Extracto
Objetivo
Para investigar los efectos de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación, la migración y la invasión de las células T24 y los posibles mecanismos asociados: la expresión de MMP-2 y MMP 9, y la regulación de las proteínas Bcl-2 y BAX.
Métodos
células T24 recibido tratamientos correspondientes incluyendo el control del vehículo, un anticuerpo (anticuerpo 20 ng /ml CCR7 y 50 ng /ml CCL21), y 50, 100, y 200 CCL21 ml /ng. La proliferación se evaluó mediante el ensayo de MTT; la migración celular y la invasión se analizaron utilizando una cámara transwell. apoptosis celular fue inducida por adriamicina (ADM). La tasa de apoptosis de las células se examinó por citometría de flujo usando tinción con anexina V-FITC /PI. Western-blot se utilizó para analizar las proteínas de MMP-2 y MMP-9 y Bcl-2 y BAX.
Resultados
CCL21 promovió la proliferación de células T24 en función de la concentración con la que se utilizaron 200 ng /ml indujo la mayor cantidad de proliferación. No se encontraron diferencias significativas de la migración celular entre los grupos CCL21treatment y el grupo de control en los estudios tanto de la migración y la invasión (P & lt; 0,001 para todos). Las expresiones de MMP-2 y MMP-9 proteínas se incrementaron significativamente después del tratamiento CCL21 (p & lt; 0,05 para todos). Expresión de proteínas de Bcl-21 sigue una tendencia ascendente, mientras que la expresión de Bax sigue una tendencia descendente como aumenta la concentración de CCL21. No se encontraron diferencias entre el grupo control y el grupo de anticuerpos para todas las evaluaciones.
Conclusión
CCL21 /CCR7 promovió la proliferación de células T24 y mejoró su migración y la invasión a través del aumento de la expresión de MMP-2 y MMP-9. CCL21 /CCR7 tenía actividades antiapoptóticas en las células T24 a través de la regulación de las proteínas Bcl-2 y Bax. CCL21 /CCR7 puede promover el desarrollo del cáncer de vejiga y metástasis
Visto:. Mo M, Zhou M, L Wang, Qi L, K Zhou, Liu L-F, et al. (2015) CCL21 /CCR7 mejora la proliferación, migración e invasión de cáncer de vejiga humano T24 células. PLoS ONE 10 (3): e0119506. doi: 10.1371 /journal.pone.0119506
Editor Académico: Rajesh Mohanraj, Facultad de Medicina & amp; Ciencias de la Salud, Emiratos Árabes Unidos
Recibido: October 14, 2014; Aceptado: January 13, 2015; Publicado: 23 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es uno de los tipos más comunes de cáncer en adultos. Sólo en 2008, 386.000 pacientes fueron diagnosticados con cáncer de vejiga que se tradujo en 150.200 muertes en todo el mundo sobre la base de las estadísticas globales [1]. La metástasis es no sólo un sello distintivo del cáncer de vejiga, pero también la causa de la mortalidad [1]. Sin embargo, la fisiopatología de la metástasis del cáncer de vejiga aún no está claro. Las quimioquinas, una superfamilia de pequeños péptidos secretados que se caracterizan por su capacidad para inducir la migración de leucocitos, junto con sus receptores se han encontrado para estar involucrado en la migración de las células del sistema linfoide, por lo tanto pueden afectar el desarrollo y progresión del cáncer [2-4]. CCL21, una quimiocina importante de la familia CCL, es uno de los únicos dos ligandos (el otro es CCL19) para CCR7. [5] CCL21 es producido por células reticulares fibroblásticas de la zona rica de células T en humanos y vénulas endoteliales altas en ratones. [6] CCR7 se expresa por varios tipos de linfocitos B naive incluyendo y las células T, semimature y células dendríticas maduras, y las células T reguladoras [5]. Además, la expresión de CCR7 Se ha informado para promover la metástasis de células de cáncer a los ganglios linfáticos en el cáncer no microcítico de pulmón de células [7], cáncer de mama [8], carcinoma de células escamosas de cáncer de cabeza y cuello [9], cáncer de colon [10] , cáncer de próstata [11], cáncer de células escamosas de esófago [12] y el cáncer gástrico [13]. Por lo tanto, CCR7 y su ligando (s) pueden participar en la proliferación, la progresión y la metástasis de las células cancerosas de diversos orígenes de órganos [7-13]. También se encontró que CCR7 estuvo involucrado en el desarrollo y progresión del cáncer de vejiga (datos no publicados).
Fisiológicamente, CCL21 /CCR7 juega un papel importante en homing de las células inmunes, homing de los ganglios linfáticos y el posicionamiento, la inmunidad y periférico tolerancia, el desarrollo y función de las células T reguladoras, y la autoinmunidad y neogensis linfoide [5]. Diversos estudios han confirmado los papeles de CCL21 /CCR7 en el desarrollo y progresión del tumor [14 a 17]. Por ejemplo, CCL21 /CCR7 promueve G2 progresión de la fase /M y previene la apoptosis a través de la vía de ERK en el cáncer humano no pequeñas de pulmón de células [15, 16], facilita la progresión de cáncer de páncreas través de la inducción de la angiogénesis y linfangiogénesis [14], regula la matriz metaloproteinasa-9 (MMP-9) en la metástasis del cáncer de colon humano [18], y regula al alza MMP-9 en la migración celular de células B leucemia linfocítica crónica y la invasión [17]. Además, también se encontró CCL21 /CCR7 para promover la migración de células de cáncer en los vasos microlymphatic en cáncer de mama [19], tumor de páncreas [20], adenocarcinoma de pulmón [21], y el carcinoma de células escamosas de esófago [22]. Sin embargo, el posible papel de CCL21 /CCR7 en el desarrollo de cáncer de vejiga y la progresión sigue siendo poco clara. Las células T24 se derivan de carcinoma de células transicionales de vejiga urinaria humana y han sido ampliamente utilizados para el estudio del cáncer de vejiga [23].
Los propósitos del presente estudio fue investigar los efectos de CCL21 /CCR7 en la proliferación, la migración y la invasión de las células T24 y los posibles mecanismos asociados:. expresión de MMP-2 y MMP-9, y la regulación de las proteínas Bcl-2 y BAX
Materiales y Métodos
en este estudio se obtuvo la aprobación ética del comité de ética del hospital Xiangya, Universidad central del Sur, Changsha, provincia de Hunan, china.
Reactivos y línea celular
proteína humana recombinante CCL21 fue adquirido de Perprotech (Rocky hill, Nueva Jersey, EE.UU.) y conejo policlonal anti-CCR7 humana de anticuerpos fue adquirido de Wuhan Boster Biological Engineering Co., Ltd. (Wuhan, china). inhibidor de la proteasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) fue adquirido de Roche Diagnostics (Indianápolis, IN, EE.UU.). MTT y sulfóxido de dimetilo (DMSO) se adquirió de Hufeng Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China). kit de detección de apoptosis anexina V-FITC se adquirió de Beyotime Biotecnología (Shanghai, China).
El cáncer de vejiga humana T24 línea celular fue adquirido de los Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai, la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China ). Las células se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO
2, en medio de DMEM (Gibco, EE.UU.) que contiene 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 U /ml y estreptomicina 100 U /mL.
cultura y el tratamiento de la célula
Las células T24 se trataron durante 48 horas antes de MTT ensayo, ensayos de migración y la invasión, y el análisis de Western blot y 24 horas antes de la citometría de flujo del estudio. Para cada experimento, hubo cinco grupos que consisten en Grupo 1 (grupo de control) que se trató con medio libre de suero DMEM, Grupo 2 (grupo de anticuerpos) que recibió primero el tratamiento previo de 20 ng /ml de conejo policlonal de anticuerpos CCR7 anti-humana de 4 h de 50 ng /ml de CCL21, Grupo 3 que recibió 50 ng /ml de CCL21, Grupo 4 que recibió 100 ng /ml de CCL21, y Grupo 5 que recibieron 200 ng /ml de CCL21. Los experimentos de ensayo de MTT, citometría de flujo, y de transferencia de Western se repitieron tres veces (n = 3), y la migración celular y la invasión se repitieron cuatro veces (n = 4).
ensayo de MTT para la proliferación de T24 células
proliferación de las células T24 se evaluó mediante el ensayo de MTT. En resumen, las células fueron tratadas correspondientemente en cada grupo durante 48 horas. Después del tratamiento, el medio se retiró y las células se incubaron con 5 mg /ml de solución de MTT (20μl). Después de la incubación durante 4 horas a 37 ° C y 5% CO2, se retiró el sobrenadante y se midió la formación de formazan a 490 nm con Gel Documentación & amp; set Sistema de Análisis (Liuyi fábrica, Pekín, China).
ensayos de migración y la invasión
La migración celular y la invasión se analizaron utilizando una cámara transwell (EMD, Millipore, EE.UU.). Para el ensayo de invasión, una cámara transwell se colocó en una placa de 24 pocillos y se recubrió con 30 l de Matrigel (Franklin Lakes, EE.UU.) y se incubó durante una hora a 37 ° C. En ambos ensayos Transwell, las células, después de 48 horas 'correspondiente tratamiento, se trataron con tripsina y se sembraron en cámaras a la densidad de 8 × 10
4 células por pocillo, y 500 l de medio DMEM libre de suero se añadió a la cámara inferior. Las células migradas se fijaron con 100% de Matrigel (BD, Franklin Lakes, EE.UU.) de metanol durante 30 min después de 24 horas, y las células no migradas fueron retirados por hisopos de algodón. Por último, las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con hematoxilina y eosina para 20 min. Microscopio óptico (200X, Olympus, Tokio, Japón) se utilizó para contar el número de células en cinco campos aleatorios de vista; Se calculó el número medio de células para cada grupo.
citometría de flujo para la apoptosis
apoptosis de las células se indujo mediante Adiamycin (ADM). La tasa de apoptosis de las células T24 se examinó por citometría de flujo usando tinción con anexina V-FITC /PI. Brevemente, las células T24 se trataron como anteriormente en cada grupo durante 24 h; las células fueron incubadas con ADM (0,1 mg /ml) durante 48 h adicionales. Entonces se recogieron las células, se lavaron y se resuspendieron en PBS. La muerte celular apoptótica se midió por doble tinción con anexina V-FITC y PI usando el kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) según las instrucciones del fabricante. Análisis de citometría de flujo se realizó inmediatamente después de la tinción. adquisición y análisis de datos se llevaron a cabo por citometría de flujo usando el software Cell Quest.
análisis de transferencia de Western
células T24 se colocaron en viales de 75 ml de cultivo y se incubaron a 37 ° C durante 24 h y después se trató correspondientemente en cada grupo para la incubación de 48 horas. Las suspensiones se lavaron con PBS frío. Las células se incubaron a continuación en helado de tampón RIPA [1 M Tris (pH 7,4), 5 M NaCl, 0,5 M EDTA (pH 8,0), 10% de SDS, 10% DOS, y 10% de NP40] con fresco proteasa PMSF inhibidor sobre hielo durante 20 min. Las células se rasparon y el lisado se recogieron en un tubo de Eppendorff y centrifugó a 10.000 rpm a 4 ° C durante 10 min, y se recogieron los sobrenadantes, alícuotas, y se almacenaron a -20 ° C para uso futuro.
diluciones de BCL-2 /BAX (12%) y MMP-2 /MMP-9 (7,5%) se utilizaron para el estudio. Las proteínas (20 g) se cargaron en 5-15% de geles de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences, EE.UU.). Las membranas se empaparon en tampón de bloqueo (5% de leche desnatada) bajo temperatura ambiente durante 2 h. Las manchas de transferencia se lavaron con PBS (con 0,1% de BSA). Para la sonda de MMP-2, MMP-9, BCL-2, 2H Bax, y β-actina, las membranas se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpos pertinentes, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas y detección ECL. Documentación & amp gel; Sistema de Análisis conjunto (Liuyi fábrica, Pekín, China) se utilizó para la captura de imágenes y el análisis de los valores de densidad óptica (DO) (490 nm).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS 18,0 software estadístico. Los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar. Se utilizó un análisis unidireccional de varianza con la prueba de LSD Fisher para comparaciones de grupos. El nivel de significación se fijó en p-valor inferior a 0,05.
Resultados
Efectos de CCL21 /CCR7 sobre la proliferación de las células T24
Los efectos de CCL21 /CCR7 en células T24 como se representa por valores de DO se presentan en la Tabla 1. OD valores fueron 0,211 ± 0,013 en el grupo de control, 0,216 ± 0,011 en el grupo de anticuerpos (p & gt; 0,05 en comparación con el control), 0.248 ± 0.006 en 50 ng /ml de CCRL21 (P & lt; 0,05 en comparación con el control), 0,290 ± 0,004 para 100 ng /ml de CCRL21 (P & lt; 0,01 en comparación con el control), y 0,341 ± 0,012 para 200 ng /ml de CCRL21 (P & lt; 0,001 como en comparación con el control). CCL21 promovió la proliferación de células T24 en función de la concentración de 200 ng /ml indujo la mayor cantidad de proliferación.
Efectos de CCL21 /CCR7 sobre la migración y la invasión de las células T24
los resultados de CCL21 /CCR7 en la migración y la invasión de las células T24 se presentan en la Fig. 1. Los recuentos de células para los estudios de la migración y la invasión son los siguientes: 45,5 ± 11,6 y 28,6 ± 15,0 para el grupo control, 42,5 ± 13,6 y 30,5 ± 15,2 para el grupo de anticuerpos, 72,9 ± 22,4 y 55,5 ± 13,6 para CCRL21 100 ng grupo /ml, 115,7 ± 18,8 y 102,1 ± 18,0 para CCRL21 150 ng /ml grupo, y 178,9 ± 8,4 y 143,7 ± 24,4 para CCRL21 200 ng grupo /ml. No se encontraron diferencias significativas de la migración celular entre cualquiera de los tres grupos CCL21treatment y el grupo control, tanto en los estudios de la migración y la invasión (P & lt; 0,001 para todos); pero, no se encontró ninguna diferencia entre el grupo control y el grupo de anticuerpos, ya sea en el estudio de migración o invasión del estudio (P & gt; 0,05 para ambos). El efecto del tratamiento CCL21 /CCR7 sobre la migración celular T24 es dependiente de la concentración con la concentración más alta de CCL21 (200 ng /ml) producido el mayor número de células de la migración /invasión. En general, se encontró que un número menor de células T24 en el estudio invasión que la del estudio de migración correspondiente.
El ensayo se realizó usando una cámara transwell recubierto con 30 l de solución de mezcla de Matrigel con cinco grupos diferentes que consiste en control del vehículo, anticuerpo CCR7 20 ng /ml, más CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml, y CCL21 200 ng /ml. Los datos actuales Media ± DE de cuatro experimentos independientes.
Efectos de CCL21 /CCR7 sobre la expresión de MMP-2 y MMP-9 en células T24 se presentan
Western blot resultados en la Fig. 2; mediciones cuantitativas de MMP-2 y MMP-9 se presentan en la Tabla 2. Se encontraron diferencias significativas en la expresión de MMP-2 y MMP-9 entre los cinco grupos (p & lt; 0,05). En comparación con el grupo control, las expresiones de MMP-2 y MMP-9 proteínas se incrementaron significativamente después de tres concentraciones diferentes de tratamiento CCL21 (p & lt; 0,05 para todos). Sin embargo, no se encontraron diferencias en MMP-2 o MMP-9 entre el grupo control y el grupo de anticuerpos (p & gt; 0,05 para ambos)
Carril 1:. Las células T24 tratadas con el control del vehículo; Carril 2: células T24 tratadas con anticuerpo CCR7 20 ng /ml, más CCL21 50 ng /ml; Carril 3: las células T24 tratadas con 50 ng /ml CCL21; Carril 4: células T24 tratadas con 100 CCL21 ng /ml; y carril 5: células T24 tratadas con 200 CCL21 ng /ml. Los lisados celulares se prepararon y se ejecutan en 5-15% de geles de SDS-PAGE siguientes por un análisis de transferencia Western. Beta-actina se utilizó como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.
Efectos de CCL21 /CCR7 sobre la apoptosis en las células T24
Efectos de CCL21 /CCR7 en las expresiones de Bcl-2 Bax y por Western blot se presentan en la Fig. 2 y los valores de DO se presentan en la Fig. 3. Expresión de proteínas de Bcl-21 sigue una tendencia ascendente, mientras que la expresión de Bax sigue una tendencia descendente como aumenta la concentración de CCL21. Se encontraron diferencias significativas en la expresión de Bcl-2 y Bax entre CCL21 50 ng grupo /ml y CCL21 100 grupo ng /ml (p & lt; 0,05 para ambos) y entre CCL21 50 ng grupo /ml y CCL21 200 ng /ml (p & lt ; 0,05 para ambos), pero no entre CCL21 100 ng grupo /ml y 200 ng /ml CCL21 (p = 0,545 para Bcl-2 y p = 0,191 para Bax). Una vez más, no se encontró ninguna diferencia entre el grupo control y el grupo de anticuerpos, ya sea para Bcl-2 o Bax (p & gt; 0,05 para ambos).
células T24 se trataron con control de vehículo, CCR7 anticuerpo 20 ng /ml, más CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml, y CCL21 200 ng /ml. Los valores (DO) presentes Media ± SD de tres experimentos independientes.
A principios de la apoptosis y las tasas finales de los años y las tasas totales de muerte celular después de los tratamientos se presentan en la Tabla 3. Los porcentajes de apoptosis temprana, tardía y la apoptosis la tasa global de muerte celular en el grupo de control son el 26,4 ± 5,0%, 37,5 ± 2,4% y 63,9 ± 7,1%, respectivamente; mientras que en el grupo de anticuerpos son 25,2 ± 3,8%, 35,6 ± 5,5% y 60,8 ± 9,3%, respectivamente. No hay diferencia en las tasas de apoptosis se encontró en cada etapa entre los dos grupos (p & gt; 0,05 para todos). Las tasas de apoptosis temprana, tardía apoptosis y muerte celular total se redujo después de los tratamientos CCL21 a 50, 100 y 200 ng /ml. En comparación con el grupo control, una disminución significativa de la apoptosis de células totales se encontraron en los grupos de tratamiento CCL21 (p & lt; 0,001 para los tres grupos de tratamiento); Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento CCL21 en la apoptosis de células totales (p & gt; 0,05 para todos). En comparación con el grupo control, se encontraron también disminuciones significativas en la apoptosis celular temprana en los grupos de tratamiento CCL21 (p = 0,008 para 200 ng /ml, 0.001 para 100 ng /ml, y 0,027 para 50 ng /ml); Sin embargo, de nuevo, no se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento CCL21 en apoptosis temprana (p & gt; 0,05 para todos).
Discusión
El potencial de las células cancerosas a la metástasis depende de sus interacciones con los factores homeostáticos incluyendo quimiocinas que no sólo promueven el crecimiento del cáncer y la supervivencia celular, sino también la migración y la invasión o la metástasis. Estudios previos han demostrado que las quimiocinas están implicadas en la progresión y la metástasis de varios tipos de cáncer [2, 4, 5]. CCR7 está implicada en la metástasis del cáncer a los ganglios linfáticos en varios tipos de cáncer [7-13]. CCL21 participa en la proliferación de las células T CD4, células mesangiales del riñón, y diversas células del cáncer [19, 24-27]. Nuestro estudio demostró por primera que CCL21 /CCR7 podría aumentar la proliferación de células T24 (Tabla 1), la migración y la invasión (Fig. 1).
concentración de quimioquinas puede ser al menos en parte, responsable del desarrollo del cáncer y la metástasis [ ,,,0],19, 26]. Como resultado, hemos utilizado tres concentraciones diferentes de CCL21 en el presente estudio y encontramos una manera dependiente de la concentración en los efectos sobre la proliferación celular CCL21 T24, la migración y la invasión. CCL21 puede aumentar fuertemente la migración celular y la invasión T24 a altas concentraciones y facilitar así la metástasis del cáncer de vejiga. Nuestros resultados son consistentes con estos informes anteriores.
La interacción de quimiocinas y sus receptores sirven como base para la motilidad de las células tumorales y la migración a través de la activación polimerización de actina intracelular para crear pseudópodos [28, 29]. Muller et al encontraron que CCL21 AT100 nM indujo un aumento de 1,6 veces transitoria en intracelular actina flamentous (F-actina) en células de cáncer de mama humano dentro de los 20 segundos y se observa la formación de pseudópodos distinto después de 20 min de estimulación con CCL21 [19]. Los resultados del presente estudio con la migración celular y la invasión T24 son consistent0020with estos informes anteriores. se observó disminución significativa en el número de células T24 cuando se utilizó anticuerpo CCR7 junto con CCL21 y que indica que el efecto de CCL21 depende de la actividad de CCR7. Por otra palabra, CCL21 puede activar CCR7 primero y luego afectar a la migración de células T24 y la invasión.
moléculas como CCL21 quimioquinas están implicados en la metástasis de los cánceres no sólo a través de la mediación de la migración y la invasión de las células cancerosas en los tejidos pero también proporciona los microambientes de apoyo requeridos. In vivo, la migración de las células cancerosas a menudo se ralentizó con un montón de resistencias, tales como la membrana basal y tejido conectivo circundante [29, 30]. Por lo tanto, para imitar el real en estado vivo, se utilizó transwell cámara revestido con matrigel como una barrera física para el presente estudio. MMP-2 y MMP-9 son dos proteínas que están estrechamente asociados con la metástasis del cáncer de vejiga [31-33]. la invasión de células del cáncer puede requerir la secreción de MMP tales como MMP-2 y MMP-9 para degradar el matrigel. En el presente estudio, encontramos que CCL21 podría aumentar la expresión de MMP-2 y MMP-9 y por lo tanto mejorar la invasión celular (Fig. 2 y en la Tabla 2). MMPs juegan un papel importante en la invasión de células de cáncer; Sin embargo, otros factores, tales como interleuquinas y E-cadherina también pueden contribuir a la progresión del tumor y la invasión [34-37]. No obstante, CCL21 /CCR7 puede facilitar la invasión de las células cancerosas a través de la secreción de MMP aumentar y mejorar la motilidad de las células.
El uso de técnicas de radiomarcado, los investigadores han encontrado solamente una pequeña porción de las células cancerosas radiomarcado en microcirculations tiene el potencial de hacer metástasis [38] . La supervivencia de las células cancerosas depende de sus capacidades anti-apoptóticas. Cuando las células tumorales dejan sus tejidos originales, perderán algunos, si no todos los factores homeostáticos que incluyen quimiocinas para la adhesión y el apoyo; por tanto, las células son propensas a la apoptosis. En el presente estudio, la capacidad antiapoptótica de células CCL21 INT24 se investigó mediante citometría de flujo por la anexina V-FITC tinción /PI a través de la apoptosis inducida por ADM. La fosfatidilserina (PS) se puede unir específicamente anexina-V. PI, un agente de tinción nuclear, no puede atravesar la membrana celular normal. En la fase temprana de la apoptosis, PI tinción nuclear no puede ser detectada como la membrana celular está intacta. Sin embargo, como célula sufre apoptosis en el medio a las fases finales de los años, las ampollas de la membrana celular y ya no está intacta; así núcleo se puede detectar a través de la tinción PI
El resultado de la citometría de flujo se puede dividir en cuatro cuadrantes:. el cuadrante izquierdo inferior con las células normales vivos [Anexina-V (-), PI (-)], el cuadrante superior derecho [Anexina-V (+), PI (+)] con fines de apoptosis o células necróticas, el cuadrante inferior derecho [Anexina-V (+), PI (-)] con células apoptóticas tempranas, y la parte superior izquierda cuadrante [Anexina-V (-), PI (+)] con pequeñas porciones de restos de células debido a la lesión mecánica y la apoptosis. Por lo tanto, el análisis de la apoptosis depende principalmente de la apoptosis temprana (cuadrante inferior derecho) y la muerte celular total (parte superior derecha + inferiores cuadrantes de la derecha) en el presente estudio. Nuestros resultados demostraron una disminución significativa de la apoptosis y la muerte celular con el tratamiento CCL21 en comparación con el control (p & lt; 0,01); sin embargo, no se encontraron diferencias entre el anticuerpo CCR7 más el tratamiento CCL21 y el control (p & gt; 0,05). Los resultados indican que el anticuerpo CCR7 podría antagonizar el efecto de CCL21 sobre la apoptosis y la muerte celular y por lo tanto confirmar la función antiapoptótica de CCL21 /CCR7. Sin embargo, no se detectaron diferencias de apoptosis entre los tres grupos de tratamiento (p & gt; 0,05). La posible causa podría ser que CCL21 en 50 ng /ml alcanza la condición saturar así concentraciones más altas no podían aumentar más su aplicación.
Se encuentra
familia Bcl-2 a estar estrechamente relacionada con la apoptosis celular [39-41]. Bcl-2 y Bax son las dos proteínas más importantes de la familia Bcl-2 con Bcl-2 inhibición de la apoptosis, mientras que Bax promoción de la apoptosis. Estas dos proteínas están presentes en dímeros, tales como Bcl-2 /Bcl-2 y Bax /Bax. Upregulation de Bcl-2 expresión conducirá a la adicional Bcl-2 para combinar con la formación de Bax así Bcl2 /Bax inhibir la apoptosis de células; mientras que con la regulación por disminución de la expresión de Bcl-2, la cantidad de la forma combinada de Bcl2 /Bax disminuirá y por lo tanto promover la apoptosis de las células. En el presente estudio, se determinó la expresión de las proteínas Bcl-2 y Bax en las células T24 en todos los grupos experimentales, incluyendo el control. CCL21 podría aumentar Bcl-2 expresión de la proteína, pero disminuir la expresión de proteínas Bax y los efectos exhibido de una manera dependiente de la concentración CCL21 entre 50 ng /ml y 100 ng /ml. Curiosamente, no se encontró ninguna diferencia significativa en las expresiones de Bcl-2 y Bax entre CCL21 en 100 ng /mL y 200 ng ml CCL21 /(Bcl-2: p = 0,545; Bax: p = 0,191); la causa puede ser que CCL21 llegado a una cierta concentración no superior a 100 ng /ml por sus máximos efectos anti-apoptóticos (Fig. 3). El pretratamiento de anticuerpo CCR7 podría revertir casi completamente el efecto de CCL21 en las expresiones de Bcl-2 y Bax y la apoptosis (Fig. 3 y en la Tabla 3). Esto confirma aún más el papel vital de CCR7 sobre los efectos de CCL21 en células T24
Conclusión
CCL21 /CCR7 promovió la proliferación de células T24 en un patrón dependiente de la concentración y mejoró su migración y la invasión.; estos efectos pueden estar relacionados con el aumento de la expresión de MMP-2 y MMP-9. CCL21 /CCR7 tenía actividades antiapoptóticas en las células T24; estas funciones pueden estar relacionadas con la regulación de las proteínas Bcl-2 y Bax. Nuestros resultados indican que CCL21 /CCR7 puede promover el desarrollo del cáncer de vejiga y la metástasis.