Extracto
Anteriormente, se confirmó que los receptores de quimioquinas CC 7 (CCR7) promueve la proliferación celular a través de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) vía, pero su papel en la apoptosis de cáncer de pulmón de células no pequeñas ( CPNM) líneas celulares sigue siendo desconocido. Se utilizaron células A549 y H460 de NSCLC para examinar el efecto de CCL21 /CCR7 sobre la apoptosis mediante citometría de flujo. Los resultados mostraron que la activación de CCR7 por su ligando específico, ligando quimiocina exógeno 21 (CCL21), se asoció con una disminución significativa en el porcentaje de apoptosis. Western blot y ensayos de PCR en tiempo real indicaron que la activación de CCR7 causó significativamente la regulación positiva de anti-apoptótica de Bcl-2 y regulación a la baja de bax pro-apoptótica y la caspasa-3, pero no p53, tanto a la proteína y los niveles de ARNm. CCR7 pequeños ARN de interferencia atenuó significativamente estos efectos de CCL21 exógeno. Además, PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, abolió significativamente estos efectos de CCL21 /CCR7. Coimmunoprecipitation confirmó además que no había una interacción entre p-ERK y bcl-2, bax, o caspasa-3, en particular en presencia de CCL21. Estos resultados sugieren fuertemente que CCL21 /CCR7 previene la apoptosis por la regulación positiva de la expresión de bcl-2 y por la regulación negativa de la expresión de Bax y la caspasa-3 potencialmente a través de la vía de ERK en las células A549 y H460 de NSCLC
Visto.: Xu Y, Liu L, Qiu X, Z Liu, Li H, Li Z, et al. (2012) CCL21 /CCR7 previene la apoptosis a través de la vía ERK en humano de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (3): e33262. doi: 10.1371 /journal.pone.0033262
Editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Ojos & amp; Ear Infirmary, Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Noviembre 2011; Aceptado: 6 Febrero 2012; Publicado: 16 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las quimioquinas, una familia de pro de bajo peso molecular citoquinas-inflamatorio, se han descrito como mediadores importantes no sólo en el tráfico celular, el desarrollo de órganos, la remodelación de tejidos, y la metástasis del tumor [1] - [3], pero en otros eventos biológicos, tales como la angiogénesis, la linfopoyesis, proliferaciones, y la apoptosis [ ,,,0],4], [5]. Sus actividades biológicas están mediadas por la interacción con la familia de receptores de quimiocinas de receptores acoplados a proteína G (GPCR) (es decir, C, receptores de CC, CXC, y CX3C) [6]. C-C del receptor de quimioquinas 7 (CCR7), uno de los receptores de quimiocinas CC, se expresa en todas las células T ingenuas, algunas células T de memoria, células B y células dendríticas maduras [7]. CCR7 interactuó con sus ligandos, quimioquinas ligando 19 (CCL19) y ligando quimiocina 21 (CCL21) [8], desempeña un papel importante en el tráfico de linfocitos y mensajeras a los ganglios linfáticos durante las reacciones inmunes e inflamatorias [9] - [11].
Nuestro estudio anterior demuestra que CCR7 es altamente expresado en el cáncer no microcítico de pulmón de células humanas (CPNM) las células, y que CCL21 /CCR7 promueve la proliferación de A549 y H460 células de NSCLC vía quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) vía [ ,,,0],12], [13]. ERK, un miembro de la familia de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), está relacionada con la proliferación celular, la diferenciación, la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la apoptosis [14] - [17]. Sin embargo, el papel de CCR7 en la apoptosis de las células de NSCLC humanos no ha sido dilucidado.
El propósito de este estudio fue examinar el efecto y mecanismo de regulación de la interacción CCL21 /CCR7 sobre la apoptosis de A549 y H460 NSCLC humano Células. Hemos demostrado aquí que CCL21 /CCR7 previene la apoptosis celular mediante la regulación positiva de la expresión de anti-apoptótica de Bcl-2 y por la regulación negativa de la expresión de bax pro-apoptótica y la caspasa-3, pero no p53, que es potencialmente mediada a través de la vía de ERK en el células de NSCLC. Este estudio proporcionó novela evidencia de los mecanismos de supervivencia de células de cáncer de CCR7 mediada y puede ser útil para explorar objetivo de tratamiento de NSCLC.
Resultados
CCL21 /CCR7 previene la apoptosis de A549 y H460 Células. En nuestro estudio anterior, hemos identificado un nivel de expresión CCR7 mayor en A549 y líneas celulares de cáncer humano H460, y su activación promueve la proliferación celular [12], [13]. Para determinar si la activación de CCR7 también influye en la apoptosis de las células A549 y H460, la activación y la inhibición CCR7 fueron inducidos con CCL21 exógeno y con CCR7 pequeños ARN de interferencia (siRNA), respectivamente [13]. ensayo de tinción con anexina V se realizó mediante citometría de flujo para determinar el efecto de CCL21 /CCR7 sobre la apoptosis de las células A549 y H460. Como se muestra en la Figura 1, la proporción de células pre-apoptóticos en el grupo CCL21 redujo significativamente, en comparación con los otros (todo
P
& lt; 0,01), mientras que no hubo diferencias significativas entre los otros (todos los
P
& gt;. 0,05), lo que implica que la activación de CCR7 puede inhibir la apoptosis de las células A549 y H460 mientras que el efecto de CCL21 puede ser abolida por la inhibición de CCR7
A549 (A) y H460 las células (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de la transfección con CCR7 siRNA (siCCR7). Después del tratamiento, la apoptosis se estimó mediante tinción con Anexina V como se describe en Métodos. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ** P & lt; 0,01, en comparación con células de control
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de la transfección con CCR7 siRNA (siCCR7. ). Después del tratamiento, la expresión de bcl-2, bax, caspasa-3 y p53, tanto la proteína (a) y ARNm (b) se estima a través de transferencia de western (a) y PCR en tiempo real (b) como se describe en Métodos. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con células de control
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de la exposición a PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, por 1 h. Después del tratamiento, la apoptosis se estimó mediante la tinción con anexina V. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, en comparación con células de control
A549 (A) y las células H460 (B) fueron tratados con CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h después de la exposición a PD98059, un inhibidor selectivo. de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, por 1 h. Después del tratamiento, los niveles de expresión de estos componentes se estimaron mediante Western blot. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt;. 0,01, en comparación con las células control
células A549 (A) y H460 (B) en la ausencia o presencia de CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra bcl-2 o IgG, seguido de Western Blot para bax y la caspasa-3 (a). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra bax o IgG se analizaron por Western blot para bcl-2 y la caspasa-3 (b). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra la caspasa-3 o IgG se analizaron por Western blot para bcl-2 y bax (c).
La inhibición de la apoptosis está implicada en la regulación de anti-apoptótica de Bcl-2 y de pro-apoptótica Bax y la caspasa-3, pero no p53 en células A549 y H460. Se ha establecido que la apoptosis en las células es principalmente implicada en la expresión de bcl-2, bax, caspasa-3, o p53 [4], [18] - [20]. Para determinar la posible mecanismo por el cual la activación de la apoptosis CCR7 inhibido de las células A549 y H460, se realizaron western blot y ensayos de PCR en tiempo real. Como se muestra en la Figura 2, la expresión en ambos niveles de proteína y ARNm de anti-apoptótica de Bcl-2 y de bax pro-apoptótica y la caspasa-3 se upregulated respectivamente y downregulated en grupo CCL21, en comparación con los otros (todo
P Hotel & lt; 0,01), mientras que no hubo diferencias significativas entre los otros (todos los
P Hotel & gt; 0,05). Curiosamente, la expresión de p53 pro-apoptóticos no ha sido alterado (
P Hotel & gt; 0,05). Estos resultados indican que la función de CCR7 como un inhibidor de la apoptosis de las células de NSCLC se implementa predominantemente posiblemente por las vías de bcl-2, bax, y la caspasa-3, pero no p53.
CCL21 /CCR7 regula la expresión de bcl-2, bax y la caspasa-3 a través de la vía de ERK. Nuestro estudio anterior confirmó que la interacción CCL21 /CCR7 aumenta la fosforilación de ERK (p-ERK) en A549 y H460 células [13]. Para determinar si la vía de ERK también está involucrado en la acción anti-apoptótica de CCL21 /CCR7, las células se trataron con PD98059, un inhibidor selectivo de MEK que interrumpe la activación de ERK aguas abajo, por 1 h. Se encontró que PD98059 abolió significativamente CCL21 /efectos anti-apoptóticos CCR7 mediada (Figura 3) y las alteraciones en la expresión de bcl-2, bax y la caspasa-3 (Figura 4). Curiosamente, PD98059 solo (tratamiento de 1 h) tuvo un efecto significativo sobre la expresión de bcl-2, pero no en la expresión de Bax y la caspasa-3 y la apoptosis. Como bax se ha demostrado que es un efector aguas abajo de la vía de bcl-2-regulada de la apoptosis y la activación de bcl-2 se puede promover la liberación de bax, dando lugar a la activación de caspasas [21], [22], se trató de examinar si existe una interacción entre Bcl-2, Bax y capspase-3. Sus interacciones fueron confirmadas por los resultados de coimmunoprecipitation (Figura 5).
La fosforilación de ERK, inducida por CCL21 /CCR7, interactúa con bcl-2, bax, o la caspasa-3. Para identificar además si hay una interacción entre p-ERK y bcl-2, bax, o caspasa-3, se realizó coimmunoprecipitation. células A549 y H460 en la ausencia o presencia de CCL21 durante 24 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra p-ERK o IgG, seguido de Western Blot para bcl-2, bax y la caspasa-3. Se observó una interacción pronunciada, específica entre p-ERK y bcl-2, bax, o caspasa-3, especialmente cuando las células fueron tratadas con CCL21 durante 24 h (Figura 6a). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra bcl-2, bax, caspasa-3, o IgG se evaluó mediante Western blot para p-ERK, y de nuevo, la interacción entre p-ERK y bcl-2, bax, o la caspasa-3 fue saliente, especialmente en presencia de CCL21 (Figura 6b).
A549 (a) y las células H460 (B) en la ausencia o presencia de CCL21 (100 ng /ml) durante 24 h se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra p-ERK o IgG, seguido de Western Blot para bcl-2, bax y la caspasa-3 (a). inmunoprecipitación recíproca con anticuerpos contra Bcl-2, Bax, caspasa-3 o IgG se analizaron por Western Blot para p-ERK (b).
Discusión
Nuestra anterior estudios han documentado que la activación de CCR7, CCL21 inducida por su ligando, puede promover la proliferación de células y mediar su metástasis en los ganglios linfáticos en las células de NSCLC [12], [13]. Sin embargo, el papel de CCL21 /CCR7 en la apoptosis de NSCLC sigue siendo vaga. En el presente estudio, hemos demostrado que CCL21 /CCR7 previene la apoptosis en las células A549 y H460 de NSCLC, que es potencialmente mediada a través de la vía ERK.
Bcl-2 y Bax son reguladores de la vía intrínseca de apoptosis celular, el que se regula la integridad de la membrana mitocondrial externa [21], [23], [24]. Se ha demostrado que algunos miembros de la familia bcl-2 situados en la membrana mitocondrial (por ejemplo, bax, bcl-XL, MCL-1, bcl-2, y Bid) pueden alterar la permeabilidad de la membrana mitocondrial y desencadenar la activación de caspasas , lo que lleva a la muerte celular por apoptosis [25] - [27]. De acuerdo con los resultados de los diferentes modelos de células [4], [18], [20], [28] - [30], nuestros resultados mostraron que la activación de CCR7 impidió la apoptosis, lo que resulta en un aumento de la expresión de bcl anti-apoptótica -2 y una disminución en la expresión de Bax pro-apoptótica y la caspasa-3. Curiosamente, este efecto inhibidor no fue obviamente relacionada con la vía de p53. Además, p53 no tiene ningún impacto significativo en la expresión de CCR7 [31].
Nuestro estudio anterior ha indicado que la activación de CCR7 puede mejorar la fosforilación de ERK en las células A549 y H460 [13], que es coherente con varios estudios que utilizan otros tipos de células [20], [28], [32] - [43]. En este estudio, hemos examinado el papel de la fosforilación de ERK en CCL21 /CCR7 mediada por anti-apoptosis de las células A549 y H460. Se encontró que CCL21 acción anti-apoptosis /CCR7 mediada relacionada con la expresión de bcl-2, bax y la caspasa-3 podría ser abolida mediante el tratamiento con PD98059. PD98059 solo (tratamiento de 1 h) tuvo un efecto significativo sobre la expresión de bcl-2, pero no en la expresión de Bax y la caspasa-3 y la apoptosis. Además, los resultados coimmunoprecipitation confirmaron que no había una interacción entre bcl-2, bax, y la caspasa-3. La razón de la ausencia de alteración en la expresión de Bax y la caspasa-3 es posiblemente debido a la limitación de tiempo observado porque bax y la caspasa-3 se ha demostrado que los efectores de la vía de bcl-2-regulada de la apoptosis [21] , [22].
Como CCL21 /CCR7 era capaz de regular la expresión de Bcl-2, Bax, y la caspasa-3, hemos tratado de determinar si existe una interacción entre p-ERK y Bcl-2 , bax, o la caspasa-3. Coimmunoprecipitation y de inmunoprecipitación recíproca resultados sugieren firmemente que existe una interacción entre p-ERK y bcl-2, bax, o caspasa-3, especialmente en la presencia de CCL21. Estos resultados demuestran que el efecto de CCL21 /CCR7 sobre la apoptosis de células que participan en la expresión de bcl-2, bax y la caspasa-3 se puede producir a través de la vía de ERK en las células de NSCLC humanos.
Este estudio sugiere que la activación de CCR7, inducida por CCL21, puede prevenir de manera significativa la apoptosis de células de NSCLC, que es potencialmente mediada a través de la vía de ERK. Esta información puede ayudar a aclarar los mecanismos de supervivencia de las células del cáncer e identificar objetivos potenciales para el tratamiento del NSCLC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
A549 y H460 líneas celulares de nuestro trabajo publicado anterior [12], [13] se cultivaron en medio RPMI-1640 o DMEM-F12 suplementado con 10% de suero HyClone bovino fetal (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.) en una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células fueron cultivadas en 75 cm
2 matraces de cultivo y se recogieron en una solución de tripsina-EDTA en la fase de crecimiento logarítmico.
Bcl-2, bax, caspasa-3, p-ERK, IgG, y β-actina de anticuerpos monoclonales de ratón o de conejo se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). CCL21 humana recombinante era de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Lipofectamine 2000 fue de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Las secuencias de siCCR7 y control de siRNA y el método de transfección se han reportado en otro documento [13]. PD98059 se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.) y se usó a 50 mM (concentraciones finales) de acuerdo con los informes anteriores [13], [41], [44], [45]. Proteína A /G cuentas eran de Beyotime (Haimen, China).
Anexina V tinción
Después del tratamiento con CCL21 durante 24 h, se recogieron las células y se lavaron dos veces con PBS frío por agitación suave. Se añadieron a suspender las células tampón de unión (1 x) y la densidad celular ajustado a 2-5 × 10
5 /ml. En la oscuridad, 5 l de Anexina V-FITC (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 1% de BSA, 0,02% de azida de sodio, pH 7,4) se añadió a la suspensión de células de la mezcla de 195 l y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente antes de añadir 190 l de tampón de unión (1 x) y 10 PI l. Diez mil eventos por muestra fueron adquiridas mediante un FACS-scan citómetro de flujo (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) y el porcentaje de apoptosis de las células fueron analizados utilizando el software de análisis CellQuest (Becton-Dickinson).
El análisis de transferencia Western
Después del tratamiento con CCL21 de 24 h, las células se extrajeron con tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,1% de SDS, 2 mg /ml de aprotinina y PMSF 1 mM) durante 30 min a 4 ° C. Los extractos fueron centrifugados a 12.000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C. Se recogieron los sobrenadantes que contienen proteína total entonces. Las alícuotas, conteniendo cada uno 50 mg de proteínas, se separaron por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF a 40 V durante 2 horas a baja temperatura. Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 2 h, y las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos monoclonales a una dilución 1:200 durante la noche a 4 ° C. Las proteínas se visualizaron utilizando anti-ratón o anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en 1:6000 (caspasa-3, p53, bax) o 1:8000 (los otros) de dilución para 2 h a temperatura ambiente, respectivamente . Se obtuvieron imágenes de las bandas con un sistema de imagen EC3 (UVP LLC, Upland, CA, EE.UU.), y la densidad óptica (DO) se midió usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). La diferencia entre las proteínas de la prueba OD y β-actina de la misma muestra se calculó como contenido relativo y expresó gráficamente.
-PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado de las células utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó en un sistema rápido ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.), utilizando SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Dalian, China). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un volumen total de 20 l y a ciclos 40 veces después de la desnaturalización inicial (95 ° C durante 30 s) con los siguientes parámetros: 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 y β-actina se utilizó como control interno [13], [46]. La fiabilidad de los resultados de la PCR fue apoyada por el análisis de la curva de disociación. En tiempo real PCR datos se calcularon utilizando el 2
método -ΔΔCT en el paquete de software SDS 2.4 (Applied Biosystems) [47].
coimmunoprecipitation
Después del tratamiento con CCL21 durante 24 h , las células se extrajeron con tampón de lisis (mM KCl 10, MgCl 1,5 mM
2, HEPES 10 mM [pH 7,9], mM PMSF 1 mM, DTT 1) y se homogeneizó durante 30 min a 4 ° C. Los extractos se centrifugaron a 12.000 x
g
durante 15 min a 4 ° C, y los sobrenadantes que contienen proteína total se cosecharon. Cantidades iguales de proteína fueron expuestos a anticuerpos contra p-ERK, bcl-2, bax y la caspasa-3, que se inmovilizaron en proteína /G cuentas a. Después de 3 h de incubación a 4 ° C con rotación suave, las perlas se lavaron extensivamente cinco veces con tampón de lisis, hervidas, y microcentrifugaron. Las proteínas se detectaron con anticuerpos contra p-ERK, Bcl-2, Bax y la caspasa-3 por Western blot.
El análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago , IL, EE.UU.). Se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias entre los grupos con diferentes tratamientos, y se utilizó la mínima diferencia significativa (LSD) o la prueba de Dunnett T3 para el análisis de subgrupos post hoc. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos para p & lt; 0,05. Los valores de N veces para la expresión de genes cambian hasta 0,5 y por debajo de 2 se tomaron como no significativa, de acuerdo con los valores obtenidos a partir de genes de control negativo [47], [48].