Extracto
CC del receptor de quimioquinas 7 (CCR7) contribuye a la supervivencia de ciertas células del cáncer líneas, pero su papel en la proliferación de células humanas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) sigue siendo vaga. Los ensayos de proliferación realizados en células A549 y H460 NSCLC utilizando Cell Counting Kit-8 indican que la activación de CCR7 por su ligando específico, ligando quimiocina exógeno 21 (CCL21), se asoció con un aumento lineal significativo en la proliferación celular con la duración de la exposición a CCL21. La interacción CCL21 /CCR7 aumentó significativamente la fracción de células en el G
fase 2 /M del ciclo celular tal como se mide por citometría de flujo. Por el contrario, CCL21 /CCR7 no tuvo una influencia significativa en el
0 /G
1 y S fases G. Western blot y PCR en tiempo real indicó que CCL21 /CCR7 upregulated significativamente la expresión de la ciclina A, ciclina B1, y quinasa 1 (CDK1) dependiente de ciclina, que están relacionados con la transición de fase G
2 /M. La expresión de la ciclina D1 y ciclina E, que están relacionados con el G
0 /G
1 y G
1 /S transiciones, no fue alterada. La interacción CCL21 /CCR7 mejora significativamente la fosforilación de la quinasa extracelular regulada por señal (P-ERK), pero no Akt, medida por transferencia de Western. LY294002, un inhibidor selectivo de PI3K que previene la activación de la Akt aguas abajo, no se debilitó el efecto de CCL21 /CCR7 en P-ERK. Coimmunoprecipitation confirmó además que no había una interacción entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1, particularmente en presencia de CCL21. CCR7 pequeños ARN de interferencia o PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, abolió significativamente los efectos de CCL21 exógeno. Estos resultados sugieren que CCL21 /CCR7 contribuye a la proliferación dependiente del tiempo de células de NSCLC humanos upregulating ciclina A, ciclina B1, y CDK1 potencialmente a través de la vía de ERK
Visto:. Xu Y, Liu L, X Qiu , Jiang L, Huang B, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7 Promueve G
2 /M fase de progresión a través de la ERK en humano de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (6): e21119. doi: 10.1371 /journal.pone.0021119
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: May 7, 2011; Aceptado: 19-may de 2011; Publicado: 16 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.972.967) y el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de la Educación Superior de China (Nº 20092104110018). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptor de quimioquinas CC 7 (CCR7) es expresado en todas las células T ingenuas y en algunas células T de memoria, células B y células dendríticas maduras [1]. Tras la interacción con sus ligandos, ligando de quimiocina 19 (CCL19) o quimioquinas ligando 21 (CCL21) [2], CCR7 contribuye a la trata y de linfocitos homing a los ganglios linfáticos durante las reacciones inmunes e inflamatorias [3] - [5]. CCR7 es altamente expresado en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de mama, y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y es responsable de la mediación de la metástasis en ciertas líneas de células de cáncer [6] - [15]. Hasta la fecha, el papel de CCR7 en la proliferación de células de NSCLC humanos no ha sido dilucidado.
La activación de CCR7 puede aumentar la fosforilación de la quinasa regulada por señal extracelular-(P-ERK) o Akt (P-Akt) a través de proteínas Gi para mejorar la proliferación celular o la supervivencia [16] - [20]. ERK pertenece a la familia mitogen-activated proteína quinasa (MAPK), que también incluye c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y p38. La cascada de ERK, que se activa por estímulos mitogénicos, es crítica para la proliferación y la supervivencia [21], [22] y se requiere para la progresión normal de la mitosis en [23], [24]. Las vías de JNK y p38 son activadas en respuesta a los productos químicos y el estrés ambiental [25] - [27]. Akt (también conocida como Akt1), un mediador de la supervivencia celular inducida por el factor de crecimiento [28] - [30]., Puede promover la proliferación celular a través de fosforilación [31]
El propósito de este estudio fue examinar la efecto y mecanismo de regulación de la interacción CCL21 /CCR7 sobre la proliferación de A549 y células de NSCLC humanos NCI-H460 (H460). Aquí, hemos demostrado que CCL21 /CCR7 contribuido a la proliferación dependiente del tiempo de células de NSCLC humanos upregulating la expresión de la ciclina A, ciclina B1, y CDK1 través de la vía de ERK. Información obtenida de este estudio se presta profundizar en los mecanismos de supervivencia de las células cancerosas mediada por CCR7 y tiene implicaciones para los objetivos de tratamiento en NSCLC.
Resultados
CCL21 /CCR7 promueve la proliferación de células A549 y H460 . En un estudio anterior, hemos identificado un nivel de expresión CCR7 mayor en A549 y líneas celulares de cáncer humano H460 en comparación con otras líneas celulares [32]. Para investigar el papel de CCR7 en el funcionamiento de las células A549 y H460, la activación y la inhibición CCR7 fueron inducidos con CCL21 exógeno y con CCR7 pequeños ARN de interferencia (siRNA), respectivamente. Después de la transfección con CCR7 siRNA (siCCR7) o ARNsi de control, la expresión de CCR7 se evaluó mediante Western blot y la transcriptasa inversa (RT) -PCR. Se encontró que siCCR7 downregulated significativamente los niveles de proteína y ARNm de CCR7, en comparación con el control de siRNA (Figura 1).
A549 (A) y H460 células (B) se transfectaron con ARNsi de control o CCR7 siRNA (siCCR7) . Después de la transfección, la expresión de la proteína CCR7 (a) y ARNm (b) se evaluó mediante Western blot (a) y RT-PCR (b) y en comparación con las células A549 no transfectadas o H460. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05, en comparación con células de control
Para determinar el efecto de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación celular, el ensayo de CCK-8 se realizó en células A549 y H460. De acuerdo con los datos publicados [33], [34] y los resultados de nuestro experimento preliminar, a 100 ng /concentraciones mL CCL21 promovió significativamente la proliferación celular, en comparación con 50 ng concentraciones /mL, mientras que no hubo diferencias significativas entre los 100 ng /ml y 200 ng /mL concentraciones (Figura 2). Por lo tanto, a 100 ng /mL concentraciones CCL21 se utilizó en el experimento siguiente. La interacción CCL21 /CCR7 promovió significativamente la proliferación celular, mientras que siCCR7 abrogada significativamente la acción de CCL21 (Figura 3). siCCR7 solo no tuvo ningún efecto significativo sobre la proliferación celular, en comparación con las células de control. Se observaron diferencias significativas entre todos los puntos de tiempo examinado (todos p & lt; 0,01), lo que indica un aumento lineal en la proliferación con el aumento de los tiempos de exposición a CCL21 (todos p & lt; 0,01).
A549 (A) y H460 (B) las células fueron tratadas con CCL21 (50, 100 o 200 ng /ml) durante 24, 48, o 72 h, y la vitalidad celular se estimó usando el ensayo de CCK-8. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0,01, en comparación con las células tratadas con CCL21 (50 ng /ml)
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 , 48, o 72 h, y la vitalidad celular se estimó usando el ensayo de CCK-8. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0,01, en comparación con células de control
CCL21 /CCR7 aumenta la proporción de células en G
2 /M. Para verificar si la acción de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación de células A549 y H460 se asocia con un cambio en la distribución del ciclo celular, análisis del ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo. La interacción CCL21 /CCR7 mejora de forma significativa la proporción de células en el G
2 /M fase, mientras que no hubo efecto significativo de esta interacción en la proporción de células en G
0 /G
1 o de la fase S, en comparación con células de control (Tabla 1). siCCR7 suprimido significativamente este efecto de CCL21, mientras que siCCR7 solo no tuvo ningún efecto significativo en la distribución del ciclo celular.
CCL21 /CCR7 regula al alza la expresión de la ciclina A, ciclina B1, y CDK1. Para determinar el posible mecanismo por el cual CCL21 /CCR7 influye en la G
distribución de fase 2 /M en las células A549 y H460, la expresión de las ciclinas y quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1) se evaluó mediante Western blot y PCR en tiempo real . En comparación con las células de control, la interacción CCL21 /CCR7 upregulated significativamente la proteína y los niveles de mRNA de la ciclina A, ciclina B1, y CDK1, que están relacionados con G
2 /M progresión de la fase (Figura 4). siCCR7 abrogada significativamente los efectos de CCL21, mientras que siCCR7 solo no tuvo ningún efecto significativo sobre la ciclina CDK1 o expresión. CCL21 no tuvo efecto significativo sobre los niveles de ciclina D1 o ciclina E, que están relacionados con G
0 /G
1 y el G
1 /S transición.
A549 (A ) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h, y la proteína (a) y ARNm (b) los niveles de las ciclinas a, B1, se estimó que D1, y e y de CDK1 mediante Western blot (a) y PCR en tiempo real (b). Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con células de control
CCL21 /CCR7 regula al alza la expresión de P-ERK pero no P-Akt. Otros han informado de que CCR7 puede aumentar la fosforilación de ERK, JNK, o Akt, que están relacionados con la supervivencia celular [16] - [20], [33], [35] - [42]. Para verificar si la interacción CCL21 /CCR7 también puede mejorar la expresión de miembros de la familia MAPK y Akt en células A549 y H460, la expresión de estos componentes se evaluó mediante Western blot. La interacción CCL21 /CCR7 upregulated significativamente la expresión de P-ERK a las 24 h y 48 h, mientras que no hubo impacto significativo en la expresión de ERK (Figura 5). CCL21 /CCR7 no tuvo influencia significativa en la expresión o la fosforilación de JNK, p38, o Akt. Debido Akt es posiblemente aguas arriba de ERK [43], las células A549 y H460 fueron tratados con CCL21 de 24 h después de una exposición de 1 h a LY294002, un inhibidor selectivo de PI3K que inhibe la activación de la vía de Akt aguas abajo. Después de este tratamiento, CCL21 /CCR7 todavía upregulated significativamente la expresión de P-ERK (Figura 6).
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 12, 24, o 48 h, y (P-) los niveles de expresión normales y fosforilados se estimaron por Western blot. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con células de control
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de LY294002 , un inhibidor selectivo de PI3K que, por consiguiente impide la activación de la Akt aguas abajo, se aplicó durante 1 h. La expresión de P-ERK se estimó mediante Western blot. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0,01, en comparación con células de control
La inhibición de P-ERK suprime los efectos motor del CCL21 /CCR7 sobre la proliferación y G
2 /M progresión de la fase. Para verificar si PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, puede abolir los efectos de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación y G
2 /M progresión de la fase de las células A549 y H460, la viabilidad celular y la distribución del ciclo celular Los ensayos se realizaron con CCK-8 y citometría de flujo, respectivamente. PD98059 abrogada significativamente los efectos de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación celular y la
progresión G 2 /M fase (Figura 7 y Tabla 2, respectivamente). PD98059 también abolió la influencia de CCL21 /CCR7 en la expresión de P-ERK, ciclina A, ciclina B1, y CDK1 (Figura 8). Además, PD98059 solo tuvo un efecto inhibidor significativo sobre la proliferación celular, la G progresión
2 /M fase y la expresión de P-ERK, ciclina A, y ciclina B1 (Figura 7, Tabla 2, y la Figura 8, respectivamente).
A549 (a) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24, 48, o 72 h después de PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de aguas abajo ERK, se aplicó durante 1 h. vitalidad celular se estimó usando el ensayo de CCK-8. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con células de control
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de PD98059 , un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, se aplicó durante 1 h. Los niveles de expresión de estos componentes se estimaron mediante Western blot. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con células de control
P-ERK, inducida por CCL21 /CCR7, interactúa con ciclina A, ciclina B1, y CDK1. Para identificar además si hay una interacción entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1, se realizó coimmunoprecipitation. células A549 y H460 en la ausencia o presencia de CCL21 durante 24 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra P-ERK o IgG, seguido de Western blot para la ciclina A, ciclina B1, y CDK1. Se observó una interacción pronunciada, específica entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1, especialmente cuando las células fueron tratadas con CCL21 durante 24 h (Figura 9a). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra la ciclina A, ciclina B1, CDK1, o IgG se evaluó mediante Western blot para P-ERK, y de nuevo, la interacción entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1 era saliente, especialmente en presencia de CCL21 (Figura 9b). células A549 y H460 en ausencia o en presencia de PD98059 durante 1 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra P-ERK o IgG, seguido de Western blot para la ciclina A, ciclina B1, y CDK1. La interacción entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1 se debilitó en respuesta a la exposición PD98059 (Figura 9c).
A549 (A) y H460 (B) las células en ausencia o presencia de CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra P-ERK o IgG, seguido de Western blot para la ciclina a, ciclina B1, y CDK1 (a). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra la ciclina A, ciclina B1, CDK1, o IgG se analizaron por Western blot para P-ERK (b). células A549 y H460 en ausencia o en presencia de PD98059 durante 1 h se sometieron a inmunoprecipitación con P-ERK o anticuerpos IgG, seguido de Western blot para la ciclina A, ciclina B1, y CDK1 (c).
Discusión
Varios estudios han documentado que la activación de CCR7 es responsable de la mediación de la supervivencia de ciertas líneas celulares de cáncer mediante la promoción de la migración y la proliferación o mediante la inhibición de la apoptosis [33], [35] - [42]. Sin embargo, el papel de CCR7 en la proliferación de células de NSCLC humanos no ha sido bien documentado. En el presente estudio, se confirmó que la interacción CCL21 /CCR7 puede mejorar significativamente la proliferación de células NSCLC humano de una manera dependiente del tiempo, que implica la regulación positiva de la ciclina A, ciclina B1, y CDK1, posiblemente a través de la ERK, pero no la Akt, vía.
de acuerdo con estudios anteriores usando diferentes modelos de células de proliferación celular [16], [37], [40], la activación de CCR7 con CCL21 promovidos. En contraste con nuestros resultados actuales, un estudio previo sugerido que CCL21 murina tenía ninguna acción significativa en la proliferación de células A549 [44]. Una posible explicación de la discrepancia sería que CCL21 ratón puede interactuar con CXCR3, pero no CCR7, mientras que CCL21 humana puede unirse CCR7 pero no CXCR3 [45]. Esto sugiere que la activación de CXCR3 no afecta a la proliferación de las células A549
Tradicionalmente, el ciclo celular es segregada en cuatro fases:. Replicación del ADN se produce durante la fase S, y la segregación de cromosomas ocurre durante la fase M. Las fases S y M están separadas por los llamados fases gap, G1 (antes de la replicación del ADN) y G2 (antes de la mitosis). Hemos demostrado que la CCL21 /CCR7 alterado significativamente la distribución del ciclo celular de tal manera que las células más pobladas del G
2 /M fase. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la distribución de las células en el G
0 /G
1 y S fases.
El ciclo celular está regulado por las ciclinas y CDK. ciclinas de tipo D son considerados como reguladores clave de G
1 en la progresión [46]. Ciclina E se requiere para el G
1 /S transición [47], [48] y la ciclina A es esencial para la progresión a través de la fase S [49], [50]. Tanto la ciclina A y las ciclinas de tipo B se asocian con CDK1 para promover la entrada en mitosis [51], [52]. En este estudio, tanto los niveles de mRNA de la ciclina A, ciclina B1 y la proteína, y CDK1 se upregulated significativamente cuando las células se trataron con CCL21 durante 24 h. Esto indica que CCL21 /CCR7 acelera la progresión G
2 /M fase para promover la proliferación celular. No se midieron diferencias significativas en la ciclina D1 o los niveles de expresión de ciclina E, lo que indica que CCL21 /CCR7 no tiene ningún efecto significativo sobre el G
0 /G
1 fase o el G transición
1 /S. Este hallazgo demuestra por primera vez que CCL21 /CCR7 tiene un efecto impelente en la progresión del ciclo celular que implica la G
2 /M fase.
Varios estudios que utilizan otros tipos de células han indicado que la activación de CCR7 se asocia con la supervivencia celular mejorada a través de aumento de la fosforilación de ERK, JNK, o Akt [16] - [20], [33], [35] - [42]. Hemos examinado si la CCL21 /CCR7 puede aumentar la expresión de los componentes de MAPK y Akt en células A549 y H460. Nuestros resultados sugieren que CCL21 /CCR7 aumentó la fosforilación de ERK pero no JNK, p38, o Akt. Estos resultados son coherentes con los informes publicados previamente que sugerían un efecto de facilitación del CCR7 en la Akt, pero no ERK, vía [16], [19]. Un estudio separado indicó que Akt es posiblemente aguas arriba de ERK [43]. Se encontró que CCL21 /CCR7 todavía podría regular positivamente de manera significativa la expresión de P-ERK después de que las células se trataron con LY294002 durante 1 h. Debido LY294002 inhibe selectivamente PI3K para evitar la activación de Akt aguas abajo, nuestros resultados sugieren fuertemente que la Akt no juega un papel crítico en la interacción entre la CCL21 /CCR7 y ERK. Esto está en concordancia con un informe anterior [53]. La razón de estas discrepancias no está claro.
Desde CCL21 /CCR7 era capaz de aumentar la expresión de P-ERK, hemos tratado de determinar si existe una interacción entre P-ERK y la ciclina A, ciclina B1, o CDK1. Coimmunoprecipitation y los resultados de inmunoprecipitación recíprocas sugiere fuertemente una interacción entre P-ERK y ciclina A, ciclina B1, o CDK1, especialmente en presencia de CCL21. Esta interacción podría ser debilitada mediante la inhibición de ERK con PD98059. Además, PD98059 abolió el efecto de CCL21 /CCR7 en A549 y la proliferación de células H460 y G
2 /M progresión de la fase, así como la regulación negativa de la expresión de P-ERK, ciclina A, ciclina B1, y CDK1. Estos resultados demuestran que el efecto de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación celular y la regulación positiva de la ciclina A, ciclina B1, y CDK1 puede ocurrir a través de la vía de ERK en las células de NSCLC humanos.
sugiere que este estudio que la activación de CCR7 con CCL21 puede promover significativamente la proliferación de células de NSCLC de una manera dependiente del tiempo que implica la ciclina a, ciclina B1, y CDK1, posiblemente a través de la ERK, pero no la Akt, vía. Esta información puede ayudar a aclarar los mecanismos de supervivencia de las células del cáncer e identificar objetivos potenciales para el tratamiento del NSCLC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
A549 y H460 líneas celulares de nuestro trabajo publicado anterior [32] se cultivaron en medio RPMI-1640 o DMEM-F12 suplementado con 10% de suero HyClone bovino fetal (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.) en una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células fueron cultivadas en 75 cm
2 matraces de cultivo y se recogieron en una solución de tripsina-EDTA en la fase de crecimiento logarítmico.
ciclina A, ciclina B1, ciclina D1, ciclina E, CDK1, P-ERK , ERK, JNK-P, JNK, P-p38, p38, P-Akt, Akt, IgG y anticuerpos monoclonales de ratón o conejo ß-actina fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). CCL21 humana recombinante se compró a Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, EE.UU.). siCCR7 y Lipofectamine 2000 se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Recuento celular Kit-8 (CCK-8) se adquirió de Dojindo Laboratories (Pekín, China). PD98059 y LY294002 se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.) y se utilizaron a 50 mM o 100 mM (concentraciones finales), respectivamente, de acuerdo con informes anteriores [40], [54]. Proteína /G cuentas A se obtuvieron de Beyotime (Haimen, China).
siRNA tratamiento de las células
células A549 y H460 se sembraron en 6 cm
2 placas de cultivo celular y se cultivó a 30 a 50% de confluencia antes de la transfección con Lipofectamine 2000 tal como se describe anteriormente [55]. La eficiencia de la transfección se evaluó por citometría de flujo. Eficiencias de siCCR7 y silenciamiento no siRNA de control se ensayaron usando Western blot y RT-PCR. Las secuencias de siCCR7 y control siRNA fueron: CCR7, 5'-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 'y 3'-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5'; control, 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 'y 3'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5'.
actividades de proliferación La proliferación celular ensayo
celulares fueron examinadas usando CCK-8. células A549 y H460 se sembraron en placas de 96 pocillos (1000 células /pocillo) y se trataron con CCL21 de 0, 24, 48, o 72 h. Después del tratamiento, se añadió CCK-8 a cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 4 horas a 37 ° C. El valor de la densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió usando un lector de microplacas (Spectra Thermo, Männedorf, Suiza) con una longitud de onda de ensayo de 450 nm.
ciclo celular análisis
Después del tratamiento con CCL21 durante 24 h, se recogieron las células y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) y se fijaron en 75% de etanol durante 2 horas a 4 ° C. Las células fijadas se lavaron dos veces con 500 l de PBS frío. Después, las células se tiñeron con 500 l de solución de yoduro de propidio (PI) tinción (50 mg /ml PI, 0.1% Triton X-100, RNasa 200 mg /ml de DNasa libre en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Diez mil eventos por muestra fueron adquiridas mediante un flujo FACS-scan citómetro (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), y el porcentaje de células en G
0 /G
1, S y G
2 /M fases del ciclo celular se determinaron utilizando Modfit LT 3.0 (Becton-Dickinson).
Western el análisis de transferencia
Después del tratamiento con CCL21 durante 24 h, las células se extrajeron con lisis tampón (NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,1% de SDS, 2 mg /ml de aprotinina y PMSF 1 mM) durante 30 min a 4 ° C. Los extractos fueron centrifugados a 12.000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C. Se recogieron los sobrenadantes que contienen proteína total entonces. Partes alícuotas, cada una conteniendo proteína 50 g, fueron separados por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF a 55 V (ciclina A, ciclina B1, P-Akt, Akt) o 40 V (los otros) durante 2,5 horas a baja temperatura . Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 2 h, y las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos monoclonales en 1:1000 (P-JNK, JNK, P-p38, p38 y β-actina) o 1:200 (los otros) dilución la noche a 4 ° C. Las proteínas se visualizaron utilizando anti-ratón o anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1:6000 o 1:8000 de 2 h a temperatura ambiente, respectivamente. Se obtuvieron imágenes de las bandas con un sistema de imagen EC3 (UVP LLC, Upland, CA, EE.UU.), y el OD se midió usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). La diferencia entre las proteínas ensayadas OD y β-actina de la misma muestra se calculó como contenido relativo y expresó gráficamente.
RT-PCR y PCR en tiempo real
ARN total fue aislado de las células usando TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. ß-actina se utilizó como control interno. Para determinar la eficiencia de siCCR7 y controlar siRNA, semi-cuantitativos de RT-PCR se realizó en un termociclador G-STORM (GRI Ltd, Byfleet, Reino Unido) usando el kit de PCR de ARN de Takara (AMV) versión 3.0 (Takara, Dalian, China). Los cebadores de PCR fueron los siguientes: CCR7 F: 5'-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 ', R: 5'-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3'. La longitud CCR7 amplicón era 305 pb. β-actina F: 5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 ', R: 5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'. La longitud amplicón β-actina fue 513 pb. Las condiciones de ciclado térmico fueron las siguientes: 30 ciclos de 40 s cada uno, incluyendo desnaturalización a 95 ° C, recocido a 53 ° C, y la extensión a 72 ° C
En tiempo real PCR se realizó en un ABI. Sistema rápido Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.), utilizando SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un volumen total de 20 l y a ciclos 40 veces después de la desnaturalización inicial (95 ° C durante 30 s) con los siguientes parámetros: 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. β-actina F: 5'-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ', R: 5'-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3'. La longitud amplicón β-actina fue de 107 pb. Otras secuencias de los cebadores se han publicado en otro estudio [56]. La fiabilidad de los resultados de la PCR fue apoyada por el análisis de la curva de disociación. En tiempo real PCR datos se calcularon utilizando el 2
método -ΔΔCT en el paquete de software SDS 2.4 (Applied Biosystems) [57].
coimmunoprecipitation
Después del tratamiento con CCL21 durante 24 h , las células se extrajeron con tampón de lisis (mM KCl 10, MgCl 1,5 mM
2, HEPES 10 mM [pH 7,9], mM PMSF 1 mM, DTT 1) y se homogeneizó durante 30 min a 4 ° C. Los extractos se centrifugaron a 12.000 x
g
durante 15 min a 4 ° C, y los sobrenadantes que contienen proteína total se cosecharon. Igual cantidad de proteína fueron expuestos a anticuerpos contra P-ERK, IgG, ciclina A, ciclina B1, o CDK1, que se inmovilizó sobre proteína /G cuentas a. Después de 3 h de incubación a 4 ° C con rotación suave, las perlas se lavaron extensivamente cinco veces con tampón de lisis, hervidas, y microcentrifugaron. Las proteínas se detectaron con anticuerpos contra la P-ERK, ciclina A, ciclina B1, CDK1 o por Western blot.
El análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el software SPSS 16.0. Se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias entre los grupos con diferentes tratamientos, y se utilizó la diferencia significativa (LSD) o la prueba de menor prueba de Dunnett T3 para el análisis de subgrupos post hoc. polinómica contraste se utilizó para el análisis de tendencias. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos para p & lt; 0,05. Los valores de N veces para la expresión de genes cambian hasta 0,5 y por debajo de 2 se tomaron como no significativa, de acuerdo con los valores obtenidos a partir de genes de control negativo [57], [58].