Extracto
La detección precoz del cáncer de vejiga (BCA) es fundamental para el tratamiento y el manejo del paciente con éxito. A través de estudios genómicos y proteómicos, hemos identificado una serie de marcadores biológicos asociados con el cáncer de vejiga que tienen potencial utilidad clínica. En un estudio de casos y controles, se examinaron muestras de orina anulado de 127 sujetos: 64 sujetos portadores de tumores y 63 controles. Las concentraciones urinarias de las siguientes proteínas se evaluaron mediante la prueba de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA); Motivo C-C de quimioquinas 18 (CCL18), inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) y CD44. Los datos fueron comparados con un ensayo de detección de BCa basado en ELISA comercial (BTA-Trak ©) y anuladas citología urinaria. Se utilizó el análisis del área bajo la curva del receptor curvas características de operación para comparar la capacidad de CCL18, PAI-1, CD44, y BTA para detectar BCa en muestras de orina espontánea. Las concentraciones urinarias de CCL18, PAI-1, y BTA fueron significativamente elevados en sujetos con BCa. CCL18 fue el biomarcador más precisa (AUC; 0,919; 95% intervalo de confianza [IC], 0,8704-0,9674). El análisis de regresión multivariante destacó CCL18 (O; 18,31; IC del 95%, 4,95-67,70,
p Hotel & lt; 0,0001) y BTA (O; 6,43; IC del 95%, 1,86-22,21,
p
= 0,0033) como predictores independientes de BCa en muestras de orina espontánea. La combinación de CCL18, PAI-1 y CD44 mejoró el área bajo la curva de to0.938. Los resultados preliminares indican que CCL18 fue un biomarcador de alta precisión para la detección BCa en esta cohorte. Monitoreo de CCL18 en muestras de orina espontánea tiene el potencial de mejorar las pruebas no invasivas para el diagnóstico BCa. Además el uso de la combinación de CCL18, PAI-1 y CD44 puede hacer que el modelo más robusto a errores para detectar BCa largo de los biomarcadores individuales o BTA
Visto:. Urquidi V, Kim J, Chang H, Dai Y, Rosser CJ, Goodison S (2012) CCL18 en un ensayo de orina: en base múltiplex para la detección de cáncer de vejiga. PLoS ONE 7 (5): e37797. doi: 10.1371 /journal.pone.0037797
Editor: Konradin Metze, Universidad de Campinas, Brasil |
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: 28 de abril de 2012; Publicado: 21 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Urquidi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Instituto Nacional del cáncer RO1 CA116161 (SG), Departamento de Salud de Florida James y Esther rey Premio Ciencia Equipo 10KT-01 (CJR), asistente de vuelo Instituto de investigación médica (CJR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Charles J. Rosser, Steve Goodison y Virgina Urquidi son empleados de Nonagen Bioscience Corp. Los autores tienen derechos de patentes relativas a la firma cáncer de vejiga. No hay productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La detección precoz del cáncer de vejiga (BCA) mejora significativamente la probabilidad de éxito en el tratamiento de pacientes y la gestión. El desarrollo de ensayos moleculares que puede diagnosticar la enfermedad con precisión, o que puede aumentar los métodos actuales de evaluación, sería un avance significativo. Un ensayo molecular que la aplicable a los fluidos corporales obtenidas de forma no invasiva, facilitaría no sólo el diagnóstico de pacientes de riesgo, sino también la detección asintomática, el seguimiento de recurrencia y la respuesta al tratamiento de la enfermedad. El advenimiento de la proteómica y tecnologías avanzadas de la genómica, la bioinformática y el desarrollo asociado, está trayendo estas metas en foco.
El estándar de oro para el diagnóstico de BCa implica cistoscopia de la vejiga, junto con la biopsia y la evaluación patológica de la lesión de la vejiga. Anulado la citología urinaria (VUC) se mantiene como la salida al complemento no invasiva a la cistoscopia en la detección de BCa. Mientras VUC tiene una especificidad de & gt; 93%, su sensibilidad es bastante pésimo en el 25-40%, especialmente para los tumores de bajo grado y estadio bajo [1], [2]. La necesidad de biomarcadores urinarios más precisos para la detección de BCa es evidente. Una serie de pruebas moleculares se han desarrollado para detectar tumores de vejiga, incluyendo antígeno tumoral vesical (BTA) [3], proteína de la matriz nuclear 22 (NMP-22) [4], y ImmunoCyt UroVysion [5]. Desafortunadamente, debido a su limitada sensibilidad y /o especificidad, ninguno de estos ensayos se han demostrado ser lo suficientemente preciso para sustituir la cistoscopia o VUC. Por lo tanto no hay pruebas BCa basada en orina que dominan el campo hasta la fecha. La potencia inadecuada de los biomarcadores individuales puede explicar en parte por qué la detección de BCa mediante análisis de orina sigue siendo un reto. Es necesario que haya una evolución hacia las pruebas que monitorean múltiples biomarcadores con el fin de lograr la precisión de diagnóstico deseada.
El advenimiento de nuevas técnicas de genómica y proteómica de alto rendimiento está impulsando el descubrimiento de biomarcadores hacia adelante, y hemos empleado estas técnicas en una serie de experimentos [6], [7], [8] de la que hemos derivado ambos paneles de ácido y de biomarcadores proteína nucleicos que facilitan la detección no invasiva de BCa con precisión sin precedentes. Además selección y validación de 14 proteínas a partir de los estudios proteómicos, y algunos productos de proteína a partir de la firma genómica, se basó en la clasificación estadística de asociación con BCa, y la disponibilidad de kits ELISA comerciales. En este estudio, se investigó si el seguimiento de algunos de estos objetivos utilizando las técnicas de detección basadas en la inmunidad podía confirmar el potencial utilidad clínica de una prueba diagnóstica no invasiva. El uso de ensayos de ELISA, monitorizamos tres proteínas diana (CC motivo de quimioquinas 18, CCL18; inhibidor activador del plasminógeno 1, PAI-1, y CD44) en muestras de orina de una cohorte de 127 sujetos, y se comparó el rendimiento de diagnóstico a la obtenida usando el BTA comercial -Trak ensayo y VUC.
resultados
características demográficas, clínicas y patológicas de la cohorte se presentan en la Tabla 1. Sólo el 28% de la cohorte tenía un cáncer VUC positiva mientras que la especificidad fue del 98 VUC %. CCL18 urinaria y PAI-1 fueron indetectables en la mayoría de los sujetos sin evidencia de BCa. Tanto BTA y CD44 se detectaron en las muestras de los dos grupos de control de tumor-cojinete y. La media de los niveles urinarios (Tabla 2) de CCL18 (637,39 pg /ml vs. 4,81 pg /ml,
p
& lt; 0,0001), PAI-1 (6,82 ng /ml vs. 0,06 ng /ml,
p Hotel & lt; 0,0001), y BTA 1.630,55 U /ml frente a 14,54 U /ml,
p Hotel & lt; 0,0001) fueron significativamente mayores en los sujetos con BCa comparación con los sujetos sin evidencia de BCa. La media de CD44 urinaria fue elevado en sujetos sin BCa comparación con sujetos con BCA (117.22 ng /ml frente a 53,09 ng /ml,
p Hotel & lt; 0,0001). ELISA datos se presentan en una figura gráfica de caja (Figura 1).
La capacidad de los biomarcadores de prueba para predecir la presencia de BCa se analizó mediante análisis no paramétrico de la República de China, de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional del Cáncer [9]. Con base en el área bajo la curva ROC (AUROC), determinamos los valores de corte de índice Youden para maximizar la suma de sensibilidad y especificidad. CCL18 urinaria fue el biomarcador más precisa con un área bajo la curva de (IC del 95%: 0,8704 a 0,9674) 0,919. Utilizando el valor de corte Índice de Youden (Figura 2), CCL18 urinaria proporciona una sensibilidad del 88%, una especificidad del 86%, valor predictivo positivo del 86% y un valor predictivo negativo del 87%. PAI-1 era un biomarcador menos preciso para la detección de BCA (área bajo la curva: 0,686; IC del 95%: 0,6119-0,7601). Usando el valor de corte Índice de Youden (Figura 2), urinarios análisis PAI-1 reveló una sensibilidad del 42%, una especificidad del 100%, un valor predictivo positivo de 100% y un valor predictivo negativo del 63%. Los niveles elevados de CD44 urinaria no eran indicativos de BCA (área bajo la curva: 0,488; IC del 95%: 0,383 a 0,5937). BTA sirvió como referencia positiva nuestro ensayo y se observó a tener una curva ROC de (IC del 95%: 0,74-0,90, Figura 2) 0.818. Utilizando el valor de corte Índice de Youden, BTA urinaria proporciona una sensibilidad del 80%, una especificidad del 84%, valor predictivo positivo del 84% y un valor predictivo negativo del 80%.
Se normalizaron los datos para la creatinina urinaria. La mediana de los niveles se representan mediante líneas horizontales. Significación (
p Hotel & lt; 0,05). Se evaluó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon
Con base en el área bajo la curva ROC (curva ROC), los valores de corte de índice Youden que maximiza la suma de sensibilidad y especificidad se determinaron para cada biomarcador (diamante). Tabla proporciona los valores de rendimiento para cada biomarcador
En el análisis de regresión logística multivariante ajustado por los efectos de la edad y la raza, CCL18 elevada (OR:. 18,31; IC del 95%: 4,95 a 67,70;
p Hotel & lt; 0,0001), elevado BTA (OR: 6,43; IC del 95%: 1,86 a 22,21;
p = 0,0033
) y redujo los niveles urinarios de CD44 (OR: 0,039; IC del 95%: 0.004 -0.35;
p = 0,0036
) se asociaron con BCa en muestras de orina espontánea (tabla 3) guía
Como se dijo anteriormente, los biomarcadores individuales quedan cortos al no tener en cuenta la complejidad de los tumores heterogéneos. , por lo tanto un ensayo multiplex para la detección de un panel de biomarcadores puede demostrar ser beneficiosa. Utilizando los valores de corte de índice Youden para CCL18, PAI-1 y CD44, estos biomarcadores se combinaron y analizaron (Figura 3). La combinación de CCL18, PAI-1 y CD44 (área bajo la curva: 0.938). Logra una sensibilidad del 86%, una especificidad del 89%, valor predictivo positivo del 89% y un valor predictivo negativo del 86%
discusión
el uso de nuevos enfoques [6] - [8], hemos identificado una firma de diagnóstico preliminar de 14 biomarcadores relacionados con BCa. En este estudio, se presenta nuestros resultados de tres de estos 14 marcadores biológicos.
Con base en el área bajo la curva ROC (curva ROC), se determinaron los valores de corte de índice Youden que maximizan la suma de sensibilidad y especificidad . Los datos dentro de la figura proporcionan valores de rendimiento. Canales de pago, valor predictivo positivo. VAN, valor predictivo negativo.
El aumento de los niveles urinarios de CCL18, PAI-1, y BTA, se asociaron significativamente con la presencia de BCa. En los análisis univariados, CCL18 resultó ser el marcador más asociado con BCA (AUC; 0,919; IC del 95%, desde 0,8704 hasta 0,9674), con un valor global predictivo positivo del 86% y un valor predictivo negativo del 87%. El análisis de regresión multivariante destacó CCL18 (O; 18,31; IC del 95%, 4,95-67,70,
p Hotel & lt; 0,0001), BTA-Trak © (O; 6,43; IC del 95%, 1,86-22,21,
p = 0,0033
) y CD44 (O; 0,039; IC del 95%, 0,004 a 0,35, p = 0,0036) como variables independientes en la detección de BCa en muestras de orina anulados. Con una precisión global del 92%, CCL18 superó claramente los otros biomarcadores, incluyendo BTA, como una proteína diana para la detección BCa por análisis de orina. La inclusión de marcadores adicionales (por ejemplo, PAI-1 y CD44) a un panel de multiplex no puede aumentar el poder predictivo significativamente (AUC 0,919 vs. 0,938), pero su adición puede hacer el modelo más robusto a errores ilustrando así el beneficio de una ensayo multiplex para diagnosticar BCa.
CCL18 es un miembro de la familia de citoquinas de las proteínas secretadas que participan en inmunorreguladora y procesos inflamatorios. CCL18 se cree que promueve la invasividad de las células cancerosas mediante la activación de la agrupación de integrinas y la mejora de su adhesión a la matriz extracelular, y un receptor (PITPNM3) para esta citocina se ha identificado recientemente [10]. Se conoce una variedad de citoquinas y sus receptores que se expresa de forma aberrante en las células tumorales y por lo que es concebible que CCL18 puede actuar de una manera paracrina durante tumor iniciación /establecimiento. Como un biomarcador de la enfermedad maligna, CCL18 se ha informado a ser indicativo de cáncer de ovario [11], [12] y el cáncer cervical [13]. Un enfoque de la proteómica identifica CCL18 sérica elevada como correlacionado con el cáncer de ovario, y este hallazgo fue validado mediante ELISA en 535 muestras. En combinación con CXCL1, monitoreo CCL18 superó CA125 como biomarcador circulante cáncer de ovario [12]. Un análisis de la expresión génica diferencial estudio en 33 muestras de tejidos sólidos identificado como uno de CCL18 veinte transcripciones significativamente sobreexpresado en los cánceres de cuello uterino invasivo [13].
PAI-1 es un miembro de la superfamilia de inhibidor de la proteinasa de la serina y es el inhibidor principal de activador del plasminógeno tisular (tPA) y la uroquinasa (uPA), por lo que regula la fibrinólisis [14]. PAI-1 se considera que es una proteína multifuncional, que también puede modular el crecimiento tumoral y la migración celular, la angiogénesis y la adhesión celular [15], [16]. Los resultados de los diferentes tipos de cáncer humanos han demostrado que los niveles de tPA o uPA de son significativamente superiores en relación canceroso del tejido a tejido normal correspondiente [17] - [19]. Hudson
et
al.
Informaron que ambas líneas celulares humanas BCa no invasivas e invasivas producen PAI-1 [20], y elevados de PAI-1 de genes y expresión de proteínas en los tejidos y el plasma tiene ha observado en pacientes BCA con un mal pronóstico [21]. En un estudio de vigilancia de PAI-1 en los tejidos, suero y orina, niveles significativamente más altos en tejidos y suero se correlacionaron con mal pronóstico, pero esto no fue cierto para urinario PAI-1 [21]. En nuestro estudio, estábamos buscando la presencia de BCa, y no consideró el pronóstico. Hemos sido capaces de demostrar que el PAI-1 urinaria fue significativamente elevado en los sujetos con BCA (6,82 vs 0,06,
p Hotel & lt; 0,0001), sin embargo, en el análisis multivariante, PAI-1 no era un predictor independiente de BCa. PAI-1 no puede ser un potente marcador biológico autónomo para la detección BCa, pero se necesita más investigación para determinar si se agrega valor a múltiples paneles de biomarcadores
.
Muchos estudios han investigado CD44 como un biomarcador para el cáncer, incluyendo BCa. CD44 es una glicoproteína de transmembrana expresado de forma ubicua que puede interactuar con una variedad de ligandos, por ejemplo, ácido hialurónico sintasas, y está implicado en interacciones célula-célula, la adhesión celular y la migración [22]. Las transcripciones de este gen se someten a splicing alternativo complejo resultante en una miríada de ARNm y proteínas isoformas con diversidad funcional, y esto hace que sea difícil lograr un consenso sobre qué objetivos CD44 son biomarcadores válidos. Klatte
et
al.
Demostró que la expresión de CD44v6 ausente en el tejido extirpado es un factor pronóstico independiente adverso de BCa recurrencia y la supervivencia global [23], y la sobre-expresión de CD44V8-10 en urotelial exfoliada Las células se ha notificado a ser un predictor pronóstico independiente en pacientes con BCa [24]. Anteriormente desarrolló un ensayo sándwich-ELISA que mide la proteína isoforma CD44v6 proteína en lisados de células uroteliales. En un estudio de 65 casos, el ensayo de sándwich de ELISA logra 81% de sensibilidad y especificidad del 100% para BCa diagnóstico [25]. En línea con estos hallazgos, un estudio fue capaz de asociar ARNm CD44v6 soluble en la orina de pacientes con cáncer de BCa [26]. Nuestro perfil celular y validación de un estudio urotelial [7] confirmar que las transcripciones de vigilancia CD44 pueden tener valor en la evaluación clínica, pero la proteína CD44 soluble urinaria no parece ser un biomarcador de diagnóstico prometedor.
Reconocemos que nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar como un centro de atención terciaria, que tienden a ver más de alto grado, la enfermedad en estadio alto, que se refleja en nuestra cohorte de estudio. Para confirmar la solidez de CCL18, estudios posteriores deben evaluar las cohortes más grandes que incluyen sujetos con bajo grado, la enfermedad en un estadio bajo. En segundo lugar, se analizaron muestras de orina procesadas, peraltadas. Orinas se centrifugaron y se separaron en pellet celular y el sobrenadante antes de su almacenamiento a -80 ° C. Es factible que las muestras de orina recién evacuadas pueden proporcionar diferentes resultados, y es orina fresca que sería el material utilizado para los ensayos de punto de cuidado. Actualmente estamos investigando el rendimiento de los biomarcadores seleccionados en muestras de orina procesadas a través de una serie de diferentes protocolos, incluyendo orinas recién evacuadas. A continuación, la sensibilidad de VUC en nuestra cohorte de predominantemente de alto grado (grado 3) enfermedad (28%) fue menor de lo esperado. Esto pone en tela de juicio la conocida variabilidad entre observadores de interpretar VUC. En estudios posteriores, vamos a utilizar dos citopatólogos de interpretar estos resultados. Además, no se sabe cómo la composición de proteínas del sobrenadante de la orina puede cambiar durante el almacenamiento congelado. El número de ciclos de congelación-descongelación se mantuvo a 1-2 dividiendo el sobrenadante de la orina en varias alícuotas pequeñas. Por último, nuestro tamaño de muestra de 127 es pequeño y los dos grupos que componen los 127 sujetos eran relativamente homogénea, es decir, ya sea activo contra el cáncer, o de casos control sin cáncer activo, sin antecedentes de cáncer, no hay infección del tracto urinario, sin litiasis urinaria, y sin hematuria macroscópica. Por tanto, no fue posible evaluar la sensibilidad /especificidad de los marcadores biológicos entre las diferentes etapas /grados. La especificidad de la promesa de biomarcadores tales como CCL18 tiene que ser probado en cohortes que se sabe que son problemáticos con otros ensayos basados en orina (por ejemplo, hematuria, infección del tracto urinario, piedras y disfunción miccional). A medida que refinamos nuestras firmas moleculares de diagnóstico y seleccionar objetivos específicos para el desarrollo de ensayos basados en ácido o de base inmunológica nucleico, nuestros resultados se confirman en gran, prospectivo y multicéntrico en fase de colaboración 2 y 3 ensayos que incluyeron a los sujetos no sólo en BCA, pero con infección del tracto urinario, litiasis urinaria, hematuria macroscópica y síntomas miccionales.
El desarrollo de biomarcadores de cáncer de vejiga basado en la orina podrían ser de gran beneficio para los pacientes y los sistemas sanitarios. Hemos demostrado en un estudio preliminar que elevó la concentración urinaria de proteínas CCL18 está fuertemente asociada con la presencia de BCa. Además, la combinación de CCL18, PAI-1 y CD44 no puede aumentar el poder predictivo de CCL18 significativamente, pero puede hacer que el modelo más robusto a errores. Más grande, se necesitan estudios prospectivos para determinar el papel potencial de CCL18 en la evaluación de los pacientes que están en riesgo de BCa.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
procesamiento
En virtud de la aprobación MD Anderson Cancer Center Orlando Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado por escrito, anulados muestras de orina, y la información clínica asociada se recogieron de forma prospectiva. La cohorte del estudio consistió en 63 individuos sin antecedentes de carcinoma de urothelia, hematuria, infección activa del tracto urinario o urolitiasis, y 64 individuos con carcinoma urotelial de nuevo diagnóstico. Los pacientes con enfermedad renal conocida o insuficiencia renal documentado no se inscribieron. De acuerdo con el Panel de Consenso Internacional sobre los marcadores tumorales de vejiga [27], esta cohorte sirvió como II (estudio de validación) de fase. Los datos se registran utilizando los criterios STARD [28]. En nuestro grupo de cáncer, se llevaron a cabo de imagen axial del abdomen y la pelvis y la cistoscopia, y el carcinoma de células uroteliales fue confirmado por el examen histológico del tejido extirpado. La información pertinente en la presentación clínica, puesta en escena, el grado histológico [29], [30] y los resultados se registraron (Tabla 1).
Antes de cualquier tipo de intervención terapéutica, 50-100 ml de orina espontánea se obtuvo a partir cada tema. Cincuenta mililitros de orina fue utilizado para los análisis de laboratorio clínico por procedimientos estándar. La alícuota de la orina restante se le asigna un número único de identificación antes de su procesamiento inmediato de laboratorio. Cada muestra de orina se centrifugó a 600 x g 4 ° C durante 5 min. El sobrenadante se decantó y se dividió en partes alícuotas, mientras que el sedimento urinario se congelaron instantáneamente. Tanto el sobrenadante y el sedimento se almacenaron a -80 ° C antes del análisis. Alícuotas de los sobrenadantes de orina se descongelaron y se analizó el contenido de proteína usando un Pierce 660-nm Kit de ensayo de proteínas (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.). Las concentraciones de proteína se midieron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (ND-1000, ThermoScientific, Wilmington, DE, EE.UU.).
Orina base ligado a enzimas (ELISA)
Los niveles de CC quimiocinas humano con motivos 18 (CCL18), también conocido como CCL18 (Cat#ab100620 Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), inhibidor del activador del plasminógeno humano 1 (PAI-1, Cat#EA-0207 Signosis Inc., Sunnyvale, CA, EE.UU.), y CD44 (Cat#45912 ab Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) fueron monitoreados en muestras de orina utilizando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Los ensayos de ELISA disponibles comercialmente también se utilizaron para medir los niveles de hemoglobina urinaria (Cat#E88-135 Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EE.UU.), y BTA (BTA-Trak © Ca#662150 Polymedco Inc. Cortlandt Manor, NY, EE.UU. ). Los lectores de estos ensayos fueron cegados en cuanto al estado de la enfermedad. Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las curvas de calibración se prepararon utilizando estándares purificadas para cada proteína evaluado. El ajuste de curvas se llevó a cabo por cualquiera lineal o regresión logística de cuatro parámetros, siguiendo las instrucciones del fabricante.
creatinina Ensayo
La creatina se convierte no enzimáticamente a la creatinina metabolito, que se difunde en la sangre y se excreta en la orina por los riñones a una velocidad constante. En consecuencia, la creatinina urinaria es una herramienta útil para la normalización de los niveles de otras moléculas que se encuentran en la orina [31], [32]. Nuestros resultados preliminares (no mostrados) demostraron que debido a la hematuria (sangre microscópica o macroscópica en la orina), que contiene niveles elevados de proteínas, la proteína no sería un buen marcador para la normalización. Por lo tanto, las concentraciones de todas las proteínas monitorizados (CCL18, PAI-1, CD44 y BTA) se normalizaron a la creatinina urinaria y estas concentraciones se informaron como una relación con respecto a los valores de creatinina en orina. El ensayo de creatinina se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cat#KGE005 R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.). Brevemente, los sobrenadantes de orina se descongelaron, se diluyeron con agua destilada y se trató con solución de picrato alcalino. Las muestras tratadas se midieron en un lector de microplacas (Bio-tek, Synergy
HT TM, VT) a una longitud de onda de 490 nm. Una curva estándar utilizando estándares purificadas se generó mediante análisis de regresión utilizando cuatro parámetros logísticos curva de ajuste, y la intensidad de la señal se convierte en concentraciones.
Análisis estadístico
La asociación entre cada biomarcador y fue BCa probado mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. No paramétrico característica de funcionamiento del receptor (ROC) curvas en la que el valor de la sensibilidad se representa frente se generaron tasa de falsos positivos (1-especificidad). Definimos una prueba de diagnóstico como positivos o negativos para la detección BCa utilizando un valor de corte. Se seleccionó el punto de corte óptimo (índice Youden) para maximizar la suma de la sensibilidad y especificidad [33]. La precisión de un biomarcador para predecir la presencia de BCa se definió como el promedio de la sensibilidad y la especificidad. Para evaluar la asociación independiente entre biomarcadores y BCa, análisis de regresión logística se realizó con el estado de BCA (sí vs no) como variable de respuesta, y CCL18, PAI-1, CD44, BTA concentraciones como las variables explicativas. La significación estadística en este estudio se fijó en
p Hotel & lt; 0,05 y todos los reportados
P
valores fueron de 2 caras. Todos los análisis se realizaron con SAS versión de software 9.1.3.
Reconocimientos
Los autores agradecen a los 127 sujetos que participaron en este estudio clínico.