Extracto
Las células madre del cáncer contribuyen a los fenotipos malignos de diversos tipos de cáncer, pero los marcadores para identificar este tipo de cáncer humano (HPC) las células madre siguen siendo poco conocidos. En este caso, nos informan de que el CD271
+ población ordenados desde xwnotransplantado HPC posee una capacidad mejorada iniciadoras del tumor en ratones inmunodeficientes. Los tumores generados a partir de la CD271
+ células contenían tanto CD271
+ y CD271
- células, lo que indica que la población podría someterse a la diferenciación. análisis inmunohistoquímico de los tumores revelaron que el CD271 células
+ localizadas a un nicho perivascular cerca de CD34
+ vasculatura, a frentes invasoras, y a la capa basal. De acuerdo con estas características, un marcador stemness,
Nanog
, y
metaloproteinasas de matriz (MMP)
, que están implicados en la invasión del cáncer, fueron significativamente hasta reguladas en el CD271
+ en comparación con el CD271
- población de células. Por otra parte, el uso de muestras de HPC primarias, hemos demostrado que la alta expresión CD271 se correlaciona con un mal pronóstico para los pacientes. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que CD271 es un nuevo marcador de células madre-como HPC y para el pronóstico HPC
Visto:. Imai T, K Tamai, Oizumi S, K Oyama, Yamaguchi K, Sato I, et Alabama. (2013) CD271 Define una célula-madre similares Población en Cáncer de la hipofaringe. PLoS ONE 8 (4): e62002. doi: 10.1371 /journal.pone.0062002
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Diciembre, 2012; Aceptado: March 17, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Imai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los números de subvención JSP KAKENHI 24300326, 21791589, 24592613, JST cresta, y subvenciones-en-ayudas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, y el fundamento Takeda médica, la Fundación Ichiro Kanehara. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es el sexto cáncer más común en todo el mundo, con cerca de 500.000 nuevos casos y se estima que 300.000 muertes registradas cada año. Este término incluye diversos tipos de cáncer independientes, tales como oral, nasofaringe, orofaringe, hipofaringe y [1]. cáncer de hipofaringe (HPC), un tumor maligno de la hipofaringe, representa aproximadamente el 10% de todas las HNSCCs. Los estudios epidemiológicos indican que el tabaco y el consumo de alcohol contribuyen a su carcinogénesis [2]. Desafortunadamente, alrededor del 80% de los casos de HPC se hacen avanzar en el momento del diagnóstico, es decir, los pacientes se encuentran en el estadio III o IV [3], por lo que el tratamiento es difícil. La cirugía radical, como resultados de laryngopharyngoesophagectomy totales en la pérdida de la voz, y la quimiorradioterapia concomitante con frecuencia causa efectos secundarios potencialmente mortales. Retraso en metástasis ganglionares regionales, metástasis a distancia, y otros tumores malignos primarios se producen con frecuencia durante el curso de la enfermedad [3]. La tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes HPC es no más del 30% [4], lo que sugiere una fuerte necesidad de estrategias de tratamiento innovadoras.
La evidencia acumulada de los últimos años es compatible con el cáncer de células madre (o el inicio de la célula) la teoría [5], [6]. En este escenario fascinante, los cánceres se componen de una jerarquía de las poblaciones de células heterogéneas, y se inician a partir de una subpoblación limitada de células con propiedades de células madre. Con su actividad auto-renovación y la capacidad iniciadoras del tumor, las células madre del cáncer (CSC) o cáncer de células iniciadoras (CIC) generar células madre no cancerosas como una población 'Offspring'. La resistencia a la quimioterapia y la radioterapia es otra de las características de células madre cancerosas. Por lo tanto, los CSC puede ser responsable de los fracasos del tratamiento de quimioterapia y radioterapia, y los resultados clínicos pobres. Hacia el objetivo de desarrollar nuevas terapias CSC-dirigidos, los investigadores han tratado de identificar y caracterizar los marcadores de la superficie celular de células madre cancerosas.
En CECC, CD44
+ células han sido identificadas como células madre cancerosas. Cuando las muestras clínicas de cáncer se xenoinjertado en ratones inmunodeficientes, CD44
+ células pero no CD44
- células inician tumores y los tumores resultantes generan una jerarquía de las poblaciones de células heterogéneas [7]. Sin embargo, un estudio reciente demostró que el CD44
- células forman esferas, poseen la capacidad iniciadoras del tumor, y son quimioresistente, como CD44
+ células [8]. Por lo tanto, la células madre cancerosas puede ser dinámico y heterogéneo en diferentes microambientes [9], y el CD44
+ células no podrá representar a los CAC HNSCC puros. Además, la propia HNSCC es heterogénea, lo que representa diversos tipos de cáncer, como se describe anteriormente. Por lo tanto, la orientación de investigación para cada tipo de cáncer puede conducir a la identificación de marcadores adicionales CSC.
CD271 es una proteína transmembrana que pertenece a la superfamilia de receptores de necrosis tumoral factor. También es un receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), e interactúa con las neurotrofinas, como el NGF, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), y neurotrofina-4 (NT4), con baja afinidad [10 ]. Los antiguos estudios sugieren que las células madre de tejido de vía oral [11], de laringe [12], y [13] epitelios escamosos de esófago expresan CD271. CD271 también se asocia con la células madre cancerosas del melanoma maligno [14], [15] y el carcinoma esofágico de células escamosas [16].
En el presente estudio, hemos demostrado que el CD271
+ población celular de HPC posee la capacidad iniciadoras del tumor
in vivo
, y tiene varias características CSC-como.
Materiales y Métodos
tumor Implantación
Después de obtener el consentimiento informado, especímenes tumorales frescas se obtuvieron en el Centro de cáncer de Miyagi (MCC), transportadas al laboratorio en PBS enfriada (-), y se sometieron a análisis adicionales. Todas las muestras tumorales fueron anónimos, de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de MCC. SCID /IL-2RγC
nula (NOG) ratones /NOD comprado en el Instituto Central de Animales Experimentales Japón fueron anestesiados con pentobarbital. Una vez que los ratones estaban dormidos, se hicieron incisiones en la piel, y pequeños trozos de tumor especímenes unos 50 mm
3 se implantaron bajo la piel del flanco en ambos lados. La formación de tumores se controló semanalmente, y el volumen del tumor se calculó por la fórmula: 1/2 × × rango vertical gama horizontal x altura. Cuando los tumores originales en los ratones NOG xenotransplantados llegado a más de 10 mm de diámetro, los ratones se sacrificaron, y los tumores se dividieron en muestras para la digestión de una sola célula, la formación de esfera, la fijación con formalina para histología, o el paso en serie en ratones. El cuidado de los animales y los protocolos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con los procedimientos y directrices establecidas por los paneles administrativos MCC para el cuidado de los animales de laboratorio. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Preparación de suspensiones de una sola célula de tumor muestras de tejido
En condiciones asépticas, los tumores se cortaron en fragmentos pequeños, y finamente picada con un bisturí estéril. Después de ser lavado con PBS (-), el tejido tumoral se empapó en una solución que contiene PBS (-), 1 mg /ml Dnase1 (Roche), y 1 mg /ml de colagenasa /dispasa (Roche), y se incubó a 37 ° C de 2 a 3 horas, hasta que se produjo la digestión completa. Las células se pasaron a través de una malla de nylon de 40 micras, y se lavaron 3 veces con PBS (-). Después de la centrifugación, la piscina de células individuales se dividió, y se utilizaron las células para los análisis de FACS o la cultura esfera. Para el cultivo de esfera, se suspendieron las células en DMEM /F12 libre de suero suplementado con B27 (Invitrogen), factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF: 20 ng /l: Peprotech), y factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF: 20 ng /. l: Peprotech) en placas de cultivo de ultra-bajas de fijación (Corning)
Flujo de análisis y clasificación de células
Citometría
Disociar las células individuales se suspendieron en PBS (-) con un 3% de SFB. Las células se tiñeron con anticuerpos anti-humanos específicos EpCAM (1:10, conjugado con FITC, Miltenyi Biotec), anticuerpos anti-CD271 humano (1:10, APC-conjugado, Miltenyi Biotec), anticuerpos anti-CD44 humanos (1: 10, los anticuerpos anti-CD133 humanos APC conjugado, Becton Dickinson), (1:10, anticuerpos de control de isotipo kappa APC-conjugado, Miltenyi Biotec), y anti-ratón IgG1, (1:20, APC y FITC-conjugado, Biolegend y Becton Dickinson, respectivamente). 7-AAD se utilizó para excluir las células muertas (Sigma, 1 mg /ml). Las células teñidas se analizaron ya sea con un ™ II FACSCanto (Becton Dickinson) o ordenados con un ™ II FACSAria (Becton Dickinson), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
En tiempo real de transcripción inversa (RT)-PCR
El ARN total se purificó a partir de células individuales ordenados o muestras de tejido usando un kit de aislamiento de mirVana ™ miARN (Ambion), y se transcribió usando un Kit PrimScript II cDNA Synthesis (Takara Bio). Real-time RT-PCR se realizó utilizando SYBR Brilliant III Ultra-Fast Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies).
GAPDH
se utilizó como un gen endógeno de referencia. Las secuencias de los cebadores utilizados para tiempo real RT-PCR se enumeran en la Tabla S1.
La inmunohistoquímica (IHC)
incluido en parafina, fijado con formalina, secciones de tejido de 3 micras se deparaffinized en xileno y rehidratada a través de etanol al agua destilada. recuperación del epítopo inducida por calor se llevó a cabo en el microondas secciones en una solución de recuperación de 9,0 pH objetivo (Dako). La peroxidasa endógena fue bloqueada con 0,3% H
2O
2. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a CD271 humano (1:4000, BD Biosciences) durante 20 min, o para CD34 (Nichirei Biosciences) o Ki-67 (01:10, Santa Cruz Biotechnology) durante 60 min, a 37 ° C . Las secciones teñidas para CD271 se incubaron durante 15 min con LINKER de ratón (Dako), a continuación, anticuerpos secundarios y cromógeno DAB (Kit Envision ™ FLEX, Dako) se aplicaron como se describe en el protocolo del fabricante. Para las secciones teñidas para CD34 o Ki-67, simple manchas AP (M) (Nichirei Biosciences) se aplicó como anticuerpo secundario, y la tinción se visualizó con Nueva fucsina sustrato (Nichirei Biosciences). Para la doble tinción de CD34 o Ki-67, con CD271, CD34 o el Ki-67 La tinción se realizó primero, seguido por el de CD271, tal como se describe anteriormente.
In vivo
Tumorigénesis ensayo
tumores disociadas se ordenan en función de la expresión de EpCAM y CD271 humano, como EpCAM
+ CD271
+ o células EpCAM
+ CD271
- células. Las células clasificadas se suspendieron en 200 l de matriz de Matrigel (BD Biosciences) a 4 ° C, luego se inyecta por vía subcutánea en los flancos de ratones NOG con una jeringa de 1 ml. Cada ratón recibió CD271
+ células en el lado derecho, y CD271
- las células de la izquierda. La formación de tumores se monitorizó por inspección semanal y palpación.
In vivo
quimioterapia Ensayo
cisplatino (CDDP), un fármaco anti-cáncer clasificado como un reactivo de platino, se administró por vía intravenosa o por vía intraperitoneal a 5 o 7,5 mg /kg. Una semana más tarde, los ratones fueron sacrificados, y se extrajeron los tumores. Los tumores fueron divididos y, o bien se fijaron con formalina para IHC, o disociarse en células individuales y se sometieron a análisis FACS.
Estadísticas
Se llevaron a cabo los análisis de supervivencia específica de la enfermedad y la supervivencia libre de recaída con los métodos de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank se utilizó para evaluar la diferencia entre los grupos. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar dos grupos ( "fuertes" frente a la expresión de CD271 "de moderada a débil") en los tumores resecados de 28 casos de HPC, y se utilizó la prueba de chi-cuadrado para comparar los mismos dos grupos en el IHC estudio de 83 casos de HPC. Los valores promedio de
Nanog
expresión entre los dos grupos se analizaron con la prueba t de Student. El nivel de significación se fijó en
p
. & Lt; 0,05
Ética
La Junta de Revisión Institucional de la MCC ha aprobado este protocolo de estudio, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo a partir cada tema. El protocolo de los experimentos con animales fue aprobado por el Comité de MCC Animal Cuidado y Uso (Número de Permiso: MCC-AE-2011-8).
Resultados
Tumores HPC Incluir una subpoblación de CD271
+ células
Para investigar la iniciación del tumor y las células madre del cáncer, muestras de tumor primario frescas obtenidas de pacientes sometidos a cirugía de HPC fueron implantados bajo la piel de ratones NOG 8-10 semanas de edad. Tres muestras de HPC humanos independientes con características clínicas similares fueron utilizados para establecer las líneas de xenoinjertos primarios (HPCM1-3) (Tabla S2). La histología de cada uno de xenoinjertos fue coherente con su muestra primaria (Figura S1).
Para caracterizar las líneas tumorales en serie xwnotransplantado, se analizó la expresión de marcadores de superficie celular. Cada tumor se extrajo desde el host y se preparó como una suspensión de una sola célula. Debido a EpCAM es informado de que un marcador de células tumorales de diagnóstico para HNSCC [17], las células EpCAM positivos humanos fueron estrictamente gated para eliminar las células derivadas del huésped, y se analizaron por citometría de flujo. Entre los marcadores ensayados CSC, las células fueron negativas para CD133, y 3,4% de las células tumorales fueron positivas para CD44 (datos no mostrados). Inesperadamente, se observó una CD271
+ subpoblación entre las tres líneas de HPC prueba (Figura 1A). En experimentos repetidos, la CD271
+ 2.99 población representaba el 20,1% a la de las células en HPCM1. CD271 similares
+ poblaciones eran claramente presente en las otras dos líneas: 2,90 a 9,54% para HPCM2 y el 19,1% para HPCM3. A continuación, analizamos las secciones en parafina de los tumores derivados de las líneas de HPC xenotransplantados para CD271 por IHC (Figura 1B). Dentro de los carcinomas de células escamosas típicos formados por las tres líneas, CD271
+ células fueron principalmente presente en la capa basal del tumor, casi restringida a la zona periférica del nido tumor, y escaso en la parte central (Figura 1B) . Con gran aumento, se observaron células CD271
+ al lado del estroma (Figura 1B-D). Estos CD271
+ células exhiben fenotipos morfológicamente inmaduros, mientras que el CD271
- células en la zona central del nido de tumores tenían más maduro, aplanados, y formas queratinizadas (Figura 1B-e). Para caracterizar mejor la localización de CD271
+ células dentro del HPC, teñidas citoqueratinas (CKs) en las secciones de serie (figura S2). CK5 /6 tiende a localizarse en las capas basales y la proliferación de compartimentos suprabasal, y el CD271
+ células fueron localizados dentro de la región CK5 /6-positivo. El CD271
+ células también fueron moderadamente positivo para CK8, que marca SCC células indiferenciadas. Estos resultados sugieren que el CD271
+ población está incluida en la parte basal de la capa de la zona /6-positivo CK5, y se superpone parcialmente con las células no diferenciadas Ck8-positivo.
Las células (A) derivados de tres líneas de HPC xwnotransplantado se tiñeron para CD271 y analizadas por FACS. tejidos (B) de tumores diseccionados de ratones trasplantados con las tres líneas de HPC se analizaron para la expresión CD271 por IHC. Immunopositivity aparece marrón (a, b, y c). Las imágenes de alta magnificación están vinculados a sus respectivas áreas enmarcadas por las flechas. Barra de escala: 100 micras. La línea roja indica la frontera del tumor y el estroma (d). La línea roja indica la frontera de un CD271
+ grupo de células CD271 y
- células, y puntas de flechas rojas y azules mostrar CD271
+ células CD271 y
- células, respectivamente (e). (C) Los resultados representativos de IHC para CD271 en muestras clínicas. mucosa normal (a), carcinoma de
In situ
. (segundo). Las puntas de flecha indican un frente invasivo, y la expresión fuertemente positiva CD271 (c, d). (D) IHC para CD34 con sustrato Nueva fucsina (a), y la doble tinción para CD34 (New fucsina) y CD271 (DAB) (b-e). immunopositivity CD34 aparece de color rojo. El recuadro muestra imágenes de gran aumento de las áreas enmarcadas. puntas de flechas rojas indican los microvasos CD34-positivas, y las puntas de flecha indican marrones CD271
+ células. células de HPCM1, y la expresión de CD271 elevada en el análisis FACS (E) de formación de esferas. Barra de escala: 25 micras. (F) IHC para la doble tinción de Ki-67 (Nueva fucsina) y CD271 (DAB). Ki-67 immunopositivity aparece de color rojo en el núcleo. puntas de flechas rojas indican las células Ki-67-positivas. Barra de escala:. 100 micras
También examinaron la expresión de CD271 en muestras de HPC clínicamente disecados. En primer lugar, se confirmó que CD271
+ células estaban presentes en la capa más basal de la mucosa de la hipofaringe normal (Figura 1C-a). Del mismo modo, en un carcinoma de
In situ gratis (
CIS
) espécimen, CD271
+ células fueron restringidos a la capa basal, y estuvieron ausentes de las capas superiores más diferenciadas (Figura 1C- segundo). Por lo general, la mayoría de las células cancerosas localizadas en el frente invasivo eran CD271
+ (Figura 1C-c, d). También se examinó si CD271
+ células fueron localizados cerca de la vasculatura dentro de los tumores. Se encontró que el CD34
+ células endoteliales microvasculares (rojo en la Figura 1D) se encuentra en el CD271
+ áreas de células, y las imágenes de mayor aumento se observa que algunos CD34
células
+ y CD271 + eran cerca de cada otra, o en contacto directo (Figura 1D-a, b). Es de destacar que, en la mayoría de los especímenes, el CD271
+ células forman racimos densos que estaban rodeadas de estroma, que contenían CD34
+ microvasos (Figura 1D-c, d, e). En conjunto, estos datos indicaron que CD271
+ células están presentes en el frente invasivo y en el área perivascular de tumors.It Es bien sabido que las células de varios tipos de cáncer, incluyendo HNSCC, que esferas forman bajo condiciones de cultivo de suspensión incluyen CSC [18 ]. Por lo tanto, se examinó si la cultura esfera formación afectaría a la expresión de CD271. Disociadas esferas células de cáncer generados que sobrevivieron durante 12 días, y las células individuales preparadas a partir de estas esferas se sometieron a análisis CD271 (Figura 1E). CD271 se expresó en 46,5% de estas células, en contraste con el tumor de células HPCM1 original, en la que 2,99 hasta 20,1% de las células eran CD271
+. Este resultado sugiere que
in vitro
formación de esferas en causó el enriquecimiento de CD271
+ células.
También examinó si el CD271
+ células son una población en proliferación. experimentos dobles -staining con Ki-67 y CD271 mostraron que el CD271
+ células principalmente residido en la capa basal, mientras que las células Ki-67-positivas localizadas principalmente a las capas suprabasales relativamente diferenciados (Figura 1f). Estos resultados sugieren que el CD271
+ células no proliferan activamente
in vivo
.
CD271
+ Las células son Tumorígeno y diferenciar
in vivo
a continuación examinó el
in vivo
tumorigenicidad del CD271
+ células de las tres líneas de HPC. Treinta a 100.000 CD271
+ o CD271
- células se inyectaron por vía subcutánea en cada lado de la misma ratón para evitar cualquier /diferencias ambientales huésped (Figura 2A). La exactitud de la clasificación se confirmó por análisis FACS (Figura 2B). Los resultados de xenotrasplantes se resumen en la Tabla 1. En HPCM1, el CD271
+ células tumores iniciados a una velocidad extremadamente alta, incluso cuando se les inyectó menos de 300 células (pero al menos 30 células). Treinta CD271
- células generado por un tumor en sólo uno de los seis inoculaciones, y el tumor que se formó fue mucho menor que las iniciadas por el CD271
+ células (Figura 2C). Del mismo modo, para HPCM2, todos los tumores que se formaron, a excepción de uno, surgieron de CD271
+ células. Aunque el CD271
- células en los tumores generados HPCM3, que mostró una mayor latencia y menor frecuencia que los que se desarrolló a partir de CD271
+ células. Estos datos indicaron que el CD271
+ células poseían más alta que la tumorigenicidad CD271
-. Células
in vivo
(A) representativos tumores en ratones en los que el número indicado de se trasplantaron células. puntas de flechas rojas indican los sitios CD271
+ inyección de células (lado derecho), y las puntas de flecha azules indican CD271
- puntos de inyección de células (lado izquierdo). Círculos y círculos de trazos indican las ubicaciones de trasplante que resulta en el éxito y el fracaso de la formación de tumores, respectivamente. (B) La citometría de flujo análisis de las células clasificadas (96.8~99.5% CD271
+ o CD271
- células). (C) Treinta CD271
+ células (lado derecho) y CD271
- células (lado izquierdo) se trasplantaron en un ratón, y se resecaron los tumores generados. El crecimiento del tumor se representó gráficamente utilizando el valor medio. (D) La citometría de flujo análisis de la expresión CD271 de las células tumorales resultantes de la inyección de CD271
+ células. Tumor secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Barra de escala:. 100 micras
Morfológicamente, el CD271
+ células formaron tumores que se asemejaba a la de origen histológico, con las características típicas de SCC: basal de la morfología de las células como en la zona periférica , y las células diferenciadas en la porción central del nido tumor (Figura 2D). También se examinaron los tumores generados para la expresión CD271 mediante citometría de flujo. Los tumores que surgen de la CD271
+ células contenían tanto CD271
+ y CD271
- células (Figura 2D). Por lo tanto, el CD271
+ población tiene el potencial de generar una jerarquía de CD271-expresión y células, así como la capacidad de iniciar el cáncer que no expresa.
Perfil de expresión de genes de CD271
+ las células revela algunas características de troncalidad y la invasividad
a continuación pregunta si el CD271
+ población tenía características asociadas con las células malignas en términos de troncalidad y la invasión /metástasis. En primer lugar, la expresión de genes relacionados con las células madre pluripotentes,
Nanog
,
Sox2
, y
Oct-4
fue examinado. Los análisis en tiempo real de RT-PCR indicaron que la
Nanog
expresión fue significativamente mayor en el CD271
+ células de las tres líneas de HPC que en el CD271
- células (Figura 3A). IHC de las secciones de serie mostró la inclusión de CD271
+ células en la capa basal Nanog-positivos (Figura S3A). Sin embargo, la expresión de
Sox2
y
Oct-4
no mostró una tendencia consistente (Figura S4). A continuación, la expresión de tres genes relacionados con la invasión de tipo de secreción,
MMP1
,
MMP2
, y
MMP10
fue examinado (Figura 3B). CD271
+ células a partir de las tres líneas de HPC mostró una marcada elevación en
MMP1
, que varió de 2.3 a la 7.3 veces en comparación con el CD271
- células. Del mismo modo,
MMP2
se incrementó 3.6-4 veces en los
células CD271 +. El prominente
MMP10
regulación se observó en el CD271
+ población de HPCM3, a un nivel que era más de 40 veces mayor que en el CD271
- células. A continuación realizó tinción IHC serie de MMP1, MMP2, y MMP10, y encontramos que el CD271
+ células fueron positivas para estas MMP (Figura S3B). Los niveles de mRNA de
MMP9, MMP11, MMP14 y (MT1-MMP)
variada entre las líneas celulares, con dos líneas de las tres muestran mayores expresiones de cada MMP (Figura S5). Teniendo en cuenta la localización de las células CD271
+ en los frentes invasivos, estos resultados sugieren que el CD271
+ células están armados con las MMP que permiten la invasión de tejidos, rompiendo la matriz extracelular.
Nanog
expresión (a) y
MMP1
,
MMP2
, y
MMP10
expresión (B) en CD271
+ y CD271
- células derivadas de las tres líneas de HPC se analizaron por tiempo real RT-PCR. Los niveles de transcripción se normalizaron a los de
GAPDH
, y el factor de cambio en el nivel de expresión de MMP en CD271
+ células CD271 frente a
- las células se calculó para cada muestra. Los valores son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
CD271
+ células se chemoresistant
in vivo
Para determinar si el CD271
+ población es quimiorresistente, se analizó el efecto de CDDP sobre las células. Nuestra
in vitro
análisis inicial falló, debido a la dificultad en el mantenimiento de cultivo de tejido, ya sea bajo condiciones de cultivo de tejidos regulares con suero o en condiciones de cultivo esfera libres de suero (datos no mostrados). Por lo tanto, hemos utilizado un
in vivo
modelo de evaluación. Los ratones que portaban tumores derivados de HPCM1 se trataron con CDDP, y en el día 7, se resecaron los tumores, se seccionaron, y se examinaron mediante IHC para CD271 (Figura 4A). El aplanado y queratinizado CD271
- células en la zona central del tumor estaban en el proceso de la muerte, lo que sugiere que la quimioterapia había causado necrosis masiva en estas células (Figura 4A). Por el contrario, como era más evidente en la capa basal, CD271
+ células sobrevivieron y fueron rodeados por estroma. Para verificar que los CD271
+ células fueron refractarios a CDDP, una suspensión de una sola célula preparado a partir de un tumor tratado con CDDP se analizó por FACS (Figura 4B). Después de la administración de CDDP, el CD271
+ población aumentó de 16,3% a 35,2%, lo que sugiere que el CD271
+ células fueron resistentes a CDDP. La resistencia a múltiples fármacos de los CAC se atribuye a una elevada expresión de los transportadores de unión a ATP [19], por ejemplo, ABCC2 contribuye al flujo de salida de CDDP y docetaxel, y ABCB5 y ABCG2 contribuir al flujo de salida de 5-FU. por lo tanto, se comparó la expresión de estos tres transportadores de unión a ATP en el CD271
+ y CD271
- células de HPCM1 (Figura 4C). La expresión de
ABCC2
,
ABCB5
, y
ABCG2
en el CD271
+ células fue aproximadamente 2,5 veces, 4,8 veces y 2,4 veces mayores que en el CD271
- células, respectivamente. En conjunto, estos resultados indican que el CD271
+ células son quimiorresistente.
(A) HPCM1- ratones trasplantados fueron tratados con 7,5 mg /kg de CDDP para una semana, a continuación, los tumores generados fueron analizados por IHC para CD271. áreas enmarcadas están vinculados a sus respectivas imágenes de gran aumento por las flechas horizontales. Barra de escala: 100 micras. análisis (B) FACS para CD271 en células HPCM1 derivadas de ratones con o sin tratamiento CDDP. (C) Expresión de
ABCC2
,
ABCB5
, y
Hoteles en ABCG2 CD271
+ y CD271
- células analizadas por tiempo real de RT-PCR . Los niveles de transcripción se normalizaron a los de
GAPDH
, y el aumento de pliegue de cada nivel de expresión génica en CD271
+ células CD271 frente a
- se muestran las células. Los valores son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Expresión CD271 en muestras clínicas de HPC se correlaciona con un mal pronóstico
Para investigar si la expresión de CD271 se asoció con factores pronósticos para primaria HPC pacientes, 83 muestras clínicas obtenidas de la cirugía o biopsia fueron examinados para CD271. Para esta evaluación, debido a que el CD271
+ células fueron localizados heterogéneamente dentro de cada tumor, se utilizó un sistema de clasificación que clasifica cada caso, ya sea como "fuerte", si tuviera más del 50% CD271
+ células en todo el tumoral, o "moderada a débil", si tenía menos de 50%. Todas las diapositivas fueron evaluados de forma independiente por dos investigadores (I. S. y K. M.) sin ningún conocimiento previo de la información clínica de cada paciente. Por IHC tinción de las muestras de tejido HPC con un anticuerpo anti-CD271, 36 de los 83 casos fueron clasificados como fuerte, y 47 eran moderada a débil (Figura 5A). Las características clínicas y patológicas de los 83 pacientes se resumen en la Tabla S3. El grado de CD271 se analizó estadísticamente con respecto a la T-etapa clínica, N-etapa, y la etapa de la enfermedad. Los porcentajes de tipos de cáncer en la etapa T avanzado (T3 o más) y etapa avanzada N (N2 o más) fueron significativamente mayores en el grupo fuerte CD271 que en el moderada a débil grupo (47,2% frente a 23,4%:
p = 0,023
, y 69,4% frente a 40,4%:
p = 0,009
, respectivamente). Del mismo modo, los casos de enfermedad avanzada (estadios III y IV) fueron más frecuentes en el grupo fuerte CD271 que en el grupo de moderada a débil (80,6% vs 55,3%:
p = 0,016
). A continuación, la tasa de supervivencia específica de la enfermedad se comparó el uso de los métodos de Kaplan-Meier. La tasa de supervivencia de tres años fue significativamente menor en el grupo fuerte CD271 en comparación con el grupo de moderada a débil CD271 (54,3% vs 83,2%:
p = 0,043
) (Figura 5B). Estos datos indican que la expresión de CD271 histológico se asocia con resultados clínicos pobres.
(A) Los resultados representativos de IHC análisis para CD271 en muestras clínicas obtenidas de 83 pacientes de HPC por cirugía o biopsia. Immunopositivity ser pardo. Las muestras con células positivas más del 50% en todo el tumor se clasificaron como "fuerte" (arriba), y menos del 50%, como "moderada a débil" (parte inferior). (B) Análisis de Kaplan-Meier para la supervivencia específica de la enfermedad (3 años) de los grupos "fuertes" y "moderadas a débiles". * Estadísticamente significativo.
Además, examinó si el
CD271
la expresión de genes en muestras clínicas se asoció con el pronóstico de los pacientes. Para este análisis, se examinaron 28 casos de HPC que fueron resecados completamente, tal como se evaluó tanto quirúrgicamente e histológicamente, por
CD271
expresión. Inmediatamente después de la resección, cada muestra se separó en tumor y la mucosa de la hipofaringe normal. Los ARN totales purificados a partir de estos tejidos respectivos, se sometieron a
CD271
la cuantificación del mRNA. Debido a que la mucosa normal también expresa CD271 (Figura 1C), se utilizó un "índice de CD271-expresión," el valor de
CD271 Hoteles en tumor frente que en la mucosa normal, ya que el nivel de CD271. Durante el periodo medio de 20 meses de seguimiento, 11 de los 28 casos con recaídas. Todas las recaídas se produjeron dentro de los 18 meses, y se analizó la supervivencia libre de recaída durante 18 meses utilizando los métodos de Kaplan-Meier (Figura 6A). El uso de un valor de corte para el índice de CD271-expresión de 1.5, el
CD271
-Alta expresadores recayeron significativamente con más frecuencia que los
CD271
-bajos casos (41,1% vs 80,0% relapse- supervivencia libre, respectivamente:
p = 0,035
). Las características demográficas y clínicas de estos pacientes se muestran en la Tabla S4. Para la clasificación de la enfermedad clínica, pT3 o más fue significativamente más frecuente en los casos CD271-alta (CD271-alta 15/17, 5/11 CD271-baja;
p = 0,022
). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la expresión de CD271 se asocia con pobres resultados clínicos en cuanto al pronóstico y la recaída.
(A) Análisis de Kaplan-Meier para la tasa de supervivencia libre de recaída de acuerdo con el
CD271
nivel de ARNm, en los tejidos tumorales derivadas de 28 pacientes con cirugía de HPC. Real-time RT-PCR se realizaron análisis, normalizó a la expresión de
GAPDH
, y el factor de cambio en
se calculó CD271
niveles de expresión en el tumor en comparación con la mucosa normal. El valor de corte para el
CD271
-expresión índice fue de 1,5. *Estadísticamente significante. (B)
Nanog
expresión fue examinado por tiempo real RT-PCR. el valor de corte para el
Nanog
expresión índice fue de 1,5. *Estadísticamente significante. Los círculos cerrados, CD271 alta;