Extracto
Antecedentes
CD166, también conocidos como leucocitos activados molécula de adhesión celular (ALCAM) , se expresa por varias células en varios tejidos incluyendo el cáncer. Sin embargo, el papel de CD166 en los tumores malignos es controversial, especialmente en el cáncer de páncreas. Este estudio tuvo como objetivo aclarar el papel y el significado de la expresión de CD166 en el cáncer de páncreas.
Métodos
Se realizó inmunohistoquímica y citometría de flujo para analizar la expresión de CD166 en tejidos pancreáticos quirúrgicos y líneas celulares de cáncer de páncreas . Las diferencias entre los aislados CD166 + y células de cáncer pancreático CD166- se analizaron mediante ensayos de invasión y migración, y en modelos de xenoinjertos de ratón. También se realizó RT-PCR cuantitativa y análisis de microarrays para evaluar los niveles de expresión de CD166 y genes relacionados en células cultivadas.
Resultados
La inmunohistoquímica reveló una alta expresión de CD166 en tejidos de cáncer de páncreas (12,2% ; 12/98) en comparación con la de los controles normales del páncreas (0%; 0/17) (p = 0,0435). La citometría de flujo indicó que CD166 se expresa en 33,8 a 70,2% de las células en tejidos pancreáticos quirúrgicos y 0 a 99,5% de las líneas celulares de cáncer de páncreas. ensayos de invasión y migración demostraron que las células de cáncer de páncreas CD166- mostraron actividades más fuerte invasivas y migratorias que los de células de cáncer de CD166 + (p & lt; 0,05). Por otro lado, las células CD166 + Panc-1 mostraron una actividad de formación de colonias significativamente más fuerte que la de las células CD166- Panc-1 (P & lt; 0,05).
In vivo
análisis reveló que las células CD166 + provocaron significativamente mayor crecimiento del tumor que la de las células CD166- (p & lt; 0,05) en ambos modelos tumorales de ratón subcutáneos y ortotópicos. la expresión del ARNm del activador de transición epitelial-mesenquimal ZEB1 se sobre-expresa en las células CD166- (p & lt; 0,001). el análisis de microarrays mostró que TSPAN8 y BST2 se expresaron sobre-CD166 en las células +, mientras que BMP-7 y COL6A1 estaban sobreexpresados en las células CD166-.
Conclusiones
CD166 + en las células de cáncer de páncreas son fuertemente tumorigénico, mientras células del cáncer pancreático CD166- muestran actividades comparativamente más fuerte invasivas y migratorias. Estos hallazgos sugieren que la expresión CD166 se relaciona con diferentes funciones en las células de cáncer de páncreas
Visto:. Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich CD III, Shindo K, et al. (2014) Expresión CD166 /ALCAM es característico de tumorigenicidad y actividades invasivas y migratorias de las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 9 (9): e107247. doi: 10.1371 /journal.pone.0107247
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Abril, 2014; Aceptado: August 8, 2014; Publicado: 15 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Fujiwara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. están disponibles de Gene Expression Omnibus (GEO) en el NCBI (número de acceso GSE55294) los datos de microarrays
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (Grant número: 23390327, 24390318, 24390319, 25670584, 25670585, 25670586, 241237) y la Fundación para Fukuoka sonido de la Salud (http://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( http://www.sukoken.or.jp/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una de las neoplasias humanas más letales, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 5% [1]. Este pobre resultado es en gran parte porque el diagnóstico temprano es poco común y terapéuticos convencionales, tales como la resección quirúrgica, la quimioterapia, la radioterapia y tienen una eficacia limitada [1], [2]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer. Recientemente, el concepto de células madre del cáncer (CSC) ha recibido mucha atención. Los CCC comprenden una población muy pequeña de las células cancerosas que tienen la capacidad para iniciar y sostener la formación de tumores [3]. En consecuencia, la terapia dirigida de esta población de células pequeñas en el cáncer podría ser más eficaz que las terapias actuales, incluyendo los de cáncer de páncreas.
CD166, también conocido como de leucocitos activados molécula de adhesión celular (ALCAM), es un miembro de la inmunoglobulina superfamilia [4]. Es detectable en una amplia variedad de tipos de células, incluyendo células epiteliales, células linfoides, células mieloides, fibroblastos, células neuronales, hepatocitos y células de médula ósea [5]. CD166 se ha informado a ser un marcador de células madre cancerosas en el cáncer de colon y cáncer de próstata, lo que indica una fuerte tumorigenicidad [6], [7]. Por otra parte, su sobre-expresión ha sido reportado como un marcador pronóstico independiente para algunos tipos de cáncer [8]. Por otro lado, la inhibición de CD166 se ha demostrado para mejorar las actividades invasivas y migratorias en células de carcinoma de ovario y de glioblastoma [9], [10]. En el cáncer de páncreas, ha habido datos informados sobre la relación entre la expresión y pronóstico de datos CD166, pero sigue siendo controvertida [11] - [13]
En el presente estudio, se evaluó la significación de la expresión de CD166. en el cáncer de páncreas. Encontramos que las células de cáncer de páncreas CD166 + exhibieron tumorigenicidad más fuerte que la de las células CD166-, mientras que las células de cáncer de páncreas CD166- mostraron comparativamente más fuerte invasiva y actividades migratorias. Estos hallazgos sugieren que la expresión de CD166 se relaciona con diferentes funciones en las células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu (número de registro: 24-222) y llevado a cabo de acuerdo con las directrices éticas para Genoma /Gen humano promulgadas por el Gobierno japonés y la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado proporcionados aprobación del uso de sus tejidos con fines de investigación no especificados. experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu (número de autorización: A-24-262-0). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos.
Pacientes y tejidos pancreáticos
tejidos con cáncer de páncreas se obtuvieron de pacientes que fueron sometidos a resección pancreática en nuestra institución. Por inmunohistoquímica, las muestras se obtuvieron de 98 pacientes con cáncer de páncreas incluyendo 62 hombres y 36 mujeres con una edad media de 65,2 años (rango: 36-81 años). Las características clínico-patológicas de los pacientes se describen en la Tabla 1. La supervivencia global se basa en la fecha de la operación a la fecha de la muerte o el último seguimiento. Los pronósticos se determinaron en septiembre de 2013. La mediana de supervivencia global fue de 16 meses (rango: 1-135 meses). Sesenta y seis pacientes no sobreviven durante el seguimiento. tejidos adyacentes a los especímenes fueron evaluados histológicamente según los criterios de la Organización Mundial de la Salud. El estadio tumoral se evaluó de acuerdo con la clasificación de la Unión Internacional contra el Cáncer. Como control de los tejidos, se obtuvieron 17 muestras de tejido pancreático normal del páncreas intactas que fueron resecados para el cáncer del conducto biliar, tumor neuroendocrino, o un tumor sólido-pseudopapilar benigna. Para el análisis de citometría de flujo, tejidos de cáncer de páncreas se obtuvieron de cinco pacientes, incluyendo tres hombres y dos mujeres con una edad media de 62,0 años (rango = 37-80 años), que habían sido resecados en nuestra institución entre julio de 2013 y de noviembre de de 2013.
procedimientos inmunohistoquímicos y evaluación
CD166 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón (clon MOG /07, 1: 450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) mediante incubación durante la noche a 4 DO. Se utilizó el sistema EnVision (Dako, Glostrup, Dinamarca) para visualizar el inmunotinción. Las células fueron considerados inmunoti~neron positivamente cuando la membrana o el citoplasma estaba manchada. Tejidos sin teñir o débiles y moderadas intensidad de la tinción de & lt; 70% y & lt; 30% de las células, respectivamente, fueron considerados como CD166
baja. CD166
alta fue asignado a los tejidos con débiles y moderadas intensidades de tinción en ≥70% y ≥30% de las células, respectivamente. Las secciones fueron evaluados de forma independiente por dos investigadores sin ningún conocimiento de las características clínicas de cada caso.
Células y condiciones de cultivo
células pancreáticas humanas fueron disociadas de tejidos pancreáticos quirúrgicos utilizando un kit de disociación del tumor (humana ) y gentleMACS Disociador (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inmediatamente después de la disociación, las células se analizaron por citometría de flujo. Además, se analizaron los siguientes nueve líneas celulares de cáncer de páncreas: BxPC3, CFPAC-1, SW1990, AsPC1, y Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Panc-1 (RIKEN, Tsukuba, Japón); MiaPaca2, SUIT-2, y KP-2 (Ciencia Investigación de Recursos del Banco de la Salud, Osaka, Japón). También se analizaron dos líneas normales pancreáticos conductos epiteliales de células: una línea humana primaria normal de páncreas de células epiteliales, CS-PE (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japón), y una línea celular inmortalizada pancreático ductal epitelial, HPDE6-E6E7 clon 6 ( un regalo del doctor Ming-Sound Tsao, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá). Además, se aislaron células estrelladas pancreáticas humanas (PSC) a partir de muestras pancreáticas frescos utilizando el método de extensión [14]. La línea celular SUIT-2 metastásico se estableció previamente en nuestro laboratorio [15]. El mismo método se utilizó para establecer la línea celular Panc-1 metastásico. Las células se mantuvieron como se describe anteriormente [16].
análisis citométrico de flujo y separación de células por inmunoreactividad
Las células de cultivos en monocapa subconfluentes se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con anti monoclonal -humana ALCAM-ficoeritrina (PE) (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN), anti-humano isotiocianato de CD24-fluoresceína (FITC) (eBioscience Inc, San Diego, CA), anti-humano CD44-FITC (MBL, Nagoya, Japón), y los anticuerpos monoclonales anti-CD133 humano-FITC (Ancell Corp, Bayport, MN). Ratón inmunoglobulina G1 K isotipo de control PE (eBioscience Inc) se utilizó como control negativo. IgG1 de ratón de isotipo de control K PE y anti-CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) se utilizaron para excluir las células de ratón a partir de análisis. Las células marcadas se analizaron mediante un citómetro de flujo (EC800; Sony Biotechnology, Tokio, Japón). Para la separación de células, se incubaron microperlas magnéticas conjugadas con el reactivo anti-PE (Miltenyi Biotec) con células marcadas durante 15 minutos a 4 ° C. Las células marcadas se aislaron por pasar la suspensión a través de un separador de PRO AutoMACS (Miltenyi Biotec). células no marcadas se seleccionaron negativamente y se recogieron mediante el método de agotamiento a través del separador AutoMACS PRO.
invasión de Matrigel y migración ensayos
La invasividad de las células del cáncer pancreático se evaluó por el número de células que invadieron a través Matrigel (20 mg /pocillo; BD Biosciences, Bedford, MA) presenta el revestimiento transwell cámaras con 8 micras poros (BD Biosciences) como se describe anteriormente [16], [17]. Las células cancerosas (5 × 10
4 células /0,25 ml) se sembraron en las cámaras superior e incubadas durante 24 h (células Panc-1) 48 h (células SW1990), o 72 h (células SUIT-2). Las células cancerosas que migran a la superficie inferior de las membranas se fijaron con 70% de etanol, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E), y cinco campos aleatorios a 200 × magnificación se contaron para Panc-1 y células SW1990 o un campo centro en un aumento de 100x para las células SUIT-2 con un microscopio óptico (BZ-9000E; Keyence, Osaka, Japón). La migración de células de cáncer pancreático se evaluó mediante insertos transwell no recubiertos. La duración de la incubación para el ensayo de migración fueron de 18 h para células Panc-1, 40 h para las células SW1990, y 24 h para SUIT-2 células. Los resultados se expresaron como la media del número de células que migran en cinco campos aleatorios a 200 × magnificación. Cada condición experimental se ensayó por triplicado, y se realizaron tres experimentos independientes.
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se evaluó mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de yoduro de propidio (PI) como se describe anteriormente [18 ]. Las células fueron sembradas en seis pocillos de una placa de 24 pocillos (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) a una densidad de 1 x 10
4 células /pocillo. Después de incubar durante los tiempos indicados, PI (30 mmol /L) y digitonina (600 mmol /L) se añadieron a cada pocillo para núcleos de etiquetas con PI. La intensidad de fluorescencia de PI, que es igual al número total de células, se midió utilizando un lector de Infinito F200 multimodo (TECAN, Männedorf, Suiza).
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo en Nunc platos de cultivo celular de 6 pocillos (Thermo Fisher Scientific KK, Yokohama, Japón) y se incubaron durante 10 días. A continuación, las células se tiñeron con cristal violeta, y el número de colonias se contó con el Sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Todos los experimentos se realizaron en placas por triplicado.
Esfera ensayo de formación de
Las células se sembraron a una densidad de 5 x 10
3 células bien en 6 pocillos placas de fijación /ultra-bajas ( Corning Inc., Corning, NY) y se cultivaron en DMEM libre de suero: medio F12 de Ham (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 20 ng /factor de crecimiento epidérmico recombinante humano ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10 ng /ml humana factor 2 de crecimiento de fibroblastos recombinante (PeproTech), 1% de insulina-transferrina-selenio Solution (SU-G), 200 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Después de 12 días, el número de esferas que consiste de & gt; se contó 20 células y la imagen en el microscopio de luz. El experimento se realizó dos veces.
Ensayo de adhesión
El ensayo de adhesión se llevó a cabo como se describe en un estudio anterior [12], con modificaciones menores. Las células se sembraron a una densidad de 1 x 10
6 células /pocillo en placas de 24 pocillos (Becton Dickinson Labware). Después de 60 min, las células se lavaron con PBS para eliminar las células no adherentes. Las células adhesivas se tiñeron con violeta cristal y se contaron bajo un microscopio óptico. Todas las condiciones se ensayaron por cuadruplicado y el experimento se realizó dos veces.
experimentos in vivo
Cinco semanas de edad, los ratones hembra desnudos se implantaron por vía subcutánea o ortotópicamente con células de cáncer en suspensión en 100 l de PBS como descrito anteriormente [19]. diámetros tridimensionales se midieron para calcular el volumen del tumor. Los ratones se sacrificaron el día indicado y que los tumores subcutáneos o ortotópico se extirparon y se pesaron. Para el análisis de citometría de flujo, las células tumorales se disociaron usando el kit de disociación del tumor (humano) y gentleMACS Disociador.
El silenciamiento de la expresión de CD166 por las células
Cáncer ARN interferentes pequeños
en aproximadamente 90% de confluencia fueron transfectadas con CD166-7 (SI02780169) pequeños ARN de interferencia (siRNA) (Qiagen, Tokio, Japón) por electroporación usando el Sistema de Nucleofector (Lonza, Bazel, Suiza) según las instrucciones del fabricante. Para verificar la especificidad caída, se utilizó un control de siRNA (Qiagen). Las células se utilizaron en experimentos posteriores en 24 a 144 h después de la transfección.
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando un Kit de Aislamiento de ARN de alta Pure (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y DNasa I (Roche Diagnostics) de tratamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizó con un kit QuantiTect SYBR Green transcripción inversa-PCR (Qiagen) y el Sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad Laboratories). Los cebadores se adquirieron de Takara Bio Inc (Tokyo, Japón). Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2. Cada mezcla de reacción se incubó primero a 50 ° C durante 30 min para la transcripción inversa para sintetizar ADN complementario de primera hebra cebando el ARN total con un cebador específico de gen. PCR se inició mediante incubación a 95 ° C durante 15 min para activar la polimerasa, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 20 s, y 72 ° C durante 30 s. Genes niveles de expresión se calcularon usando una curva estándar construida con ARN total de Panc-1, SUIT-2, o PSCs específicos. Los niveles de expresión de genes se normalizaron a los de β-actina como control interno y se expresaron como la proporción de expresión del gen diana a ß-actina expresión. Todas las muestras se realizaron por triplicado, y cada muestra se analizó por lo menos dos veces. No hay productos de PCR se amplificaron detectables sin transcripción inversa previa. La precisión y la integridad de los productos de la PCR se confirmaron usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA).
análisis de microarrays
Hemos llevado a cabo análisis de microarrays de la células CD166 + y CD166- derivados de ambas líneas celulares Panc-1 y SW1990. Se evaluó la calidad de las muestras de ARN utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer. Se utilizó un HT-12V4 Expresión BeadChip Humano (Illumina, San Diego, CA) para los análisis. Los datos fueron analizados utilizando el software BeadStudio versión 3.2.3 (iluminación).
El análisis estadístico
Los valores se expresan como la media ± desviación estándar. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student. La significancia estadística se definió como p & lt; 0,05. Se utilizó la prueba χ2 para analizar la correlación entre la expresión de CD166 y las características clínico-patológicos observados en el estudio inmunohistoquímico. La supervivencia se calculó mediante el análisis de Kaplan-Meier y las curvas de supervivencia se compararon mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software JMP 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Los casos de cáncer de páncreas son a menudo CD166
alto
La tinción inmunohistoquímica de CD166 se realizó utilizando tejidos pancreáticos resecado quirúrgicamente (Figura 1A). Consistente con un estudio anterior, encontramos una fuerte tinción CD166 en las células de los islotes y la tinción moderada en los nervios como controles positivos [11] - [13]. En algunos casos, CD166 se expresa moderadamente en las células acinares. En 17 muestras de tejido pancreático normal, las células epiteliales ductales pancreáticas no expresan CD166 o CD166 mostraron una expresión débil. Todos los tejidos pancreáticos normales fueron identificados como CD166
baja. En los tejidos de cáncer de páncreas, algunas células cancerosas fueron teñidas moderadamente para CD166, y hemos identificado el 12,2% (12/98) de los tejidos de cáncer de páncreas como CD166
alta. El porcentaje de CD166
altas tejidos de cáncer de páncreas fue significativamente más alta que en tejidos pancreáticos normales (p = 0,0435). En los tejidos de cáncer de páncreas, se encontró que la expresión de CD166 se asoció con la invasión perineural (p = 0,037, Tabla S1), pero no el pronóstico mediante análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (p = 0.1473, Figura 1B).
(A ) La tinción inmunohistoquímica de CD166 se realizó utilizando tejidos pancreáticos resecados. (A) En el páncreas normal, CD166 se expresa fuertemente en la membrana de las células de los islotes (flechas negras) y débilmente en células ductales pancreáticas normales (punta de flecha negro). (B) En algunos tejidos de cáncer de páncreas, cáncer de células fueron positivas para CD166. Aumento original: 200 ×. Inserciones: 600 ×. (B) análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que la intensidad de la expresión CD166 en el cáncer de páncreas no se correlaciona con el pronóstico (p = 0,1473). Análisis de citometría de (C) de flujo de la expresión de CD166 en células separadas basa en la expresión de EpCAM. La tasa de expresión positiva (%) se indica para cada marcador.
También evaluamos CD166expression en los tejidos pancreáticos mediante citometría de flujo. En los tejidos de cáncer de páncreas, el CD166 + tasa varió entre 15,2 y 45,3% a la (media = 29,1%). Debido a que CD166 se expresa en varios tipos de células [5], se utilizó epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM), que se expresa exclusivamente en el epitelio y las neoplasias epiteliales derivadas, para excluir los tejidos no epiteliales del análisis. Entre EpCAM + células (10 a 56,5% de las células, media = 20,6%), la tasa positiva de CD166 varió de 33,8% a 70,2% (media = 47,9%) (Figura 1C). No hubo diferencia significativa entre CD166 y las tasas de positividad EpCAM (p = 0,3488).
CD166 Expresión en líneas celulares de cáncer de páncreas humano
A continuación, se analizó la tasa de CD166 + en líneas celulares de cáncer de páncreas en citometría de flujo, y se encontró que CD166 se expresa en una amplia gama de células (0 a 99,5%) (Figura 2A). En particular, no se encontró relación entre la tasa de CD166 + y los potenciales malignos, tales como la invasión, la migración y la proliferación, que estuvo en línea con las conclusiones de un informe anterior (Tabla S2 y Figura S1) [20]. A fin de evaluar la importancia de la expresión de CD166 en el cáncer de páncreas, se analizaron las células Panc-1 SW1990 y entre los cuales 77,7 a 99,3% (media = 86,4%) y de 38,5 a 54,0% (media = 46,9%) expresaron CD166, respectivamente. Después de la separación de las subpoblaciones CD166 + y CD166-, hemos comprobado CD166 expresión semanal en parental, CD166 +, y las células CD166- durante un período de 6 semanas (Figuras 2B, C). La tasa de CD166 + no cambió significativamente en las células CD166 +, mientras que en las células parentales y CD166- incrementa gradualmente. Es de destacar que no se observan evidentes diferencias morfológicas entre CD166 + y CD166- Panc-1 células (Figura 2D)
.
(A) CD166 tasas de positividad en dos líneas normales de células epiteliales de los conductos pancreáticos, las líneas celulares de cáncer de páncreas, y las células estrelladas pancreáticas (PSC). (B, C) SW1990 (B) y las células Panc-1 (C) (células parentales) fueron separados sobre la base de la expresión CD166 (CD166 + y CD166-) por un separador de AutoMACS PRO. Los cambios en la expresión de CD166 en subpoblaciones parentales y CD166 +/- fueron controlados con frecuencia por citometría de flujo de más de 6 semanas. (D) Morfología de las células Panc-1 separa basado en la expresión de CD166. Aumento original:. 40 ×
CD166- células muestran actividades invasivas y migratorias altas, mientras que las células CD166 + mostrar una actividad de formación de colonias más fuerte
Para explorar los efectos de CD166 en el cáncer de páncreas, diversos procesos asociados con el cáncer se ensayaron en líneas de células pancreáticas que se han separado en base a la expresión de CD166. Se compararon las características invasivas y migratorias de células CD166 + y CD166- derivados de ambas líneas de células Panc-1 y SW1990. CD166- SW1990 y las células CD166- Panc-1 mostraron significativamente mayor invasión de células que la de sus homólogos de células CD166 + (P & lt; 0,05; figura 3A). Además, las células CD166- exhibieron un marcado aumento de potencial migratorio en comparación con la de las células CD166 +, tanto de líneas de células Panc-1 SW1990 y (P & lt; 0,05; Figura 3B). El uso de un ensayo de proliferación, se encontró que las células CD166 + mostraron una mayor actividad proliferativa de la de las células CD166- de la línea celular SW1990 (p & lt; 0,0001), pero no CD166- células de la línea celular Panc-1 (Figura 3C). En el ensayo de formación de colonias, las células CD166 + Panc-1 mostraron una actividad de formación de colonias significativamente más fuerte que la de las células CD166- Panc-1 (P & lt; 0,05; Figura 3D). En ensayos de formación de la esfera y de adhesión, no se encontraron diferencias entre las capacidades de CD166 + y células (Figura 3E y 3F) CD166- 1 Panc.
(A) ensayos de invasión de las células CD166 + y CD166- derivan de SW1990 y Panc-1 líneas celulares se llevaron a cabo mediante el cultivo de las células en insertos Transwell recubiertos con Matrigel. Después de los tiempos indicados, las células de la membrana inferior de los insertos se tiñeron con H & amp; E (imágenes representativas se muestran) y cuantificada. (B) ensayos de migración de las células CD166 + y CD166- de SW1990 y líneas de células Panc-1 se llevaron a cabo mediante el cultivo de las células en insertos. Después de los tiempos indicados, las células de la membrana inferior de los insertos se tiñeron con H & amp; E (imágenes representativas se muestran) y cuantificada. Aumento original: 200 ×. (C) Proliferación de CD166 + y células CD166- derivado de SW1990 y líneas de células Panc-1 se midió en los tiempos indicados después de la siembra inicial. (D) La cuantificación y las imágenes representativas de las capacidades de formación de colonias de células CD166 + y CD166- Panc-1. (E) Cuantificación e imágenes representativas de las capacidades de formación de esferas de CD166 + y células CD166- Panc-1. (F) La cuantificación y las imágenes representativas de las capacidades adhesivas de CD166 + y células CD166- Panc-1. Aumento original: 40 ×. Los datos representan la media ± desviación estándar; *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p Hotel & lt; 0,0001; NS: no significativo.
CD166 + células muestran una fuerte tumorogénesis en los modelos de xenoinjertos de ratón
Para evaluar los efectos de CD166 en
in vivo
el crecimiento del tumor, se trasplantaron por vía subcutánea Las células CD166 + o CD166- en ratones desnudos. Hemos encontrado que las células CD166 + tenían significativamente mayor que la de la tumorigenicidad de células CD166- derivados de la línea celular Panc-1 (p = 0,0082; Figura 4A y Tabla 3). Del mismo modo, SW1990-deriva CD166 + células tendían a generar tumores más grandes que los de las células CD166-, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura S2 y la Tabla S3). En modelos de xenoinjerto de ratón ortotópico, los tumores derivados de células CD166 + Panc-1 eran más pesados que los de las células CD166- Panc-1 (P & lt; 0,05; Figura 4B). El análisis de los modelos subcutáneos y ortotópicos de xenoinjerto por citometría de flujo mostró que el CD166 + tasa en los tumores de las células CD166 + fue significativamente mayor que en los tumores de las células CD166-, aunque inmunohistoquímica no mostró diferencias significativas en la expresión de CD166 (figuras 4C-F). También hubo una relación significativa entre el tamaño de los tumores y el CD166 + tipo de células (Figura 4G).
Ratones (A) se trasplantaron subcutáneamente con los padres, CD166 +, y las células CD166- de la célula Panc-1 línea (imagen representativa), y los volúmenes tumorales se midieron periódicamente durante 7 semanas. modelos de xenoinjertos de tumores ortotópico (B) Mouse también se generaron a partir CD166 + y células CD166- Panc-1. Los tumores se extirparon y se pesaron en húmedo. (C, E) El análisis inmunohistoquímico de CD166 en subcutánea (C) y los tumores ortotópico (E) derivados de CD166 + y CD166- SW1990 y células Panc-1. Aumento original: 100 ×. (D, F) expresión CD166 se analizó en subcutánea (D) y los tumores ortotópico (F) derivados de células CD166 + y CD166- por citometría de flujo. (G) Análisis de la relación entre el peso del tumor y la tasa de positividad de las células CD166 en los tumores ortotópico derivados de CD166 + y células CD166- Panc-1. Todos los gráficos muestran la media ± desviación estándar; *,
p Hotel & lt; 0,05, **,
p
. & Lt; 0,01
CD166- células sobre-expresar la transición epitelio-mesenquimal (EMT) activador ZEB1
Hong et al. informaron que desmontables de CD166 por la interferencia de ARN no tiene ningún efecto sobre el crecimiento o invasión de células de cáncer de páncreas [12]. También inhibió la expresión de CD166 por la interferencia de ARN en la línea celular de cáncer pancreático SUIT-2. Como resultado, desmontables de CD166 no afectó la invasión, la migración, la proliferación, o las actividades de formación de colonias (Figuras 5A, 5B, y S3A-C). Para dilucidar los factores clave que subrayan las diferencias funcionales entre CD166 + y células CD166-, el próximo centramos en la expresión de marcadores de EMT y células madre cancerosas pancreáticas. Se evaluó la expresión de marcadores de EMT en células SW1990 y Panc-1 usando QRT-PCR. En la etapa primaria de la EMT, las células pierden la expresión de marcadores epiteliales, mesenquimales expresan marcadores, y adquieren propiedades móviles e invasoras [21]. El nivel de mRNA ZEB1, un activador EMT, era mayor en las células CD166- que la de las células CD166 +, aunque no hubo diferencias en los niveles de mRNA de epitelial marcador de E-cadherina (Figura 5E). El nivel de N-cadherina mRNA, un marcador mesenquimal, era mayor en las células CD166 + que la de las células CD166-. Además, el nivel de la metaloproteinasa 2 (MMP2) mRNA, que está relacionada a la celda de invasión, se incrementó en CD166- células en comparación con la de las células CD166 + [22]. A continuación, analizamos la relación entre la expresión de CD166 y CSC marcadores CD24, CD44, CD133 y; Sin embargo, no encontramos ningún cambio significativo en su expresión entre las células CD166 + y CD166- derivados de Panc-1 células (Figura 5D) [23], [24].
Análisis (A) QRT-PCR de los niveles de ARNm de CD166 en traje-2 células después de la interferencia de ARN se realizó en los días indicados después de la transfección. De control (siCONTROL) o células CD166 silenciadas (siCD166) se analizaron mediante ensayos (B) de formación de colonias en los días indicados después de la transfección. (C) Análisis de qRT-PCR de EMT marcadores E-cadherina, N-cadherina, Zeb-1, y MMP2 en CD166 + y CD166- Panc-1 y células SW1990. (D) Las relaciones entre la expresión de CD166 y CSC marcadores CD24, CD44, CD133 y en células Panc-1 se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar; *,
p Hotel & lt; 0,05; NS: no significativo.
Análisis de microarrays muestra la sobreexpresión de TSPAN8 y BST2 en células CD166 +, mientras que BMP-7 y COL6A1 se expresan en off en las células CD166-
Para identificar otra tecla moléculas implicadas en la expresión de CD166, se realizaron análisis de microarrays de células CD166 + y CD166- de ambas líneas de células Panc-1 y SW1990. Las comparaciones de los datos de microarrays identificaron 26 genes que son regulados hasta en más de 2 veces en las células CD166 + (Tabla S4) y 11 genes que son regulados hasta en más de 2 veces en las células CD166- (cuadro S5). De estos genes, se seleccionaron TSPAN8, BST2, BMP7, y COL6A1 para su posterior análisis, porque se ha informado de estos genes para participar en la tumorigenicidad o cáncer de la invasión de células y la migración. Seguidamente se realizó un análisis de QRT-PCR para validar los datos de microarrays (Figura 6A) [25] - [29]. Para evaluar los efectos de CD166 caída en la expresión de estos cuatro genes, sus niveles de ARNm se evaluaron en las células SUIT-2 después de la interferencia de ARN. Como resultado, no hubo cambios significativos en los niveles de expresión de estos genes (Figura S4).
(A) QRT-PCR se utilizó para analizar los niveles de ARNm de TSPAN8, BST2, BMP7, y COL6A1, los cuales resultaron ser hasta reguladas por más de 2 veces en las células CD166 + y CD166- en las comparaciones de los datos de microarrays. (B) La tasa de positividad de CD166 en Panc-1 y metastásicos SUIT-2 líneas de células metastásicas se midió por citometría de flujo. También se utilizó el análisis (C) QRT-PCR para examinar los niveles de ARNm de CD166 en las líneas celulares metastásicas. Los datos representan la media ± desviación estándar; *,
p Hotel & lt; 0,05, **,
p Hotel & lt; 0,01, ***,
p
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Para explorar si CD166 juega un papel en la metástasis, se utilizaron dos líneas de páncreas metastásico previamente establecidas de células cancerosas que se han generado a partir de las metástasis hepáticas en modelos de xenoinjertos de ratón nude [15]. Estas líneas celulares, metastásico Panc-1 y metastásico SUIT-2, mostraron un potencial metastásico del hígado más fuerte en comparación con la de sus líneas celulares parentales. En la línea celular Panc-1 metastásico, la tasa de expresión de CD166 se incrementó significativamente en comparación con la de las células parentales (99,2% vs. 46,9%, la Figura 6B). En la línea celular SUIT-2, la mayoría de las células expresan CD166 en ambos SUIT-2 células de los padres (99,3%) y SUIT-2 células metastásicas (99,4%). análisis de QRT-PCR mostró que los niveles de CD166 mRNA tanto metastásico Panc-1 y células SUIT-2 metastásicos fueron significativamente mayores que los de sus líneas celulares parentales (p & lt; 0,0001 y p = 0,0015 para Panc-1 y SUIT-2,