Extracto
El receptor de quimioquinas CCR6 Recientemente se ha demostrado que se asocia con el cáncer colorrectal (CCR ) progresión. Sin embargo, la evidencia directa de si CCR6 en los tumores es un marcador pronóstico para la supervivencia de los pacientes con CCR y si desempeña un papel crítico en la metástasis CRC
in vivo
que falta. Aquí nos muestran que los niveles de CCR6 se upregulated en líneas celulares de CRC y muestras clínicas primarias CRC. upregulation CCR6 estaba estrechamente correlacionada con estadios de la enfermedad y el tiempo de supervivencia de pacientes con CRC. Desmontables de CCR6 inhibe la migración de células CRC
in vitro
. La sobreexpresión de CCR6 en las células CRC aumentó su proliferación, la migración y la formación de colonias
in vitro Opiniones y promovido su potencial metastásico
in vivo
. CCR6 activa Akt señalización, genes de metástasis upregulated y downregulated genes supresores de metástasis. la orientación selectiva de CCR6 en tumores inhibe drásticamente el crecimiento de CRC en ratones. Por lo tanto, la expresión tumoral de CCR6 juega un papel crítico en la metástasis CRC, upregulated CCR6 predice la supervivencia pobres en pacientes con CRC, y la orientación expresión de CCR6 en los tumores puede ser una estrategia terapéutica potencial para el CDN
Visto:. Liu J, Ke F, Xu Z, Z Liu, Zhang L, Yan S, et al. (2014) CCR6 es un marcador pronóstico para la supervivencia global en pacientes con cáncer colorrectal, y su sobreexpresión potencia la metástasis
En Vivo
. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10.1371 /journal.pone.0101137
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 26 Enero, 2014; Aceptado: June 3, 2014; Publicado: 30 de junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y 973 del programa (nº: 91029730, No: 81202304, No: 2012CB917100, No: 2010CB529700 y n: 30972787), por el Programa de profesor de Designación Especial (Eastern Académico) en Shanghai instituciones de educación superior, por parte de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (No: 09140902600), por parte del líder del Proyecto Académico Disciplina de la Comisión de Educación Municipal de Shanghai (n: J50208 y no: J50207), por el Programa de Pujiang Shanghai (n: 10PJ407300 ), y por el Comité de Shanghai de Ciencia y Tecnología (11DZ2260200). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud en todo el mundo. Aunque se ha hecho un progreso sustancial en la última década, los retos del tratamiento de la CRC y sus metástasis siguen siendo formidables [1]. En la actualidad, a pesar del uso de fármacos activos específicos para el tratamiento del CCR metastásico cada vez más popular, las tasas de curación son bajos y los mecanismos moleculares subyacentes para la metástasis orientada al órgano de CRC no se entienden completamente.
Las quimiocinas son 8 - a los péptidos 12-kDa que funcionan como las citoquinas quimiotácticas y ejercen sus efectos biológicos mediante la interacción con los receptores de quimioquinas proteína transmembrana ligada G. Una serie de quimiocinas y sus receptores correspondientes se sabe que juegan un papel importante en el tráfico de leucocitos y homing, especialmente en sitios de inflamación, daño tisular y la migración celular maligna [2], [3]. Curiosamente, mientras la mayoría de los receptores de quimiocinas se unen a múltiples quimioquinas, el receptor de quimioquinas CCR6 sólo tiene un ligando quimioquina, CCL20 (anteriormente conocido como macrófagos proteína-3α inflamatoria o MIP-3α) [4].
CCR6 se expresa principalmente en los leucocitos, con expresión en linfocitos maduros, especialmente en células de memoria [4], las células dendríticas inmaduras (DC) de linajes particulares [5] y la migración de las células T reguladoras [6]. En la mayoría de los casos, CCR6 está ausente de granulocitos (excepto los neutrófilos activados), células monocíticas, linfocitos inmaduros y madura países en desarrollo [7] - [9]. CCL20 muestra tanto la expresión constitutiva e inducible, principalmente en los tejidos linfoides asociados a la mucosa y en el hígado [10], y la tasa de expresión basal se incrementa en condiciones inflamatorias [11]. El nivel de expresión basal de CCL20 se cree que regulan la migración de las células dendríticas inmaduras que expresan CCR6 y linfocitos de memoria de la sangre para la vigilancia homeostático. La regulación al alza de CCL20 durante la inflamación puede aumentar la migración de estos dos tipos de células en el tejido [12] - [14]. Para los cánceres humanos, los datos acumulados implican una asociación entre el sistema de receptor de quimioquinas de quimiocinas y el potencial metastásico de las células cancerosas. Por ejemplo, las células tumorales de al menos 23 diferentes tipos de cánceres humanos de epitelial, mesenquimal y origen hematopoyético expresa CXCR4 [15], [16]. CCR7 también se encontró en mama, gástrico, y cáncer epidermoide de esófago, y su expresión se correlaciona con mal pronóstico [15], [17], [18]. Todos estos estudios muestran que la expresión de receptores de quimioquinas en la metástasis del cáncer no es aleatoria.
El CCR6 receptor de quimioquinas es de particular interés en la metástasis de hígado del cáncer colorrectal. Su único CCL20 ligando de quimiocina se expresa predominantemente en el tejido linfático y en el hígado [19]. Según informes, la expresión aberrante de la CCR6 receptor de quimioquinas en las células de CRC está implicada en la metástasis de órganos selectivo del tumor [20], [21]. Sin embargo, la directa
in vivo
evidencia que apoya un papel para CCR6 en la metástasis de CCR es deficiente. En el presente estudio se encontró que la expresión de CCR6 regulada por incremento en las líneas celulares con CCR metastásico predijo pobres de supervivencia para los pacientes con CCR. La sobreexpresión de CCR6 fue suficiente para promover la metástasis de las células CRC tanto
in vitro
y
in vivo
. bloquear selectivamente la función CCR6 inhibió dramáticamente el crecimiento de la CRC en ratones. CCR6 exhibe un papel directo en la metástasis de CCR humana, posiblemente mediante la regulación de genes relacionados con la metástasis.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por la Ética Comités del hospital de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, china.
Todos los ratones se mantuvieron bajo de patógenos específicos (SPF) libre de condiciones en el cumplimiento de los Institutos nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y uso de Laboratorio los animales y con la aprobación (SYXK-2003 hasta 0026) del Consejo de Investigación Científica de la Jiao Tong Escuela de Medicina, Shanghai, china, la Universidad de Shanghai. Para mejorar cualquier sufrimiento de los ratones observados durante estos estudios experimentales, los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación.
A microarray de tejido incluyendo 191 cáncer colorrectal humano y las correspondientes muestras de para-tumorales fue adquirido desde el Centro Nacional de Ingeniería de biochips en Shanghai. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del donante para el uso de sus muestras con fines de investigación. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la resección quirúrgica. Los tejidos de colon no cancerosos adyacentes se obtuvieron de un mínimo de 2 cm de distancia del tumor para garantizar que estos tejidos estaban libres de células cancerosas. Las muestras fueron fijadas de manera rutinaria en formalina al 10% en el período postoperatorio inmediato y embebidos en parafina dentro de las 24 horas de la extracción.
Ratones
C57BL /6J, ratones Balb /c y B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (designado como CCR6
- /-). ratones fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)
las líneas celulares de CRC y cultivos celulares
Un inmortalizan células de riñón embrionario humano línea, HEK293T, se cultivó en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM, Hyclone) con suero bovino fetal al 10% (FBS). La línea celular colorrectal ratón CMT93 se mantuvo en DMEM suplementado con 10% FBS. Otra línea celular colorrectal ratón, CT26, se mantuvo en medio RPMI-1640 con 10% de FBS. HEK293T, CMT93, CT26 y siete líneas celulares de CRC humanos, las células Caco-2, SW480, HT-29, HCT116, SW1116, SW620 y LoVo, se obtuvieron todos desde el Banco de Células de la Comisión de Type Culture Collection de la Academia China de Ciencias (Shanghai, china), en el que se caracterizaron por la huella de ADN, detección de micoplasma, y la vitalidad celular. Caco-2 células fueron cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle (Gibco) con 20% de FBS. células HT-29 y HCT116 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Gibco) con 10% de FBS. SW1116, se cultivaron las células SW480 y SW620 en de Leibovitz L-15 (Gibco) con 10% de FBS. LoVo se cultivaron en F-12K (Gibco) con 10% de FBS. Todas las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire, excepto SW1116, SW480 y SW620, que se hicieron crecer en 100% de aire a 37 ° C.
Inmunohistoquímica
para immunohischemistry, secciones de tejido (5
m) se cortaron a partir de bloques de rutina, de-con parafina con xileno, rehidratada, y se sometió métodos inducidos por calor a la recuperación de epítopo (HIER) antes de la incubación con los anticuerpos apropiados. Las secciones se sumergieron en 10
mM de tampón de citrato de sodio a pH 6,0 y se calentaron a continuación en una olla a presión durante 10
min. Después de enjuagar en agua corriente y PBS, las secciones se incubaron en solución de bloqueo /5% de suero normal de cabra TBST durante 0,5 hr a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo anti-CCR6 humano monoclonal (dilución 1:50; R & amp; D System, clon:#53103). Esta dilución se considera óptimo después de la titulación de anticuerpos utilizando amígdala humana como control positivo. Un ratón irrelevante IgG
anticuerpo 2b se utilizó como un control de isotipo en todos los casos para demostrar que la tinción era específica para CCR6. Al día siguiente, las secciones se marcaron con un anticuerpo secundario conjugado a HRP apropiado, desarrollado con diaminobenzaminidine (DAB) y de contraste con hematoxilina.
Evaluación de Immunohischemistry tinción
Para la evaluación visual, la evaluación de inmunotinción se realizó de forma independiente por dos patólogos que desconocían los datos clínicos de los pacientes. Como realizado previamente por otros [18], hemos creado una puntuación inmunorreactiva multiplicando la puntuación para el porcentaje de células positivas, y la puntuación de intensidad de la tinción. La puntuación para el porcentaje de células tumorales positivas se calificó de la siguiente manera: 0, ninguno; 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; y 4, 75 a 100%. la intensidad de la inmunotinción fue calificado de la siguiente manera: 0, ninguno; 1, débil; 2, intermedio; y 3, intenso. Dividimos todas las muestras (n = 191) en dos grupos (expresión baja o alta CCR6) de acuerdo con el principio de la mediana. Para comparar la expresión diferencial CCR6 en los tejidos del colon cancerosas y tejidos adyacentes normales de la misma en cada etapa clínica, la cuantificación de la intensidad de la inmunotinción CCR6 específica se realizó utilizando software gel imagen (IPWIN60). En pocas palabras, la inmunotinción CCR6 de todos los tejidos del colon y los tejidos cancerosos de colon no cancerosas adyacentes emparejados en el chip de matriz de tejido se fotografiaron con un microscopio con un aumento de 100 veces (Carl Zeiss). El software gel imagen (IPWIN60) se utilizó para calcular los valores de DO en imágenes capturadas. Se utilizó el valor de la DO media de tres fotos de cada núcleo en las diapositivas de la matriz de tejido, y la expresión diferencial de CCR6 en el tumor y los tejidos adyacentes normales igualada en cada etapa clínica se compararon.
Curación de Heridas Ensayo
HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr, SW1116
CCR6, SW480
shCtr, SW480
shCCR6, LoVo
shCtr y LoVo
shCCR6 células fueron sembradas por separado en seis pocillos, cultivadas hasta casi el 80% de confluencia, y el suero de hambre durante 24
hrs. heridas artificiales fueron creados mediante el raspado de las monocapas con una μ l
punta estéril de 10
, y las células se lavaron con PBS varias veces para eliminar las células flotantes. Imágenes representativas de células que migran en las heridas fueron capturados después de las 0 horas y las 24 horas bajo un microscopio (20 x).
Transwell migración de ensayo
cámaras
Transwell que consta de un filtro de membrana de tamaño de poro de 8 micras se utilizaron inserciones (Corning, EE.UU.) para determinar la capacidad de la migración celular. FBS se utilizó como quimioatrayente. En pocas palabras, HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr, SW1116
CCR6, SW480
shCtr, SW480
shCCR6, LoVo
shCtr y LoVo
shCCR6 células y se resuspendieron en medio libre de suero. Una cantidad de 3 × 10
se añadió 4 células en la cámara superior y se incubaron durante 24
horas a 37 ° C. Las células que habían migrado a través de la membrana a la superficie inferior se fijaron con metanol frío durante 10
min, se tiñeron con cristal violeta al 0,1% durante 30
min, se lavó, se secó al aire, fotografiado y representaron .
Formación de colonias Ensayo
HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
y Ctr SW1116
CCR6 células fueron sembradas por separado en placas de seis pocillos a una densidad de 600 células /pocillo. Los medios se cambian dos veces por semana, y después de 14 días, las células se fijaron con metanol durante 10 min, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 15 minutos, se enjuagaron tres veces con PBS para eliminar el exceso de colorante, se fotografiaron y se contaron.
Análisis Western Blot
Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados para el Western Blot: CCR6 humana (# 14-1969, eBioscience ™ San Diego, EE.UU.), ratón CCR6 (# ab78429, Abcam), β-actina ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) conejo mAB (# 4691, la tecnología de señalización celular),, fosfo-Akt (Thr308) (C31E5E) conejo fosfo-Akt (Ser473) conejo mAB (# 4060, la tecnología de señalización celular) mAB (# 2965, la tecnología de señalización celular), p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (137F5) mAb conejo (# 4695, la tecnología de señalización celular), fosfo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) conejo mAB (# 4376, Cell Signaling Technology). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626201, Biolegend), uPAR (# SC-10815, Santa Cruz Biotechnology), CDH1 (# 3195P, la tecnología de señalización celular), KISS-1 (# SC-18134, Santa Cruz de Biotecnología ), y TIMP2 (# 635401, Biolegend). Se realizó análisis de transferencia Western tal como se publicó anteriormente [22].
Vector Construction
El vector lentiviral PGC-FU-Luc se construyó mediante la introducción del gen de la luciferasa de luciérnaga (Luc) corriente abajo del promotor CMV en el vector de plásmido PGC-FU que lleva el gen de resistencia a neomicina. El vector lanzadera lentiviral pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 se construyó a sobreexpresan de forma estable CCR6 en Luc-HCT116. Brevemente, la secuencia codificante de 1125 pb del CCR6 humana (NM_004367) se amplificó a partir del molde de ADNc de PBMC humanos y se subclonó en los sitios XhoI y BamHI del vector pLVX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, EE.UU.). El vector lentiviral pLVXshRNA2 de transporte (Clontech Laboratories, EE.UU.) se utilizó para expresar shRNAs a partir del promotor U6. Además de expresar shRNAs, pLVX-shRNA2 también expresa la proteína verde fluorescente ZsGreen1. Para la caída de CCR6, cuatro secuencias diana fueron diseñados. Las secuencias diana usadas fueron las siguientes: shCCR6-1, 5'-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 '; shCCR6-2, 5'-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 '; shCCR6-3, 5'-TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 '; shCCR6-4, 5'-GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 '. control mezclado, 5'-TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 '. En resumen, los oligonucleótidos de ADN complementarios que consistía en un 21 nucleótidos de secuencia específica, seguido de la secuencia de bucle (CTCGAG) y finalmente el complemento inverso de la secuencia de direccionamiento se sintetizaron, recocido, y se inserta en pLVX-shRNA2 vector (Clontech) entre BamHI y sitios EcoRI aguas abajo del promotor U6. Cuatro plásmido lanzadera pLVX-shRNA2-CCR6 eran transfectar transitoria en la HEK 293 células T con lipofectina, RT-PCR fueron seleccionados para la expresión de ARNm CCR6 más eficiente desmontables, un plásmido ShCCR6-1 que muestra casi el 75% disminuyó CCR6 mRNA en el SW480 las células fueron para recoger la siguiente CCR6 estables desmontables CRC construcción de la línea celular.
lentivirus Producción y Transducción
los lentivirus se produjeron y se cosecharon 72 horas después de la transfección de células 293 T con lentivirus y los plásmidos de embalaje pMD2.G y psPAX2 usando Profection mamíferos sistema de transfección (Promega). Después de filtrar a través de una baja en proteínas 0,45-micras de unión-polisulfónico filtro (Millipore), se recogió por separado el sobrenadante y se centrifugó durante 10 min a 2000 × g, 4 ° C antes de filtrar a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45-micras de nuevo. El flujo a través se utilizó directamente para la transducción de células de cáncer colorrectal humano. Para el experimento de caída, seis líneas clonales fueron seleccionadas para la expresión de CCR6 por el Western Blot. líneas de células SW480 y LoVo transfectadas de manera estable que muestran de manera eficiente disminuyeron proteína CCR6 se cribaron y se purificó adicionalmente por la célula activada por fluorescencia para los experimentos posteriores. Para el experimento de la sobreexpresión, se generaron dos líneas celulares HCT116 transducidas: HCT116 que sobreexpresan ZsGreen1 (HCT116
Ctr) y HCT116 sobreexpresión de los genes bicistrónicos CCR6-ZsGreen1 (HCT116
CCR6). El ZsGreen1
+ células HCT116 o ZsGreen1
+ CCR6
+ células HCT116 se purificaron posteriormente por fluorescencia de células activadas por la clasificación y se expandieron en los medios de cultivo. Del mismo modo, las células Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, también se generaron SW1116
Ctr y SW1116
células CCR6. Además, se produjeron tres líneas celulares HCT116 transducidas para
in vivo
experimentos: HCT116 que sobreexpresan de forma estable el gen Luc (Luc-HCT116) con la selección de G418, HCT116 con sobreexpresan el gen Luc y el gen ZsGreen1 (Luc-HCT116
CTR) y HCT116 con sobreexpresión del gen Luc y los genes bicistrónicos CCR6-ZsGreen1 (Luc-HCT116
CCR6). ZsGreen1
+ células HCT116-Luc o ZsGreen1
+ CCR6
+ células HCT116-Luc fueron nuevamente purificada por celular activada por fluorescencia y se expandieron en los medios de cultivo.
Tumor Humano Metástasis PCR array
HCT116
Ctr o células HCT116 CCR6
se lisaron directamente en el reactivo TRIzol, y el ARN total fue extraído de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, se empleó el sistema de síntesis de secuencias de comandos de Super III (Invitrogen) para la síntesis de cDNA. PCR en tiempo real se realizó en cada muestra usando el tumor humano Metástasis RT
2 Profiler PCR Array (Matriz de Super Bioscience, EE.UU.) en un rápido tiempo real, sistema de PCR ABI 7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.). Humano β-actina se utilizó para la normalización por el método ΔΔCt.
Experimental
in vivo
Hígado Metástasis Modelo
Hígado capacidad metastásica se determinó mediante la inyección de 1 x 10
6 células por ratón en el bazo de ratones BALB /c ratones desnudos. Brevemente, BALB /c ratones desnudos se anestesiaron mediante inyección i.p. La inyección de Pelltobarbitalum natricum, y 1 × 10
6 HCT116 células tumorales
Ctr o HCT116
CCR6 en 25 l se inyectaron en el bazo exteriorizado con una jeringa de insulina (empresa BD) después de la incisión abdominal. Cinco minutos después de la inyección de células, los vasos sanguíneos del bazo se ligaron, y se eliminó el bazo. Por último, la herida abdominal se cerró con grapas. Después de 5 semanas, los ratones fueron sacrificados y los hígados se retiraron a continuación y se fotografiaron.
Experimental
in vivo
metástasis de pulmón Modelo
Siete de 7 semanas de edad, macho BALB /c ratones desnudos en cada grupo fueron inyectados con Luc-HCT116
Ctr o células HCT116-Luc CCR6
. Brevemente, 5 × 10
6 células en suspensión en 200 l de PBS se inyectaron en la vena de la cola de cada /c ratón nude BALB. Después de 6 semanas, los animales se sacrificaron y se examinaron macroscópicamente y microscópicamente la presencia de metástasis. Para imágenes de pequeños animales en todo el cuerpo, los ratones se les dio 150 g /g de sustrato de D-luciferina en PBS estéril mediante inyección intraperitoneal y luego anestesiados con isoflurano. imágenes de bioluminiscencia fueron capturadas con un dispositivo de carga acoplada (Sistema Xenogen IVIS 200, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, EE.UU.) en los 15 minutos después de la inyección de sustrato.
Singenéico injerto CRC Modelo y anti-CCR6 Terapia
células CMT93 en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea (sc) en 6 semanas de edad de sexo masculino CCR6
- /- ratones (1 x 10
6 células /ratón), o CT26 células en 100 l PBS se inyectaron sc en ratones BALB /c macho de 7 semanas de edad (1 × 10
6 células /ratón). Diez días después de la inoculación de células tumorales, cuando las células tumorales formados los tejidos de tumores sólidos, injertado CCR6
- /- ratones o ratones BALB /c se dividieron aleatoriamente en dos grupos para el tratamiento con el control de IgG o anti-CCR6. Veinte microgramos de IgG
2A (amp I +; D System, el clon#54447) disueltos en 100 l de PBS o 20 mg CCR6 (amp I +; D System, el clon#140706) disueltos en 100 l de PBS se inyectó por separado en los sitios tumorales cada otro día durante 18 días. Después de 28 días, los ratones se sacrificaron, y se retiraron los xenoinjertos, fotografiaron y se pesaron. Para el análisis de transferencia de Western, policlonal anti-ratón de CCR6 (# ab78429, Abcam) como el anticuerpo primario.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 5.01. Las pruebas estadísticas para el análisis de datos incluyen la prueba de log-rank, la prueba exacta de Fisher, la prueba de Chi-cuadrado, la prueba de Wilcoxon y el test de la U de Mann-Whitney. El análisis estadístico multivariado se realizó mediante un modelo de regresión de Cox. Los datos cuantitativos se presentan como los valores medios ± desviación estándar (DE). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a valores de *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0,001.
resultados
Regulación al alza de CCR6 se correlaciona con la progresión tumoral
Para investigar la relevancia clínica de CCR6 regulada por incremento en el CCR, se recogieron 191 muestras de tejidos primarios CRC incluidos en parafina (Tabla S1), y expresión CCR6 niveles se examinaron en todas estas muestras usando inmunohistoquímica. La correlación de la expresión de CCR6 con las características clínico-patológicas y la supervivencia de pacientes con CRC se resumieron (Tabla S2). Los análisis estadísticos revelaron que la expresión de CCR6 se correlacionó significativamente con el estadio clínico (
p = 0,0117
), clasificación N (
p = 0,0309
), la clasificación M (
p =
0,0334) y el estado vital (
p = 0,0019
) en pacientes con CCR (Tabla S2). Por otra parte, se encontró que la expresión de CCR6 se upregulated notablemente en todas las muestras de CRC clínicos ensayadas pero sólo fue detectable a niveles bajos en tejido paratumor (Figura 1A), y el análisis univariante reveló una fuerte asociación entre la intensidad de la tinción CCR6 y etapas del tumor (n = 14,
p = 0,0039
; n = 104,
p Hotel & lt; 0,0001; n = 57,
p Hotel & lt; 0,0001; n = 16,
p
= 0,0005) (Figura 1B). Estos datos sugieren que la regulación al alza de CCR6 está fuertemente asociada con la progresión clínica de la CRC humano.
(A) tinción inmunohistoquímica de CCR6 en CRC primaria derivada de 191 pacientes con CCR en estadio clínico I-IV. (B) Se llevó a cabo el análisis de imagen digital para contar intensidad de la tinción de la fracción de área CCR6 (CCR6-FA) los valores de las muestras para-tumor /tumor emparejados en cada etapa clínica, prueba de Wilcoxon.
Upregulated CCR6 Indica Mal pronóstico para los pacientes de CRC
Es importante destacar que, hemos demostrado que la expresión de CCR6 se correlacionó inversamente con el tiempo de supervivencia (
p Hotel & lt; 0,001) (Figura 2A). Además, la expresión CCR6 se correlacionó con la supervivencia global para el subgrupo de pacientes en diferentes estadio clínico, de manera significativa en la etapa IV (
p
& lt; 0,05) (Figura 2B-E). Además, los análisis univariados y multivariados revelaron que la clasificación M y la expresión de CCR6 fueron cada reconocidos como factores pronósticos independientes en el CCR (Tabla S3). En conjunto, estos datos sugieren que CCR6 tiene valor clínico potencial como biomarcador predictivo de la evolución de la enfermedad en pacientes con CCR.
curvas (A) de Kaplan-Meier de los pacientes con CCR baja versus alta expresión de CCR6 (n = 191,
p Hotel & lt; 0,001, prueba de log-rank). (B) Las curvas de Kaplan-Meier de los pacientes con CCR baja versus alta expresión de CCR6 en estadio clínico I (n = 14,
p = 0,0679
, prueba de log-rank). curvas (C) de Kaplan-Meier de los pacientes con CCR baja versus alta expresión de CCR6 en fase clínica II (n = 104,
p = 0,0738
, prueba de log-rank). (D) Las curvas de Kaplan-Meier de los pacientes con CCR baja versus alta expresión de CCR6 en estadio clínico III (n = 57,
p = 0,1749
, prueba de log-rank). curvas (E) de Kaplan-Meier de los pacientes con CCR baja versus alta expresión de CCR6 en estadio IV clínico (n = 16,
p = 0,0429
, log-rank test).
Desmontables de CCR6 inhibe la migración de las células CRC
in vitro
la sobreexpresión CCR6 observado tenido una fuerte asociación con la progresión del CRC, lo que nos llevó a investigar el impacto de CCR6 en CRC capacidad de migración celular . Dos líneas celulares de CRC, SW480 y LoVo, que expresa la expresión de CCR6 más alto de líneas de células colorrectales que analizamos, se utilizaron para crear sublíneas con CCR6 de forma estable derribado por shRNA (Figura 3A, B). Sorprendentemente, los resultados mostraron que la caída de CCR6 provocó una supresión significativa de la migración celular en líneas celulares tanto SW480 y LoVo en un ensayo de cicatrización de heridas (
p
& lt; 0,05, Figura 3C). También utilizamos otro ensayo transwell clásica para evaluar la contribución de CCR6 en la migración celular. Hemos demostrado que la ablación de CCR6 reduce notablemente la migración de ambas líneas celulares SW480 y LoVo (
p
& lt; 0,01, Figura 3D). Tomados en conjunto, nuestros datos indican que la caída específica de CCR6 en líneas celulares de CRC podría reducir significativamente la migración de células
in vitro.
(A) Análisis de transferencia Western de los niveles de CCR6 en 7 células cultivadas CRC líneas. Los valores se expresaron como cambios veces en relación con Caco-2, y se normalizaron a beta-actina. (B) análisis de transferencia de Western de desmontables de CCR6 en las células SW480 y LoVo, β-actina sirvió como control de carga. Los valores se expresaron como cambios veces en relación con los controles (ShCtr), y normalizado a ß-actina. (C) la curación de heridas ensayos para la motilidad de las células SW480 y LoVo CCR6 silenciada y control de las células. se muestran imágenes representativas de un campo al comienzo (t = 0 h) (panel superior) y al final de la grabación (t = 24 h) (panel inferior) en cada condición. La migración celular relativa en grupos ShCtr y shCCR6 se muestran en el panel derecho. (D) Imágenes representativas de transwell células migradas en las células SW480 y LoVo CCR6 silenciada (panel inferior) o células de control de las células (panel superior). El número de células migradas en grupos ShCtr y shCCR6 se muestran en el panel derecho. Los valores representan la media de pocillos por triplicado, ± S. D. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, prueba de Wilcoxon. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
CCR6 promueve la agresividad de las células CRC
in vitro
Para investigar si la sobreexpresión ectópica de CCR6 podría mejorar la agresividad de las células de CRC, HCT116, Caco-2 y células SW1116 líneas que expresan de forma estable CCR6 ectópico se establecieron (Figura 4A). Sorprendentemente, ambos ensayos de cámara de curación de la herida y la migración revelaron que CCR6 sobreexpresión pronunciadamente mejorado la migración celular en comparación con grupos de control (
p
& lt; 0,05 o
p
& lt; 0,01) (Figura 4B, C) . Además, durante el proceso de establecimiento de líneas celulares estables CCR6, nos dimos cuenta de que había algo más la formación de colonias en las células transfectadas CCR6 que las células de control transfectadas. Para ello hemos realizado ensayos de formación de colonias mediante el HCT116 transfectadas establemente
CCR6, HCT116
Ctr, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr y SW1116
células CCR6 . Una vez más, hemos observado que en comparación con las células control (CTR), el tamaño y el número de colonias formadas en CCR6 que sobreexpresan HCT116, Caco-2 y células SW1116 se incrementaron significativamente (
p Hotel & lt; 0,05) (Figura 4D) . Tomados en conjunto, nuestros datos proporcionan evidencia de que la elevada expresión de CCR6 juega un papel crítico en el fenotipo agresivo de células CRC
in vitro
.
(A) análisis de transferencia Western de la expresión ectópica de CCR6 en HCT116
Ctr y CCR6 células HCT116
o Caco-2
Ctr y Caco-2
CCR6 o SW1116
Ctr y CCR6 células SW1116
. β-actina sirvió como control de carga. Los valores se expresan como cambios veces respecto a los controles (CTR) y normalizado a ß-actina. (B)
Ctr y HCT116
CCR6 o Caco-2
Ctr y Caco-2
CCR6 o SW1116
Ctr y SW1116
células CCR6 de curación de heridas de ensayo para la motilidad de HCT116 . se muestran imágenes representativas de un campo al comienzo (t = 0) (panel superior) y al final de la grabación (t = 24 h) (panel inferior) en cada condición. La migración celular relativa en grupos CCR6 y de control se muestran en el panel derecho. (C) Imágenes representativas de transwell células migraron en HCT116 transfectadas establemente
Ctr, Caco-2
Ctr, SW1116
Ctr (panel superior) o HCT116
CCR6, Caco-2
CCR6, SW1116
CCR6 células (panel inferior). Promedio del número de células que migraron de HCT116
células CCR6 o SW1116
Ctr y SW1116
CCR6 CCR6 o Caco-2
Ctr y Caco-2 Ctr y HCT116 se muestran en la panel de la derecha. (D) la imagen Representante de la formación de colonias en HCT116
Ctr, Caco-2
Ctr, SW1116
Ctr (panel superior) o HCT116
CCR6, Caco-2
CCR6, SW1116
células CCR6 (panel inferior). Los valores representan la media de pocillos por triplicado, ± S. D. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, prueba de Wilcoxon. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
La sobreexpresión de CCR6 Facilita la metástasis de las células CRC
in vivo
El hígado es el sitio más común de cáncer colorrectal metástasis del cáncer. Para determinar si CCR6 juega un papel especialmente importante en la metástasis hepáticas de CCR, establecimos un
in vivo
hígado modelo de metástasis experimental mediante la inyección de células tumorales humanas en el bazo de los ratones desnudos BALB /c y seguimos su capacidad para invadir a través de la vena porta en el hígado para formar metástasis. Para definir la relación entre CCR6 y el CRC metástasis hepáticas
in vivo
, seis de 7 semanas de edad, macho BALB /c desnudos ratones de cada grupo fueron inyectados con HCT116
Ctr o HCT116
CCR6 en las células el bazo antes de la esplenectomía. Después de 5 semanas, los ratones fueron sacrificados y se examinaron los nódulos tumorales metastásicas que se formaron en el hígado. Sorprendentemente, los nódulos tumorales metastásicas fueron encontrados con mayor frecuencia en los hígados del grupo CCR6 HCT116
que el HCT116
grupo Ctr (Figura 5A, indicado por las flechas blancas). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión CCR6 en las células cancerosas puede mejorar las metástasis hepáticas de CRC. Además, se utilizó el animal pequeño sistema de imágenes de fluorescencia de todo el cuerpo (IVIS) para controlar la migración de las células tumorales
in vivo
. En primer lugar, se construyó la línea celular estable que expresa la luciferasa, la luciferasa-HCT116 mediante la transfección de células HCT116 con el lentivirus luciferasa, y se seleccionaron estas células con G418.