Ki67 se calculó entre los valores de la señal de los niveles de mRNA CCHCR1 y Ki67. coeficiente de correlación de Pearson R = 0,46.
ácido okadaico y menadiona regular a la baja la expresión CCHCR1 mRNA en células HaCaT
Con el fin de determinar si los diferentes agentes bioactivos alteran la expresión de ARNm CCHCR1, se trataron células HaCaT cultivos con promotores de tumores, inductores de estrés oxidativo, y agentes implicados en la inflamación psoriática. ácido okadaico (OA) y la menadiona, ambos compuestos muestran para promover tumores in vivo e inducir el estrés oxidativo, downregulated niveles CCHCR1 de mRNA en células HaCaT de hasta 10 veces con aumento de la dosis (OA) y 3 veces (menadiona) (Figura 8A) . los niveles de ARNm de EGFR y Ki67 de OA y las células HaCaT tratada menadiona se downregulated así (Figura 8B, C). tratamientos menadiona o OA no alteraron esencialmente la expresión de la casa de mantenimiento de GAPDH gen en las células HaCaT, lo que sugiere que estos agentes no afectaron la viabilidad de las células. Los promotores de tumores 12-forbol-13-miristato-acetato (PMA) y estaurosporina o el tamoxifeno anti-estrógeno, H
2O
2 la producción de estrés oxidativo, la leptina, IL-6 o endotoxina estafilocócica B, activina o anisomicina , no influyó significativamente en los niveles de ARNm CCHCR1 (datos no mostrados).
CCHCR1 (A), Ki67 (B), y EGFR (C) los niveles de expresión de ARNm (TaqMan) en las células HaCaT después del tratamiento con los promotores de tumores OA y menadiona. CCHCR1 (D), Ki67 (E) y de expresión de ARNm de EGFR (F) en HaCaT, A5, II4, RT3, A431, y FaDu células. Las células invasoras y II4 FaDu y células metastásicas expresan RT3 menos CCHCR1 (D) y Ki67 (E) que las células HaCaT y A5. células A431 (F) expresan EGFR mRNA claramente más que otras líneas celulares. Los clones transformados por ras A5, II4, y RT3 y células FaDu expresan EGFR menos de células HaCaT. Cuantitativos RT-PCR resultados se muestran en relación con los niveles de mRNA a partir de células de control (asignado el valor 1) correspondiente. Los niveles de expresión de CCHCR1, Ki67, y EGFR en células HaCaT se normalizaron a los niveles de GAPDH mRNA en las mismas muestras. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
CCHCR1 está regulado por disminución en las líneas celulares tumorales más agresivas
Para estudiar más a fondo el papel de CCHCR1. en la transformación de KC, se comparó la expresión de ARNm CCHCR1 en líneas celulares con diferentes metastásico y propiedades invasivas. Basado en cuantitativa TaqMan RT-PCR, CCHCR1 y Ki67 niveles de expresión eran similares en líneas celulares inmortalizadas HaCaT y tumorigénico A5 transformados por ras (Figura 8D, E). Sin embargo, con la tumorigenicidad ascendente en Ras-transformación, II4 invasiva y células metastásicas RT3 expresado menos ARNm CCHCR1, y esta tendencia también se observó con células A431 malignos (Figura 8D). Del mismo modo, las células FaDu que son más invasivo que HaCaT y células A431 [13] expresaron menos CCHCR1, Ki67, y EGFR (Figura 8D-F). También Ki67 y disminuyen la expresión de EGFR con ras-transformación (Figura 8E, F). Curiosamente, las células A431 fueron las únicas células que expresan EGFR significativamente más que las células HaCaT (Figura 8F), Ki67 y CCHCR1 expresión restante en un nivel inferior (Figura 8D, E).
expresión CCHCR1 mRNA es downregulated cuando queratinocitos se encuentran en un estado de proliferación rápida
para estudiar la expresión CCHCR1 mRNA en células HaCaT inmortales pero no tumorigénicas de las diferentes etapas de proliferación, hemos realizado experimentos de cultivo celular de acuerdo con la estrategia de Pivarcsi et al. [14]. En nuestros experimentos, las células confluentes HaCaT (controles) y células confluentes después de un período de hambre de 1 semana (células obligadas a quiescencia) expresaron CCHCR1 más de las células HaCaT estimuladas a proliferar mediante la adición de suero a una subcultura no confluente (Figura 9A). CCHCR1 expresión disminuyó especialmente durante los primeros cuatro días. El estado de proliferación de las células (confirmado por Ki67 expresión de ARNm) correlaciona negativamente con la expresión CCHCR1 (Figura 9B): disminución de la expresión CCHCR1 se asoció con un aumento en la expresión de Ki67. Como las células reattained confluencia, la expresión de CCHCR1 aumentó de nuevo a su nivel original (Figura 9A). Uno de los cuatro experimentos se realizó utilizando un número aún más bajos de células. Aquí hemos demostrado una proliferación intensa durante los primeros puntos de tiempo (24 h y 48 h) como expresión relativa Ki67 mRNA aumentado 6 veces en comparación con las células control (dos conjuntos de control de las células que dan los dos valores alrededor de valor 1). La correlación negativa de la expresión CCHCR1 con la expresión de Ki67 era aún más profundo como mRNA CCHCR1 relativa al mismo tiempo la disminución de cerca a cero a partir de los dos valores de las celdas de control alrededor de valor 1 (Figura 9D). Curiosamente, los niveles de ARNm de EGFR siguieron el patrón de expresión CCHCR1 en lugar de patrón de expresión de Ki67 (Figura 9C, E). Al obligar a las células HaCaT de diferenciar con medio de alto contenido de calcio, la expresión de CCHCR1 permaneció inalterada tal como se mide con TaqMan PCR (datos no mostrados), de acuerdo con nuestros datos anteriores que los niveles CCHCR1 de mRNA fueron no alterado en diferenciada KC normal [1]. La involucrina se usó como un marcador de diferenciación para confirmar el estado de diferenciación de las células HaCaT tras la administración de calcio [15].
A) expresión relativa de ARNm CCHCR1 (medido por TaqMan) a diferentes puntos de tiempo (de 24 h a 8 d) después de liberar las células de la privación de suero y el cultivo de alta densidad. Expresión de CCHCR1 no fue diferente entre las células confluentes (control) y células quiescentes (hambre). Control de las células expresadas CCHCR1 2,5 veces más que las células HaCaT proliferativas (24-48 h, 3-4 d). Como se reattained confluencia (8 d), la expresión de CCHCR1 aumentó al nivel de las células de control. B) Correlación entre CCHCR1 relativa y los niveles de expresión de Ki67. Cuando los niveles de expresión de ARNm CCHCR1 se compararon con los de Ki67, una correlación negativa se observó, lo que confirma el estado de proliferación de las células HaCaT. expresión C) EGFR mRNA correlacionado con la expresión CCHCR1 mRNA. D) La correlación entre CCHCR1 y expresión de Ki67 en el experimento con menor densidad celular. La correlación negativa de la expresión CCHCR1 con la expresión de Ki67 era aún más profundo como mRNA CCHCR1 relativa disminuyó cerca de cero en las dos células de control. E) La correlación entre CCHCR1 y la expresión de EGFR en el experimento con menor densidad celular. Aquí de nuevo, la expresión CCHCR1 correlacionada con la expresión de EGFR. resultados TaqMan PCR se muestran en relación con los niveles de ARNm de las células de control correspondientes le asigna el valor 1. Los niveles de expresión de CCHCR1, Ki67, y EGFR en células HaCaT se normalizaron a los niveles de GAPDH mRNA en las mismas muestras. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Discusión
Los resultados presentados aquí indican que CCHCR1, un gen candidato para la psoriasis, se expresó. en la mayoría de los CE, CCB y Kas estudiado, lo que sugiere que CCHCR1 puede tener un papel no sólo en la proliferación KC sino también en la transformación. la expresión de EGFR correlacionado con la expresión CCHCR1, y ciclina D1, un objetivo corriente abajo de EGFR y un regulador positivo de la progresión del ciclo celular [16], se encontraron también expresado en las mismas áreas. En la epidermis normal, tanto EGFR y CCHCR1 se expresan basales [4], [8] (Figura 1). La expresión de EGFR, "un factor de supervivencia para las células tumorales", incluso se considera que es necesario para mantener a KCS en un estado de proliferación [8]. Postulamos que el EGFR puede regular la expresión CCHCR1 como recientemente hemos demostrado que la estimulación de EGF regula al alza la expresión de la proteína CCHCR1 [2]. Nuestros experimentos también aquí con células HaCaT transfectadas indicaron que la sobreexpresión de CCHCR1 no regula la expresión de EGFR.
De acuerdo con nuestros resultados, KCS transformadas tienen un estatus diferente CCHCR1 en correlación con el marcador de estado de hiperproliferación Ki67 en comparación con los no tumorigénicos KC. A diferencia de la benigna psoriasis trastorno hiperproliferativo ([1]; Figura 6E-F), la expresión del marcador hiperproliferación Ki67 se demostró aquí en las mismas áreas que la expresión CCHCR1 en el frente invasivo de los CE. Hemos demostrado previamente que en adenocarcinomas de mama y de pulmón, las células positivas son CCHCR1 Ki67 negativo [1], pero esta discrepancia puede deberse a diferencias entre adenocarcinoma y las células SCC o el órgano sitio del cáncer. La correlación positiva con CCHCR1 y la expresión de Ki67 de los cánceres de piel fue apoyada por el perfil de expresión de SCC líneas celulares cutáneas. Sin embargo, no hubo correlación negativa con CCHCR1 y la expresión de EGFR en estas mismas líneas celulares, así como en las células tumorales invasoras FaDu [17], lo que sugiere que la transcripción EGFR fue inhibida. Sin embargo, esto puede reflejar diferentes variantes de EGFR estudiado, puesto que la sonda específica para la variante 2 que parecía ser más downregulated que la variante 1 o sondas que reconocen todas las variantes.
A pesar de CCHCR1 positivo y Ki67 expresión in vivo en el cáncer de piel y en ensayo de Affymetrix de líneas de células SCC, se muestra que CCHCR1 y Ki67 mRNAs son downregulated en células cultivadas con transformación ascendente y también en células HaCaT no tumorigénicas tratados con compuestos que promueven los tumores in vivo. Metastásico RT3 y células II4 invasivos expresan CCHCR1 y Ki67 menos de tumorigénico A5 y inmortalizan células HaCaT, lo que sugiere que CCHCR1 y expresión de Ki67 aumenta inversamente con el nivel de ras-transformación. Del mismo modo, la expresión de EGFR se downregulated en todas las células transformadas con ras, incluso en las células A5. CCHCR1 mRNA también se redujo en las células FaDu invasivos en comparación con A431 se correlaciona con la regulación de EGFR de FaDu a las células A431. La expresión de alto EGFR en las células A431 en comparación con las células FaDu está de acuerdo con estudios anteriores [17]. Por otra parte, en los CE, la inmunotinción CCHCR1 fue heterogénea en las células atípicas - muchas células atípicas también carecían de Ki67
El promotores tumorales OA y menadiona regulados a la baja la expresión de CCHCR1, Ki67, y EGFR ARNm en las células HaCaT.. OA inhibe la proteína fosfatasas de serina /específica treonina, incluyendo proteínas fosfatasas 1, 2A, y PP3 [18] y activa celulares /2, JNK y p38 MAPK vías de señalización ERK1 y AP-1 factores de transcripción [19] - [21], además para la activación de Akt-1, un pro-supervivencia serina-treonina quinasa [22]. Menadiona inhibe la activación de proteína tirosina fosfatasas ErbB2 que se sobreexpresan en BCC y SCC regulados a la baja en relación con la epidermis normal [23]. Curiosamente, la actividad EGFR ha sido implicado en la carcinogénesis inducida por OA-y menadiona inducida por la activación de ErbB2 [24], [25]. Además, EGFR se ha informado para activar Erk1 /2 y Akt en SCC [10].
La radiación ultravioleta es uno de los factores más importantes que predisponen al cáncer de piel y también se conoce para activar EGFR [9]. No hemos detectado cambios significativos en los niveles de mRNA en CCHCR1 células HaCaT cultivados durante varios períodos después de la radiación UVA /UVB (Suomela, Latonen y Saarialho-Kere, datos no publicados). No hemos podido demostrar ningún efecto de H
2O
2 (que produce el estrés oxidativo) sobre la expresión CCHCR1 ARNm o bien, aunque también OA, así como menadiona se sabe que inducen la formación de especies reactivas del oxígeno y la peroxidación de lípidos en las células inmortalizadas líneas [26], [27], lo que sugiere que el estrés oxidativo no estuvo involucrado en la interacción de la OA y CCHCR1.
por último, se demuestra que en células HaCaT, la expresión CCHCR1 disminuyó con la proliferación, de acuerdo con nuestra anterior informes [1], [3], [4]. Después de provocar la proliferación de células HaCaT como se describió anteriormente [14], más proliferativa fueron, se expresó que las células HaCaT no tumorigénicas al menos CCHCR1. Curiosamente, la expresión de EGFR mRNA siguió a la de la expresión de ARNm CCHCR1 en lugar de la expresión de Ki67, lo que sugiere un efector aguas arriba común en las vías de señalización. No podemos, sin embargo, en este escenario se excluye el efecto de la confluencia celular solo en la expresión CCHCR1 ya que afecta también la proliferación de células HaCaT.
La transformación maligna de psoriásica lesional KC es muy raro que a pesar de la proliferación incontrolada de KC y co Existencia de la inflamación crónica. La razón para la protección contra el desarrollo del cáncer sigue siendo poco clara. La reducción de los niveles de AP-1 en KC psoriásicas se han sugerido como una explicación [28], [29]. AP-1 vía mediada también está implicado en la activación de EGFR que conduce a KC hiperproliferación [5]. Cuando los ratones transgénicos de riesgo CCHCR1, con receptor downregulated vitamina D [30], fueron heridos y tratadas con PMA, la proliferación KC se redujo [3], lo que sugiere menos activo AP-1 o STAT3 señalización. Además, la vitamina D, un fármaco utilizado en el tratamiento de la psoriasis, regula a la baja EGFR y la ciclina D1-[31]. CCHCR1 También se ha propuesto para regular la migración de la ARN polimerasa II subunidad 3 (RPB3) [32], que activa el factor activador de la transcripción 4 (ATF4 o CREB2) [31] asociarse con la detención del crecimiento [34], [35] y siendo capaz de formar heterodímeros con los miembros de la familia AP-1. El presente estudio implica que CCHCR1, un gen candidato para la psoriasis, tiene una función en la biología KC también en la transformación maligna. [14].