Extracto
Antecedentes
Cabeza y carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) es un cáncer letal humana con la heterogeneidad clínica, patológica, fenotípica y biológica. Caner células que inician (AIC), que son responsables para el crecimiento tumoral y, junto con la ganancia de epitelio-mesenquimal transición (EMT), se han identificado. Anteriormente, hemos enriquecido una subpoblación de células de cabeza y cuello iniciar (HN-AIC) con regulación de CD133 y la mejora de la EMT. Otros demuestran que Src quinasa interactúa con y fosforila el dominio citoplásmico de CD133. Sin embargo, la función fisiológica de CD133 /Src señalización en HNSCCs no ha sido descubierto.
Metodología /Principal Encontrar
En este documento, se determinó el papel crítico de eje CD133 /Src modulación de troncalidad, EMT y tumorigenicidad de CECC y HN-CIC. Inicialmente, la baja regulación de CD133 redujo significativamente la capacidad de auto-renovación y la expresión de los genes stemness, y promovió la diferenciación y la capacidad apoptótica de HN-CIC. Además, desmontables de CD133 en HN-CIC también disminuyó tanto
in vitro
propiedades malignas en incluyendo la migración de células de invasión /célula /crecimiento independiente de anclaje, y
in vivo
el crecimiento tumoral en ratones mediante el ensayo de los xenotrasplantes desnuda. En contrario, la sobreexpresión de CD133 mejora las propiedades stemness y capacidad tumorigénico de HNSCCs. Por último, sobre regulación de CD133 aumento de la fosforilación de Src junto con la transformación de la EMT en HNSCCs, por el contrario, el silencio de CD133 o el tratamiento de Src inhibidor inversamente abrogada por encima de efectos fenotípicos, que fueron inducidos por CD133 sobre regulación en HNSCCs o HN-CIC .
Conclusión /Importancia
Nuestros resultados sugieren que la señalización de CD133 /Src es un interruptor regulador de ganancia de EMT y de las propiedades stemness en CECC. Por último, el eje CD133 /Src podrían ser una posible diana terapéutica para el CECC eliminando HN-CIC
Visto:. Chen Y-S, Wu M-J, Huang C-Y, Lin S-C, Chuang T-H, Yu C-C, et al. (2011) CD133 /Src Eje media la iniciadora del tumor y la propiedad de transición epitelio-mesenquimal de cabeza y cuello. PLoS ONE 6 (11): e28053. doi: 10.1371 /journal.pone.0028053
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Junio, 2011; Aceptado: 31 Octubre 2011; Publicado: 28 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio es apoyado por becas de investigación de Consejo Nacional de Ciencia (NSC95N444, NSC97N456, NSC99N024 y NSC100-2314-B-040-001), el hospital general de Veteranos de Taipei (V97ER2018 y V98ER2018) y la Universidad Nacional Yang-Ming (Ministerio de Educación, el objetivo de la Top plan Universitario: 97ACD113, 97ACT302 y 98ACT302). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es uno de los cánceres más comunes en el mundo y una de las causas de muerte relacionada con el cáncer debido a la resistencia a la terapia [1]. A pesar de las mejoras en el diagnóstico y tratamiento de la CECC, las tasas de supervivencia global a largo plazo han mejorado ligeramente en la última década [2].
La acumulación de datos demuestran que la formación de tumores es impulsado por una subpoblación de células que exhiben -la capacidad de auto-renovación de células madre del cáncer supuestos (CSC) o células cancerosas iniciar (AIC) [3], [4]. CICs han demostrado tener la capacidad de promover la progresión tumoral y la metástasis, y también contribuyen a la radio-resistencia y quimio-resistencia [5]. Recientemente, nosotros y otros han comprobado la existencia de los CIC en CECC (HN-CIC) [6], [7], [8], [9]. Sin embargo, hay una falta de evidencia de cómo la señalización de la superficie celular modular las propiedades stemness intracelulares o tumorigenicidad de HN-CIC.
CD133 (prominin-1), una glicoproteína transmembrana-5, fue reconocido como células madre hematopoyéticas marcador [10]. En consecuencia, CD133 se ha considerado como un importante marcador de superficie celular para representar la subpoblación de CICs en los tumores cerebrales, carcinoma de colon, carcinoma de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de tiroides y cáncer de cabeza y cuello [8], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Anteriormente, hemos demostrado que la regulación de CD133 en HN-CIC, aún más, la sobre regulación de C133 en el tejido canceroso CECC se correlaciona negativamente con el pronóstico de supervivencia de los pacientes HNSCC [8]. Informes recientes también sugieren que la expresión de CD133 en los tejidos tumorales podría servir como un indicador de pronóstico para la re-crecimiento del tumor, la progresión maligna, y la supervivencia de los pacientes [19], [20], [21]. Sin embargo, el CD133 mediada mecanismos moleculares en la regulación de CICs en HNSCC todavía no está claro.
EMT, una transformación celular que convierte las células epiteliales adherentes en células mesenquimales migratorios, es crítica para el desarrollo embrionario y la progresión tumorigénico de las células cancerosas y el cáncer metástasis [22]. Los investigadores han demostrado que la EMT podría promover células madre (SCS) y propiedades más generar células con las características del tumor iniciar la propiedad [23], [24]. programa de EMT también mantuvo significativamente tumor células iniciadoras característica en HNSCC [6], [7], [25].
Src, un no-tirosina quinasa del receptor clásico con el potencial de causar la transformación celular incluyendo proliferación incontrolada y la pérdida de inhibición de contacto, se convierte en activado mediante la interacción con los receptores de membrana estimulados [26]. La señal extracelular se amplifica aún más y transduce a través de la interacción entre Src activado y abajo objetivos tales como Ras /MAPK, PI3K /Akt y STAT3 vías [26]. La activación de Src interrumpe la unión célula-célula, promueve la invasión a través de la fosforilación de β-catenina causando así la degradación de la E-cadherina, y posteriormente activa el EMT [27]. Además, Boivin et al demuestran que CD133 es un compañero de unión novela de Src y se phosporylated por Src quinasa [28].
Los mecanismos moleculares detallados que participan en los enlaces de regulación entre EMT y tallo genes relacionados con células tales como CD133 y Src son aún poco conocidos. En este documento, se demuestra un papel crítico de CD133 en la mejora de la troncalidad, aumento de la EMT, y promover la tumorigenicidad de HN-CIC. Además, la baja regulación de CD133 CD133 o la inhibición de la activación de Src inducida disminuye propiedades stemness y tumorigenicidad de HNSCCs tanto
in vitro
y
in vivo.
En última instancia, se demuestra la importancia de CD133 /Src señalización en proceso de EMT en CECC.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares de cultivo y enriquecimiento de HN-CIC de HNSCCs
Dos líneas celulares HNSCC, SAS [29] y OECM1 [30], se cultivaron en DMEM o en RPMI suplementado con 10% FBS (Grand Island, NY), respectivamente. Una línea celular HNSCC primaria se obtuvo de los pacientes CECC. Todas las muestras clínicas de este estudio fueron aprobados y de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de Shan Hospital de Medicina de la Universidad Chung (CSMUH No: CSI0249). Para el enriquecimiento de HN-CICs, las dos líneas celulares se cultivaron en medio esfera tumor que consiste en medio libre de suero DMEM /F12 (GIBCO), suplemento de N2 (GIBCO), 10 ng /ml de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano del factor básico (FGF ) y 10 ng /ml Factor de Crecimiento epidérmico (EGF) (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). Las células se sembraron a una densidad de 7,5 × 10
4 a 1 × 10
platos 5 células vivas /10 mm, y el medio se cambió cada dos días hasta que se observó la formación de esferas del tumor en aproximadamente 4 semanas [ ,,,0],8].
estable sobreexpresión de CD133 en las células HNSCC
gen CD133 humano se amplificó a partir de pulmón fetal humano y la plantilla de ADNc de bazo obtenidas de Biosettia Inc. (Cat. No. ADNc de HSA-09 ; San Diego, CA, EE.UU.) y después se clonó en pCDH1-MCS1-EF1-copGFP (Sistema Biosciences, Cat. No: CD511A-1; Mountain View, CA, EE.UU.). Las secuencias de oligos usados para la amplificación PCR CD133 son 5'-ACCGTCTAGAATGGCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTTGCTG-3 'y 5'-ATCAAAGCTTATTGAAGCTGTTCTGCAGGTGAAGAG- TGCC-3'. producción Lentivirus se realizó por co-transfección de mezcla de ADN de plásmido con LentiVector más helper plásmidos (VSVG y Gag-Pol) en células 293T (American Type Culture Collection, Manassas, VA) usando Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen, Calsbad, CA, EE.UU. ). El título de lentivirus m.o.i se determina por citometría de flujo (media de 5 × 10
4 y 2 × 10
5 TU /ml). Para generar las líneas celulares estables, las células HNSCC sub-confluentes fueron infectadas con lentivirus en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). La proteína de fluorescencia verde (GFP), que se co-expresa en las células lentivirales infectados, se servía como marcador de selección para indicar los HNSCCs infectadas con éxito. líneas de células CD133 HNSCC sobreexpresan estables se purificaron adicionalmente mediante clasificación de células con células positivas GFP (figuras 1A y 1B). El vector vacío pCDH1-MCS1-EF1-copGFP solo se utiliza para el control experimental.
(A) la suspensión de células individuales de HN-CIC fue transducida con sh-Luc o lentivirus SH-CD133 durante 3 días. Las proteínas totales preparados a partir de células infectadas se prepararon y analizaron. El efecto de silenciamiento de CD133 en shRNA HN-CIC fue validado en traslación por el Western Blot (OECM1 (
panel izquierdo
) y SAS (
panel de la derecha
)). La inmunotransferencia contra anticuerpos anti-GAPDH anti-Oct-4, anti-Nanog, o se realizó como se indica. La cantidad de proteína GAPDH de diferentes extractos de células en bruto se hace referencia como control de carga, y para la cuantificación adicional. (B) de la superficie celular CD133 de sh-CD133-1, sh-sh-CD133-2 y Luc HN-CIC se analizó mediante citometría de flujo (C) HN-CIC se infectaron por primera vez con sh-CD133-1, sh-CD133- 2 o SH-Luc lentivirus durante 3 días, y después se cultivan adicionalmente bajo el medio de selección definido libre de suero. Se examinó la morfología celular de la HN-CIC tratados con sh-Luc o CD133-shRNA lentivirus. Las flechas indican las células esfera. Se evaluó el perfil de expresión de CK18 (D) o Anexina V vs. tinción positiva PI (E) de las células HN-CICs infectadas con sh-CD133-1, sh-CD133-2 o sh-Luc lentivirus, respectivamente, por citometría de flujo . El porcentaje de Anexina V
+ /PI
+ células dobles positivas fue grabado (E; panel de la derecha). La IgG de control se utiliza para definir la señal de línea de base en (B) y (D). Los experimentos se repitieron tres veces y se muestran los resultados representativos. Los resultados son la media ± SD (*, p & lt; 0,05; ***, p & lt; 0,001) guía empresas
Construcción de RNAi mediada por Lentiviral para silenciar CD133
El vector PLV-RNAi. , que co-expresión de la proteína GFP en células huésped infectadas, se adquirió de Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA, EE.UU.). El método de clonación de la secuencia de doble cadena shRNA se describe en el protocolo del fabricante. Los vectores lentivirales que expresan shRNA que se dirige a CD133 humano (secuencia de oligonucleótidos: Sh-CD133-1: 5'-AAAAGGACAAGGCGTTCACAGATTTGGATCCAAATCTGTGAACGCCTTGTCC-3 '; Sh-CD133-2: 5'-AAAAGGATACACCCTACTTACTATTGGATCCAATA GTAAGTAGGGTGTATCC-3') se sintetizaron y se clonaron en pLVRNAi para generar una vector de expresión lentiviral. Sh-Luc: 5'-CCGGACTTACGCTGAGTACTTCGAA CTCGAGTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTTTTTG-3 'se utilizó para el control experimental. producción Lentivirus se realizó como arriba. Estable PLV-RNAi líneas celulares expresaron HNSCC se purificaron adicionalmente mediante clasificación de células con células positivas para GFP (Figura s1c).
Side población de análisis
Para el análisis de la población lado, solo las células HNSCC suspensión a 1 × 10
6 /ml fue preparado en un medio de pre-calentado DMEM con suero de 2% de bovino fetal (FBS). A continuación se añadió colorante Hoechst 33342 a una concentración final de 5 g /ml en presencia o ausencia de Fumitremorgina C (FTC) (10 mM; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y se incubó a 37 ° C durante 90 min con agitación intermitente. Las células se lavaron con HBSS enfriado con hielo con FBS al 2% y se centrifuga a 4 ° C, y se resuspendieron en el mismo tampón. Se añadió yoduro de propidio a una concentración final de 2 mg /ml para conmutar células viables. El colorante Hoechst 33342 se excitó a 357 nm y su fluorescencia era de doble longitud de onda analizada (azul, 402-446 nm; rojo, 650-670 nm). Los análisis se realizaron en un FACS Vantage (BD, San Diego, CA, EE.UU.) [6].
apoptóticas se detectaron Ensayo
Las células apoptóticas con un kit de Anexina V-APC (Calbiochem, Darmstadt , Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, las células se incubaron con 20 mg /ml de yoduro de propidum (PI) se analizaron mediante FACS Calibur aparato (Becton Dickinson, San Diego, CA, EE.UU.) [6].
vitro la migración celular y la invasión de ensayo En
Para los ensayos de migración transwell, 2 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior de un transwell (Corning, Acton, MA) con una membrana porosa (tamaño de 8,0 micras de poro). Las células se colocaron en placas en medio con suero inferior (0.5% de FBS), y el medio suplementado con suero más alta (10% FBS) se utilizó como un quimioatrayente en la cámara inferior. Las células se incubaron durante 24 h a 37 ° C y las células que no migran a través de los poros se eliminaron por un hisopo de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich) para mostrar los núcleos; se detectó fluorescencia con un aumento de 100x con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se contó el número de células fluorescentes en un total de cinco campos seleccionados al azar. En el análisis de la invasión de células in vitro se ha descrito previamente [8].
de colonias en agar suave de ensayo de formación de
Cada pocillo (35 mm) de una placa de cultivo de seis pocillos se revistió con 2 ml de agar inferior ( -Aldrich Sigma) mezcla (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Después la capa inferior se solidificó, 2 ml de mezcla de agar-medio superior (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) que contiene 2 × 10
se añadió 4 células, y los platos se incubaron a 37 ° C durante 4 semanas. Las placas se tiñeron con 0,005% violeta cristal a continuación, se contaron las colonias. El número de colonias totales con un m de diámetro ≥100 fue contado más de cinco campos por pocillo para un total de 15 campos en los experimentos por triplicado.
xenoinjertos subcutáneos en ratones desnudos
Todos los animales en prácticas este estudio fueron aprobados y de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Nacional Yang-Ming, Taipei, Taiwán (aprobación del IACUC Nº 961230). Estable sh-sh-Luc y CD133 HN-CIC o el control GFP y HNSCCs CD133-overexpresiing mezcladas con Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, EE.UU.) (1: 1) se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB /c ratones desnudos (6- 8 semanas). El volumen tumoral (TV) se calculó utilizando la siguiente fórmula: TV (mm
3) = (longitud x anchura
2) /2
El análisis estadístico
Paquete Estadístico del. software de Ciencias sociales (versión 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico. Estudiante de
t
prueba se utilizó para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales;
p
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. El nivel de significación estadística se fijó en 0,05 para todas las pruebas.
Resultados
El descenso de regulación de CD133 reduce propiedades stemness unidas al aumento de las capacidades de diferenciación y apoptosis en HN-CIC
Hemos identificado una subpoblación de células de cabeza y cuello iniciar (HN-AIC) con propiedades mejoradas a partir de células stemness CECC (HNSCCs) mediante un ensayo de formación de esferas [8]. Asimismo, nosotros y otros muestran sobre regulación de CD133 en HN-CIC [8], [31], [32]. Para investigar más si CD133 juega un papel en el mantenimiento de CICs propiedades de HN-CICs, el enfoque de la pérdida de la función de CD133 se llevó a cabo primero. Baja regulación de CD133 en HN-CIC se logró mediante transducción viral con vector lentiviral que expresa pequeña horquilla RNA (shRNA) dirigidos a CD133 (sh-sh-CD133-1 y CD133-2), y el vector lentiviral que expresa ARNhc contra luciferasa (SH- Luc) se utilizó como control. Los análisis de inmunotransferencia confirmó que lentivirus que expresan tanto sh-CD133-1 y sh-CD133-2 reduce notablemente el nivel de expresión de la proteína CD133 en transducidas HN-CICs (Figura 1A). población celular con la superficie de CD133-positivo (CD133
+) también se redujo en sh-CD133 infectado HN-CICs por FACS análisis (Figura 1B). Por otra parte, la HN-CIC infectadas con SH-CD133 lentivirus no mantuvo esferas flotantes, pero mostraron más unidos células de tipo epitelial (Figura 1C). También se observó reducción de la expresión de genes stemness (OCT-4 y Nanog) (Figura 1A), pero la mayor expresión de marcador de diferenciación epitelial, CK18 (Figura 1D) en CD133 knockdown HN-AIC. A fin de determinar si la reducción en la eficiencia de formación de esferas tumor con CD133 regulación a la baja se debió a la disminución de la supervivencia HN-CIC, se examinaron las células apoptóticas utilizando anexina V más tinción de yoduro de propidio (PI). HN-CIC infectadas con SH-CD133 lentivirus expresar aumentó significativamente el porcentaje de Anexina V
+ /PI
+ células (Figura 1E). En conjunto, estos datos apoyan, además, que la baja regulación de CD133 dio lugar a una reducción de las propiedades CICs y la viabilidad celular en HN-CIC.
Orientación de CD133 abroga in vitro e in vivo propiedades malignas de HN-CIC
Para dilucidar el efecto directo de CD133 caída en
in vitro
propiedades malignas incluyendo habilidades de la migración celular, invasión de matrigel y el crecimiento de anclaje independiente de HN-CIC, suspensión de células individuales o de control de CD133
-
knockdown HN-CICs se sembraron en la cámara Transwell (Figura 2A), la cámara Transwell recubierta con matrigel (Figura 2B) o en agar blando (Figura 2C), y se analizaron. Las capacidades de formación migratoria /invasión /colonia de CD133 knockdown HN-CICs se redujeron significativamente (figuras 2A, 2B y 2C). A continuación trató de determinar si la baja regulación de la expresión de CD133 podría atenuar la capacidad tumorigénico de HN-CIC
in vivo
. Es de destacar que la inhibición de la expresión de CD133 redujo significativamente el crecimiento tumoral mediada por HN-CICs (Figuras 2D y 2E; p & lt; 0,05; p & lt; 0,01). Además, la tinción inmunohistoquímico de los tumores derivados de SH-CD133 HN-CICs muestra disminución de Oct4 y aumento de CK18 en comparación con los de control de tumores HN-AIC (Figura S2A y S2B). En general, nuestros datos indican que el agotamiento de CD133 inhibe la iniciación de la actividad tumoral de HN-CIC
in vivo
.
Para dilucidar la capacidad de la migración celular (A), invasión de células (B) y el anclaje crecimiento independiente (C) de HN-CIC (OECM1 (
superior del panel
), SAS (
panel inferior
)) con CD133 baja regulación, suspensión de células individuales de la HN-CIC infectado con CD133 específico de shRNA o control sh-Luc lentivirus durante tres días se sembraron en transwell, transwell revestido con matrigel y agar blando, respectivamente, y se analizó como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados son la media ± SD de muestras por triplicado a partir de tres experimentos. (D) se generaron tumores representativos de control de HN-CICs y de CD133-knockdown derivado de SAS HN-CICs, y los tumores se disecaron del espacio subcutáneo de ratones receptores (n = 3) (contraste de fase:
dejaron dos paneles
; GFP de imagen
: derecha dos paneles
) (flechas rojas: SH-HN-Luc CIC; flechas amarillas: SH-HN-CD133-1 AIC). se midió (E) El volumen del tumor, respectivamente, después de la inoculación de CD133-knockdown o-expresan sh Luc derivado SAS-HN-AIC. Las barras de error corresponden a SD. (*, P & lt; 0,05; ***, p & lt; 0,001) guía empresas
La sobreexpresión de CD133 mejora las propiedades oncogénicas stemness y potencialidades de HNSCCs
Para investigar más a fondo el efecto de CD133 arriba la regulación de las propiedades biológicas de HNSCCs, que genera HNSCCs CD133 sobreexpresan estables mediante transducción lentiviral mediada. La tasa de éxito de la infección de HNSCCs CD133 sobreexpresan control GFP y, después, el clasificación de células, varió desde 93 hasta 94% (OECM1) y 97 a 91% (SAS), respectivamente (Figuras S1A y S1B). Los dos HNSCCs CD133-sobreexpresan (OECM1 y SAS) muestran elevada expresión de CD133 mediante análisis Western blot (Figura 3A). Además, se encontró que en comparación con las células de control GFP expresar los HNSCCs CD133-overexpressing mostraron significativo aumento de CD133
+ células por FACS análisis (Figura 3B). Además, los HNSCCs CD133-overexpressing tumor mostraron una mayor capacidad de formación de esferas (Figura 3C) y significativo aumento de la población lateral (SP) células (Figura 3D). También se observó que el aumento de nivel de proteína de Octubre-4 y Nanog de HNSCCs CD133 con sobreexpresión de cultivo con medio definido libre de suero (Figura 3E). A continuación, hemos demostrado que la sobreexpresión de CD133 también produjo un aumento de capacidad de invasión de células y la formación de colonias de HNSCCs (Figuras 4A y 4B). Es de destacar que HNSCCs CD133-sobreexpresan también mostraron tumorigenicidad significativamente elevada en comparación con el control HNSCCs por análisis de los xenotrasplantes
in vivo gratis (Figuras 4C; p & lt; 0,05; p & lt; 0,01). Además, IHC análisis demostraron que los tumores derivados de CD133 que sobreexpresan las células SAS muestran más Oct4 pero menos tinción CK18 (Figura S2C). En conjunto, estos resultados sugieren que la sobreexpresión de CD133 promueve propiedades stemness y tumorigenicidad de HNSCCs.
(A) Expresión de la proteína CD133 en HNSCCs infectadas o bien con CD133-overexpressing o controlar lentiviruse GFP fue examinado por Western blot. La cantidad de proteína GAPDH fue referido como control de carga. (B) la expresión de CD133 en la superficie celular CD133 HNSCCs sobreexpresan o de control se analizó mediante citometría de flujo. (C) Imágenes representativas de la capacidad de formación de esferas tumoral de CD133 HNSCCs con sobreexpresión de control-GFP o. (D) Las suspensiones de células individuales de HNSCCs que expresan GFP-CD133-overexpressing y control estable se incubaron con Hoechst 33342 en presencia o ausencia de 10 mM Fumitremorgina C (FTC), a continuación, se analizaron por citometría de flujo para identificar las células SP. (E) Total de proteínas de células crudo extraído de control GFP o CD133 sobreexpresan HNSCCs bajo cultivo con medio libre de suero definido para se prepararon y se inmunotransfirieron contra anti-Oct-4 2 semanas, anti-Nanog, anti-CK18 o anti-GAPDH anticuerpos como se indica. La cantidad de proteína GAPDH de diferentes extractos celulares en bruto se hace referencia como control de carga para su posterior cuantificación.
Src quinasa es el modulador aguas abajo de CD133 en la regulación de la EMT en CECC y HN-CIC
células epiteliales CECC pueden adquirir rasgos mesenquimales que facilitan la migración y la invasión a través de proceso de EMT [7], [33]. En las figuras 4A, demostramos que CD133 promueve la capacidad invasora de HNSCCs, entonces queríamos explorar si CD133 podría modular la vía de la EMT. observación morfológica indicó que la sobreexpresión de CD133 en las células de tipo epitelial OECM1 reveladas mesenquimales-como cambio de forma (Figura 5A). Inmunofluorescencia y tinción de inmunotransferencia muestran que un patrón de expresión de la proteína de tipo epitelial (E-cadherina) se redujo pero un patrón de expresión de proteínas mesenquimales-como (vimentina y fibronectina) se mejoró en CD133-overexpressing HNSCCs (Figura 5B). Por otro lado, el silenciamiento de CD133 reduce marcador mesenquimal (vimentina), pero inducidas marcadores epiteliales (E-cadherina) en HN-CIC (Figura 5C)
.
(A) La capacidad de invasión del control-GFP o CD133 HNSCCs-overexpressing se examinaron como se describe en materiales y métodos (*, p & lt; 0,05; ***, p & lt; 0,001). se analizó (B) el crecimiento independiente del anclaje de HNSCCs CD133 sobreexpresan de control-GFP o (**, p & lt; 0,01; ***, p & lt; 0,001). (C) el crecimiento Representante del tumor de HNSCCs CD133 con sobreexpresión de control-GFP o (1X10
5 células) en el espacio subcutáneo de ratones receptores (flechas rojas: Control-GFP HNSCCs; flechas amarillas: HNSCCs CD133 sobreexpresan) (
panel de la izquierda
). El volumen del tumor se midió después de la inoculación de control GFP (n = 3) o HNSCCs CD133-overexpressing (n = 3), respectivamente (
panel derecho
). Las barras de error corresponden a SD (*, p & lt; 0,05; **, p & lt; 0,01).
(A) de diferencia morfológica entre el control-GFP y HNSCCs CD133 sobreexpresan. (B) Análisis de inmunotransferencia (
panel de la derecha
) y la tinción de inmunofluorescencia confocal (
panel izquierdo
) de los marcadores relacionados con la EMT en HNSCCs CD133 con sobreexpresión de control-GFP o fueron analizados. (C) Los niveles de proteína de vimentina y E-cadherina en la indicada HN-CIC se analizaron por Western blot. (D) el nivel de proteína de Src o p-Src en HNSCCs CD133 con sobreexpresión de control-GFP o fueron analizados por inmunotransferencia. (E) la suspensión de células individuales de HN-CIC estaba infectado con sh-Luc-expresión o lentirus shRNAi CD133, respectivamente, y la expresión de Src o p-Src en por encima de HN-CIC se analizó por Western blot. (F) HNSCCs CD133 sobreexpresan fueron tratados primero con 10 PP2 mu M (inhibidor de Src) o 10 M U0126 (inhibidor de Erk) durante 24 horas. La expresión de Src, p-Src, Erk1 /2, p-Erk1 /2, vimentina, E-cadherina, o CK-18 de las células anteriormente tratados se evaluó mediante análisis de transferencia western con GAPDH ser un control de carga interno. (G) HNSCCs CD133 sobreexpresan fueron primero cultivadas con medio definido libre de suero durante 2 semanas a lo largo con la adición de PP2, y la expresión de proteínas GAPDH Oct-4, Nanog, o en el control (DMSO) o células tratadas con PP2 se analizó por inmunotransferencia.
vía de señalización de Src es un importante mediador de la EMT en CECC (Figura S3 a) [34]. Fujimoto et al han demostrado que la tirosina-513 dentro de CD19 no es solamente Lyn (una quinasa de la familia Src) sitio de unión, sino también lateral fosforilación, aún más, la interacción entre CD19 y Lyn amplificaría la actividad quinasa de la familia Src y cascada aguas abajo [35]. Boivin et al han demostrado que CD133 es una unión novela socio de Src y se phosporylated por Src quinasa [28]. Sin embargo, ¿cómo la interacción entre CD133 y la quinasa Src activar los efectos aguas abajo, incluyendo la amplificación de la actividad Src siguen sin estar claros? Aquí, hemos demostrado que p-Src (Src activado con la fosforilación) se incrementó en CD133-overexpressing HNSCCs (Figura 5D). Por el contrario, CD133 silenciamiento reduce Src activa en HN-CICs (Figura 5E). Consistentemente, el tratamiento de inhibidor de Src (PP2), pero no Erk1 /2 inhibidor (U0126) invertidos de manera significativa el patrón de expresión de proteínas mesenquimales-como en un uno de tipo epitelial, y el aumento de la expresión de citoqueratina 18 (CK18), un marcador de diferenciación, en CD133 células que sobreexpresan OECM1 (Figura 5F). La sobreexpresión de CD133 promueve la fosforilación de ERK1 /2 en células de glioblastoma humano [36], pero en nuestros HNSCCs CD133 sobreexpresan, el tratamiento de ERK1 2 inhibidor /(U0126) causó sólo una ligera influencia en la EMT con sobreexpresión de CD133 inducida (Figura 5F y datos no mostrada). Por último, el tratamiento redujo los marcadores PP2 stemness (Oct4 y Nanog) y también deterioro de la capacidad de formación de esferas HNSCCs bajo cultivo CD133 sobreexpresan con medio definido libre de suero (Figura 5G y los datos no presentados).
CD133 regulación a la baja y Src la inhibición abroga la capacidad de la actividad y la formación de esferas p-Src en primaria HN-CIC
a fin de verificar la función fisiológica del eje CD133 /Src señalización mediada en primaria HN-CIC, las HN-CIC derivadas de pacientes CECC primaria se generaron células. Además, la expresión de CD133 en HN-CIC se downregulated por lentiviral-sh-RNAi. Consistentemente, la actividad de p-Src también se downregulated (Figura 6A). Además, la capacidad de formación de esferas de SH-CD133 principal HN-CICs se disminuyó en comparación con el de control (sh-Luc) principal HN-CICs (Figura 6B). Por último, PP2 (inhibidor de la actividad Src) para el tratamiento primario HN-CIC también abolió la capacidad de formación de esferas (Figura 6C).
(A) Nivel de proteína de CD133 y p-Src de lentivius CD133 mediada desmontables HN primaria -CICs se analizó mediante transferencia de western. (B) Primaria HN-CIC se infectaron por primera vez con sh-Luc o lentivirus CD133-shRNA. Tres días después de la infección lentiviral, se registraron la capacidad de formación de esferas de células infectadas por virus y luego cultivadas en un medio de selección. (C) recién enriquecido principal HN-CICs fueron tratados con PP2 (10 M) durante 72 horas y la capacidad de formación de esferas de PP2 tratadas se examinaron las células HN-AIC. Las flechas indican las células esfera.
En resumen, nuestros resultados sugieren que la señalización de CD133 /Src juega un interruptor principal en la regulación de las propiedades CICs, transformación de la EMT y tumorigenicidad de HNSCCs (Figura 7).
Sobre regulación de CD133, en consecuencia, activa la Src señalización (p-Src), a continuación, promueve el aumento de la EMT, mejora de las propiedades stemness y tumorigenicidad en CECC.
Discusión
tumor está compuesto de una población heterogénea de células, y se ha observado que una subpoblación de células, denominada células madre del cáncer (CSC) o cáncer de iniciar células (AIC), dentro de los tejidos tumorales poseen propiedades stemness [37]. CSC o CICs se consideran responsables de la iniciación, propagación y metástasis de tumores [38], [39], [40]. Es importante destacar que la existencia de CICs podría explicar la reincidencia del cáncer debido a radioresistance o quimiorresistencia tras el tratamiento clínico en pacientes con cáncer [5].
CD133, un marcador de superficie celular de las células madre hematopoyéticas y progenitores endoteliales, se ha propuesto para ser involucrados en la angiogénesis, así como cáncer de tumorigenicidad [41]. CD133 se ha identificado recientemente como un marcador de CICs común para muchos tipos de tumores, incluyendo HNSCC [8], [31]. Bao et al. se encontró que la subpoblación de CD133
+ células aisladas de los tumores cerebrales muestran propiedades CICs, son refractarios a la quimioterapia o la radioterapia, y promover la angiogénesis para facilitar el crecimiento del tumor cerebral [42]. Mientras tanto, CD133
+ CICs en tumores sólidos caracteriza resistencia confieren a la quimioterapia [43]. Por el contrario, CD133 agotamiento reprime la capacidad de formación de colonias de cáncer de colon [44]. Por lo tanto, una mejor comprensión de las características biológicas de CD133
+ AIC puede explicar el fracaso del tratamiento del cáncer, y nos proporcionará nuevos enfoques terapéuticos [45].
Aquí, hemos evaluado el papel de CD133 en el mantenimiento de las características stemness y el potencial tumorigénico de HNSCCs y HN-CICs por caída o sobreexpresión de CD133 lentiviral mediada (Figuras 1 y 3). El agotamiento de CD133 promueve la diferenciación y la disminución de i
n vivo
propiedades oncogénicas de HN-CIC (Figuras 1 y 2). Considerando que, la sobreexpresión de CD133 mejora tumor de formación de esferas capacidad, las células de población lado, la expresión de genes stemness (Oct4 y Nanog) y promueve la capacidad tumorigénico de HNSCC (Figuras 3 y 4).