Extracto
El carcinoma nasofaríngeo (NPC) es una neoplasia epitelial única asociada con el EBV, mostrando fenotipo altamente invasivo y metastásico. Pese a la creciente evidencia que demuestra el papel fundamental de las células madre, como el cáncer (CSC) en el mantenimiento y la progresión de los tumores en una variedad de tumores malignos, la existencia y las propiedades de la CSC en la APN asociada con el EBV son en gran parte desconocidos. Nuestro estudio pretende dilucidar la presencia y el papel de las células madre cancerosas en la patogénesis de esta enfermedad maligna. células formadoras de esfera se aislaron a partir de una línea celular de la APN VEB positivo C666-1 y sus propiedades iniciadoras de tumores fueron confirmados por
in vitro y Hoteles en
in vivo
ensayos. En estos esferoides, se encontró que la sobre regulación de múltiples marcadores de células madre. Por citometría de flujo, hemos demostrado que tanto CD44 y SOX2 se sobreexpresa en la mayoría de las células C666-1 de formación de esferas. se detectó que las células CD44 + + SOX2 en una población menor en xenoinjertos EBV positivos y tumores primarios y considerados como potenciales CSC en la APN. Cabe destacar que el NPC células CD44 + aisladas fueron resistentes a agentes quimioterapéuticos y con mayor eficiencia en la formación de esferoides, que muestra propiedades de CSC. Por otro lado, el análisis de microarrays ha revelado una serie de genes expresados diferencialmente implicadas en la regulación de la transcripción (por ejemplo,
FOXN4
,
GLI1
), la respuesta inmune (
CCR7
,
IL8
) y el transporte transmembrana (por ejemplo,
ABCC3
,
ABCC11
) en los esferoides. Entre estos genes, aumento de la expresión de CCR7 en CD44 + células madre cancerosas se confirmó en xenoinjertos de la APN y los tumores primarios. Es importante destacar que el bloqueo de CCR7 abolió la capacidad de formación de esferas de C666-1
in vitro
. La expresión de CCR7 se asoció con enfermedad recurrente y la metástasis distante. El estudio define las propiedades específicas de una subpoblación de NPC CSC asociada con el EBV. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el desarrollo de terapias eficaces de orientación de los CAC, potenciando así la eficacia del tratamiento para los pacientes NPC
Visto:. Lun SW-M, Cheung ST, Cheung OPU, Para KF, Woo JK-S, Choy KW , et al. (2012) Las células de vástago Al igual que CD44 + en cáncer asociado al EBV carcinoma nasofaríngeo. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10.1371 /journal.pone.0052426
Editor: David Loeb, Universidad Johns Hopkins, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de julio de 2012; Aceptado: 12 Noviembre 2012; Publicado: December 21, 2012
Derechos de Autor © 2012 Lun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por el Consejo de Ayudas a la Investigación de Hong Kong (GRF: subvención No. 470321, 471610, 471211, 471709; GRF: Grant Nº CUHK8 /CRF /11R; AOE /M-06/08) y el Consejo de Ayuda de Investigación (GRF776608M; GRF777809M). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En la actualidad, los co-autores Kwok Wai-Lo, Tim Cheung Siu, Pierre Busson y Sai Wah Tsao son miembros de PLOS ONE consejo editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
no queratinizado carcinoma nasofaríngeo (NPC) es una neoplasia epitelial evidente derivado de la cabeza y la región del cuello. Se asocia constantemente con el virus de Epstein-Barr (EBV) y muestra características clínicas y patológicas único. Con la expansión clonal de una sola célula progenitora infectadas con EBV, la expresión constitutiva de genes latentes virales y acumulación de múltiples cambios genéticos contribuyen a la iniciación y progresión de este cáncer [1], [2].
NPC demuestra fuerte preferencia geográfica, por una alta prevalencia en el sudeste asiático, especialmente en la región cantonesa, incluyendo Hong Kong, con una incidencia anual de 25-50 por 100.000 personas [1]. El principal tratamiento para la APN es o bien la radioterapia o la quimioterapia y radioterapia combinada que muestra sobre la tasa de curación del 90% en los pacientes con enfermedad en estadio temprano [3]. Sin embargo, el resultado para los pacientes con enfermedades avanzadas loco-regionales y metástasis a distancia son insatisfactorios. importantes tasas de recidiva y metástasis distante todavía ocurren en estos pacientes tras radioterapia o quimioterapia y radioterapia. Uno de los principales mecanismos para tal recurrencia post-terapéutica de la APN ha sido sugerida por la "célula de tallo como el cáncer '(CSC) propuesta [4].
De acuerdo con el modelo CSC, los cánceres se organizan jerárquicamente similares a los tejidos normales y el crecimiento del cáncer y la progresión son impulsados por un pequeño subconjunto de las células tumorales con propiedades de células madre, las células madre cancerosas. Esta subpoblación de células raras es responsable de la iniciación del tumor, el mantenimiento y la regeneración [4], [5]. CSC se han identificado en varios tumores malignos humanos como el de mama, de próstata, de ovario, de pulmón y carcinoma de cabeza y cuello [5], [6], [7], [8], [9]. Las capacidades de estas células para iniciar el crecimiento del tumor, mantener la auto-renovación y facilitar la resistencia a los medicamentos han sido ampliamente probada. Teniendo en cuenta las propiedades únicas de los CAC, la recaída de los tumores se sugiere que es debido a la falta de erradicar todas las células madre cancerosas y células madre cancerosas supervivientes a continuación reconstituir el tumor en regiones locales y distantes
.
Aunque CSC han demostrado ser vital en el desarrollo de la mayoría de los cánceres, la información sobre su existencia en NPC asociada con el EBV es escasa. De cualquier investigación se realizó utilizando líneas celulares EBV negativo o no pudo aclarar las células madre cancerosas funcionales [10], [11], [12]. Nuestro grupo ha establecido previamente varias líneas tumorales EBV positivo de los pacientes NPC en regiones endémicas [13], [14], [15], [16] y el uso de estas células tumorales con EBV positivo nativos, que tuvo como objetivo identificar y caracterizar la APN funcional los CSC.
En este estudio, se aislaron células de formación de esferas ( '') de esferoides línea celular EBV positivo C666-1 y sus propiedades de células madre fueron confirmados. Hemos puesto de manifiesto que CD44 y Sox2 se expresan en la mayoría de estas células madre cancerosas. Por el análisis de microarrays, se identificaron genes celulares expresadas aberrantemente en células madre cancerosas. Curiosamente, CCR7, un receptor de quimiocinas de superficie celular, se encontró que se expresa consistentemente en las líneas de la APN y tumores primarios. Coincidentemente, se sobreexpresa en nuestra identificado NPC CSC y la neutralización de este receptor abolió la capacidad de formación de esferas de C666-1. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia de la presencia de células madre cancerosas tumorigénicos en NPC EBV positivo y CCR7 podría desempeñar un papel en su función tumorigénico. Los hallazgos anteriores mejorarán nuestra comprensión de la naturaleza de la APN células madre cancerosas, lo cual es crucial en el desarrollo de la intervención terapéutica más eficaz contra esta enfermedad.
Resultados
Capacidades CSC de esferoides derivados de la APN EBV positivo
CSC poseían la capacidad para formar esferas tumorales independientes de anclaje cuando se crece en medio libre de suero especializada. Como se muestra en la Figura 1A, se formaron esferas tumorales de libre flotación cuando las células C666-1 disociadas se cultivaron en placas no recubiertas en medio de células madre libre de suero. esferoides no adherentes se observable a los 6-8 días y fueron enzimáticamente disocian en células individuales para semanal pasaje. esferoides prototípicos distintas se formaron 28 días después de la siembra. Este tumor esferas flotantes auto-renovación podrían ser pasados en serie y se dejaron crecer durante más de 3 meses. Cuando las células individuales a partir de esferoides se cultivó en placas adherentes con medio completo (RPMI-1640 con FBS al 10%), las células adheridas a la placa y las colonias formadas sistemáticas, que muestra la morfología celular epitelial similar a la de las células C666-1 monocapa parental flotante (Fig . 1A, panel derecho).
() a esferas tumorales libre flotación se forman a partir de células C666-1 EBV positivo (panel izquierdo) y demostraron capacidad para diferenciar de forma comparable a las células en monocapa sobre la administración de medio completo ( panel de la derecha). (B) por QRT-PCR, múltiples genes relacionados con las células madre (Oct4, Nanog, ALDH1, CKIT, CD44, CD133) se enriquece en esferoides cuando se compara con los padres C666-1. La transcripción de SOX2 no fue mayor en los esferoides. (C) proteína SOX2 se expresa frecuentemente en las células de formación de esferas C666-1. Por citometría de flujo, se encontraron células Sox2-positivo (+) Sox2 ser enriquecido en y se constituye más del 60% de la población de células de formación de esferas. (D) Más del 80% de las células de formación de esferas expresadas marcador de superficie celular CD44 mientras que las células CD44 + en detectó en los padres C666-1 y otros xenoinjertos NPC fueron significativamente menores (todo el
P Hotel & lt; 0,001). Histogramas que denota la media ± SE (n≥3) con significación estadística calculada mediante la prueba t (*
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Para medir la capacidad tumorigénico de esferoides, se inyectaron diversas cantidades de células de formación de esferas y las células C666-1 los padres no seleccionados por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos.. Se encontró que 10.000 células de formación de esferas podrían formar tumores en todos los ratones inoculados (Tabla 1). La inyección de 1.000 células esferoide de vez en cuando formó un tumor de cada seis ratones. Sin embargo, por lo menos 500.000 células C666-1 no seleccionados fueron necesarios para la formación de tumores. Las células esferoide mostraron al menos 50 veces mayor tumorigénicos potencial que las células no seleccionadas. A fin de verificar si las células de formación de esferas son capaces de propagar en serie en ratones desnudos, xenoinjertos desarrollados a partir de esferoides fueron arraigado en serie en ratones desnudos. Todos ellos mostraron trasplantes exitosos de serie y los tumores eran observables a las 3-4 semanas (datos no mostrados).
A continuación, examinamos el patrón de expresión de varios marcadores de células madre y antígenos de superficie en estos esferoides. Por análisis de QRT-PCR, se encontró que la expresión de múltiples marcadores de células madre (Oct4, NANOG, ALDH1, CD44 y CD133) en esferoides fue significativamente mayor que la de las células parentales C666-1 monocapa (todo
P
& lt; 0,05, Fig 1B).. También se observó una mayor expresión de CKIT, KLF4 y KLF5 en los esferoides. Aunque no detectamos sobre regulación de la transcripción Sox2 en las células de formación de esferas, mostraron ser altamente enriquecido en los esferoides (70,8 ± 2,16%) por citometría de flujo (todos los
células Sox2-expresión (Sox2 +) P
& lt; 0,001, figura 1C).. También se detectó la expresión de Sox2 en 0,77 ± 0,13% de las células en xenoinjertos de la APN. Los resultados confirmaron que los esferoides derivados de células C666-1 EBV positivo exhiben fenotipos CSC.
formación de esferas células madre cancerosas expresan la proteína de superficie celular CD44
Desde la transcripción de CD44 y CD133 se incrementaron significativamente en esferoides, entonces comprobado si la expresión de estos marcadores de superficie CSC era específico para las células de formación de esferas de la APN. Por citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia, hemos demostrado que la mayoría de las células en esferoides C666-1 (84,14 ± 1,12%) fueron CD44 positivo (Fig. 1D y la Fig. S1). También se encontraron células CD44 + como una subpoblación de las células parentales C666-1 (5,28 ± 1,29%) y tres xenoinjertos de la APN, xeno-666 (12,31 ± 1,97%), xeno-2117 (9,58 ± 1,80%) y C17 (17.31 ± 1,76%) (Fig. 1D). Sin embargo, no se detectaron células CD133-expresan solamente en 32.11 ± 2.35% de las células esferoides y 1,90 ± 0,84% de células C666-1 parentales. Además, las células CD133 + eran completamente ausente en 2 de los xenoinjertos (xeno-666 y xeno-2117) (Fig. S2). Por lo tanto, hemos propuesto que CD44 es un marcador candidato común superficie de CSC para la APN VEB positivo.
Las células CD44 + Sox2 Express y presentar un perfil Clone- y de formación de esferas Eficiencia
La expresión de la transcripción de células madre factor de SOX2 se detectó consistentemente en una célula tumoral sub-población de NPC primario y se cree que es un marcador potencial para NPC CSC [12]. En consecuencia, se evaluó la co-expresión de CD44 y SOX2 en esferoides y células C666-1 monocapa no seleccionada, así como 3 y 5 xenoinjertos de tumores primarios mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 2, más del 60% de las células esferoides (66,57 ± 2,72%) expresado tanto CD44 y Sox2. Coincidentemente, la expresión de Sox2 rara vez se detectó en la fracción de células CD44- de formación de esferas C666-1, lo que sugiere una expresión preferencial de este factor de transcripción de células madre en células CD44 +. Co-expresión de CD44 y SOX2 también se detectó en 0,1-9% de las células en la línea de células NPC, xenoinjertos y tumores primarios. Los hallazgos implican que las células CD44 + SOX2 + son células madre cancerosas potenciales en la APN. Para probar esta hipótesis, hemos realizado ensayos funcionales en las células CD44 + y CD44- aislados de células C666-1 parentales. figuras representativas de la expresión de CD44 en las células CD44 + aisladas y CD44- se muestran en la Figura S3. Como se muestra en la Figura 3A, se detectó significativamente más alta eficacia de formación clon en la fracción CD44 + de células que la de fracción CD44- (
P
& lt; 0,01). Por otra parte, las células CD44 + pueden generar significativamente mayor número de esferoides en comparación con las células CD44- (
P
. & Lt; 0,001, Figura 3B).
Por citometría de flujo, se encontró SOX2 ser preferentemente expresado en las células CD44 + y por coincidencia, la expresión de Sox2 rara vez se detectó en las células CD44-. No se encontraron células que coexpresan ambos CD44 y Sox2 ser enriquecido en esferoides. Histogramas que denota la media ± SE (n≥3) con significación estadística calculada mediante la prueba t (*
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. & lt; 0,001) guía empresas
CD44 + fracción de células mostraron una significativamente mayor (a) eficiencia en la formación clon y (B) la eficiencia de formación de esferas en comparación con la fracción de células CD44-. Además, (C) CD44 + células mostraron significativamente mayor tasa de proliferación de las células CD44-. (D) característica de la jerarquía del desarrollo de las células CD44 +. Porcentaje de células CD44 + se reduce continuamente en la aislada fracción de células CD44 + en el tiempo. (E) CD44 + células exhibieron mayor resistencia al tratamiento 5-FU en comparación con el CD44- y células C666-1 parentales. Todos los gráficos que denota la media ± SE (n≥3) con significación estadística calculada mediante la prueba t (*
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. & lt; 0,001) guía empresas
proliferación de las células CD44 +
Por ensayo de proliferación WST1, las células CD44 + mostraron una tasa de proliferación significativamente mayor en comparación con la de los padres y CD44- C666-1 células, mientras que las células CD44- mostraron una tasa de proliferación significativamente menor en comparación con las células parentales C666-1. (todos p. & lt; 0,01, figura 3C) guía
la relación jerárquica de las células CD44 + y CD44-
de acuerdo con las propiedades de CSC, que reveló que las células CD44 + C666-1 ordenados poseían la capacidad de dar lugar a dos células CD44 + y CD44-. Como se muestra en la Fig. 3D, una disminución de la fracción de células CD44 + en las células CD44 + según se detectó por citometría de flujo con el tiempo. Es probable que ordenadas células CD44 + dan lugar a una población heterogénea a través de regulación a la baja de CD44 en un subconjunto de estas células después del cultivo
in vitro.
Sin embargo, ningún cambio significativo en el porcentaje de la fracción de células CD44 + en tanto no seleccionados parental y según se detectó células CD44- después de 3-6 días de travesía. Los resultados sugieren una relación jerárquica de las células CD44 + y CD44- en NPC asociada con el EBV.
quimiorresistencia de las células CD44 +
Para examinar la quimio-resistencia de las células CD44 + a agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, se realizó ensayos de supervivencia celular de las fracciones de células CD44 + y CD44- tratados con fluorouracilo (5-FU), cisplatino o doxorrubicina. La fracción de células CD44 + de C666-1 exhibió la quimio-resistencia más fuerte a 5-FU en comparación con las células no seleccionadas C666-1 de los padres y de la fracción CD44- (todo el
P Hotel & lt; 0,05) (Fig. 3E). La quimio-resistencia de las células CD44 + hacia el cisplatino o doxorrubicina fue similar a las células CD44- y C666-1 parentales (datos no mostrados).
Los genes expresados diferencialmente en derivados de la APN esferoides
Para caracterizar integralmente el propiedades de las células madre cancerosas de la APN, se analizó la expresión de genes celulares y EBV en las células de formación de esferas NPC utilizando microarrays olignonucleotide y ensayos de qPCR. En primer lugar, se evaluó el número de copias de EBV y el nivel de expresión de genes de EBV EBNA1 incluyendo, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 y BZLF1 en esferoides C666-1. Las células de formación de esferas mostraron mayor número de copias de EBV y la expresión génica latente que las células C666-1 parentales (Fig. 4A). Se detectó una elevación significativa de EBER1, BARF1 y expresión LMP1 en los esferoides (todo el
P Hotel & lt; 0,05). No se observó ninguna diferencia significativa en la expresión de genes VEB BZLF1 lítica inmediatamente temprano entre los esferoides y células C666-1 parentales.
(A) por QRT-PCR, múltiples genes VEB (EBER, BARF1, LMP1, LMP2A, EBNA1 y BZLF1) se encontraron que se sobreexpresa en esferoides en comparación con las células C666-1 monocapa. número de copias de EBV en estas células se determinó por qPCR. (B) Los genes seleccionados del aberrantemente expresadas en esferoides fueron confirmados por qRT-PCR. Los genes regulados positivamente de manera significativa incluyen quimiocinas y receptores (CCR7, CCl4, CX3CL1 e IL-8), molécula de adhesión celular SELE, moléculas de señalización (GLI1, FOXN4) y los transportadores ABC (ABCC3, ABCC11). Se encontró CCR7 expresada en la superficie (C) de la célula que se expresa con frecuencia en las células de formación de esferas (& gt; 60%) por citometría de flujo. La subpoblación de células CCR7 + también se detectó en las líneas de la APN y tumores primarios (& lt; 5%). También se encontraron (D) CD44 + células CCR7 + para ser enriquecido en esferoides. Histogramas que denota la media ± SE (n≥3) con significación estadística calculada mediante la prueba t (*
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Los genes expresados diferencialmente en celulares esferoides y células monocapa C666-1 fueron identificados por el análisis de microarrays. se encontró que la expresión de 830 genes y 260 para mostrar el aumento de más de 5 veces y una disminución en las células de formación de esferas, respectivamente. Gene ontología análisis reveló que los 5 principales catálogos de funciones moleculares enriquecidos en los genes expresados diferencialmente incluyen: regulación de la transcripción, la respuesta inmune, la regulación de la apoptosis, la adhesión celular y el transporte transmembrana, cada uno con valores de p significativos (Tabla 2 y la Tabla S2). Una selección de genes expresados diferencialmente se enumeran en la Tabla 2. Por QRT-PCR, se validó la expresión de determinados genes implicados en el mantenimiento de propiedades de células madre en los esferoides y los padres C666-1 (Fig. 4B). De manera significativa el aumento de expresión (
P
& lt; 0,05) de las quimiocinas y los receptores (IL8, CCl4, CX3CL1, CCR7), de señalización relacionadas con los genes de la vía-(FOXN4 y Gli1), y moléculas de adhesión celular (SELE) se confirmaron en los esferoides (Fig. 4B). En particular, dos casetes de unión a ATP (ABC) transportador de genes (ABCC3 y ABCC11) son también altamente expresado en los esferoides (todos los
P Hotel & lt; 0,01). La sobreexpresión de estos genes podría ser responsable de la función de la APN quimioresistente células madre cancerosas (Fig. 4B).
La expresión de CCR7 en CD44 + células madre cancerosas de la APN
Entre los genes expresados diferencialmente, CCR7, un receptor de quimioquinas, mostró el cambio veces más alto de expresión en los esferoides de análisis de microarrays y por lo tanto fue seleccionado para una mayor investigación. Por citometría de flujo, se detectó un enriquecimiento significativo de las células CCR7 + esferoides en comparación con las células parentales (todos los
P Hotel & lt; 0,001, figura 4C.). También se detectó la expresión de CCR7 en 0,53 ± 0,14% y 2,87 ± 1,53% de las células en xenoinjertos de tumores primarios y respectivamente. Análisis de citometría de flujo multicolor reveló que la mayoría de las células CCR7 + se co-expresada con CD44. células CD44 + CCR7 + fueron enriquecidos en esferoides en comparación con los xenoinjertos y los tumores primarios (todos
P
& lt; 0,001, Fig 4D.). Esta fracción CSC candidato también fue detectado en líneas tumorales de la APN y los tumores primarios.
Desde CCR7 fue altamente expresado en células de formación de esferas de la APN y se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos en diversos cánceres humanos, que a continuación se determinó la asociación de CCR7 expresión con los parámetros clínicos en 39 casos primarios de la APN. los patrones de expresión de CCR7 representante en tumores primarios se muestran en la Figura 5. CCR7 expresión se correlaciona significativamente con la expresión de CD44 en estos casos (Fig. S4). Entre las muestras de la APN, 8 (20,5%) fueron negativos para la tinción CCR7. Débil, media y alta expresión de CCR7 se detectaron en 13, 7 y 11 casos primarios respectivamente. Es importante destacar que se encontró que la expresión de CCR7 en correlación con la presencia de enfermedad recurrente y la metástasis distante (Tabla 3). El hallazgo implica que las células que expresan CCR7 podrían contribuir a la progresión de la enfermedad.
representativos casos primarios NPC con alta (A), media (B), bajo (C) la expresión de CCR7. Se demostró (D) de la APN primaria con ausencia de expresión de CCR7. se detectó tinción CCR7 en pocos linfocitos infiltrantes, pero no en las células tumorales. Se muestran los tumores primarios con alta (E) y medio de expresión CD44 (F). En (G) y (H), se detectó la expresión de CD44 débil en las células tumorales, mientras que una fuerte tinción de CD44 en linfocitos infiltrantes se encuentra comúnmente.
Para investigar el papel de CCR7 en NPC CSC , se utilizó un anticuerpo de bloqueo de CCR7 de neutralizar su función en las células parentales, CD44 + y CD44- C666-1. Las células se trataron con 0 a 250 ng /ml de anticuerpo de bloqueo CCR7 durante 24 horas y la proliferación de las células se midieron mediante el ensayo de WST1. disminución observable en la proliferación celular se observó en la fracción de células CD44 + en comparación con CD44- y células C666-1 parentales. (Fig. 6A). Reducción de la capacidad de formación clon también se encuentra en las células C666-1 tratados con bloqueo de anticuerpos CCR7 (
P
& lt; 0,05, Fig 6B.). Es importante destacar que la capacidad de formación de esferas se inhibió significativamente después de CCR7 tratamiento de bloqueo de anticuerpos (
P
. & Lt; 0,001, figura 6C). Los resultados proporcionan evidencias de la implicación de CCR7 en el mantenimiento de la función CSC en la APN.
Para evaluar la función de CCR7 en células madre cancerosas, C666-1 fue tratado con el anticuerpo bloqueante CCR7 y su proliferación, clon de la droga y esfera- eficacia de formación se investigaron. (A) La proliferación de células CD44 + fue inhibida después del tratamiento con anticuerpo de bloqueo CCR7. (B) La eficiencia de la formación de clon de células C666-1 fue disminuida después de bloqueo CCR7 y (C) la capacidad de formación de esferoides se inihibited significativamente (
P
& lt; 0,001) en comparación con los controles no tratados. Histogramas que denota la media ± SE (n≥3) con significación estadística calculada mediante la prueba t (*
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Discusión
Este estudio proporciona la primera evidencia de la existencia de células madre cancerosas altamente tumorigénicas en NPC VEB positivo. Hemos desarrollado un protocolo para obtener células madre cancerosas NPC EBV positivo para la caracterización adicional. La formación de esferoides es una característica importante de funcionamiento de células madre cancerosas en los cánceres humanos [17]. En este estudio, hemos aislado con éxito una población potencial de CSC en la línea celular de la APN VEB positivo C666-1 través esferas tumorales cosecha. Las propiedades de células madre en la subpoblación C666-1 de formación de esferas obtenidas fueron confirmados mediante la demostración de la sobre regulación de los genes asociados a células madre múltiple y de alta tumorigenicidad en ratones nude [9], [18], [19]. A través de la caracterización completa de los esferoides de la APN, líneas tumorales y tumores primarios, hemos puesto de manifiesto que CD44 y Sox2 son posibles marcadores de CSC para la APN. marcadores de superficie celular son cruciales en la identificación de células madre cancerosas de entre las células tumorales heterogéneos. CD44 es un receptor de hialuronano y se ha demostrado ser marcador de células madre cancerosas en la cabeza y el carcinoma de células escamosas de cuello (HNSCC) [7]. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de CD44 fue enriquecida en células madre cancerosas APN. Como se evidencia de la significativamente mayor capacidad de formación de esferas de células CD44 + de la APN, se confirmó CSC subpoblación para ser enriquecido en esta fracción CD44 +. La resistencia de las células CD44 + para tratamiento con 5-FU está en concordancia con las propiedades propuestas CSC. Además de CD44, nuestro estudio también detectó el enriquecimiento de células que expresan SOX2 en los esferoides, el funcional NPC células madre cancerosas. Curiosamente, nivel similar de transcripciones SOX2 se encuentra tanto en las células de formación de esferas y C666-1 los padres. De acuerdo con nuestro hallazgo no publicado, el aumento de la expresión de la proteína SOX2 puede ser debido a la pérdida de los miRNAs SOX2-reprimir (miR-183 y miR-203) en los esferoides. Sox2 es un factor de transcripción que controla la pluripotencia de las células madre embrionarias y adultas específicas de los tejidos [20]. Regula células madre auto-renovación y diferenciación y se encuentra con frecuencia a ser de hasta reguladas en los cánceres humanos [21]. Zhang
et al
. (2010) ha sugerido que las células SOX2 + poseen propiedades stemness [12]. Ellos han demostrado que SOX2 se expresó y se co-localizada con Oct4 en NPC primaria. En concordancia con los hallazgos de Zhang, nuestros resultados revelaron que las células CD44 + SOX2 + se enriquecen en NPC células madre cancerosas.
El aislamiento de las células de formación de esferas en la línea de células NPC VEB positivo nos proporcionó una oportunidad para evaluar la expresión de EBV latente y los genes líticos en CSC. En particular, la expresión elevada de EBV productos génicos latente, EBER1, BARF1 y LMP1 se detectaron en la subpoblación CSC. Hemos demostrado anteriormente que la expresión de EBER confiere resistencia al estrés apoptosis [22]. La alta expresión de EBER en NPC células madre cancerosas sugiere que esta subpoblación de células tal vez más resistentes a la apoptosis. Por otro lado, LMP1 puede inducir EMT a través de la torcedura o caracol, que coincide con la adquisición de propiedades CSC [23], [24], [25]. Además, Kondo
et al
. también han demostrado recientemente que LMP1 induce CD44 + CSC en las células epiteliales nasofaríngeas [26]. Los resultados implican que la expresión de LMP1 puede jugar un papel crítico en el mantenimiento de CSC en esta malignidad asociada con el EBV.
Además de los genes latentes EBV, nuestro análisis de microarrays reveló una sobreexpresión de CCR7 en los esferoides derivadas de NPC. El enriquecimiento de CCR7 + población celular en las células de formación de esferas se confirmó mediante citometría de flujo. CCR7 es un receptor de quimioquinas que media la migración celular en respuesta a su ligando CCL21 [27]. Es probable que la expresión del receptor de alta CCR7 en las células de formación de esferas mejorará su sensibilidad a los ligandos y activar su señalización aguas abajo. CCR7 expresión aberrante en tumores malignos humanos se ha relacionado con la supervivencia celular y las vías metastásicas. La vía CCL21 /CCR7 puede jugar un papel crucial en la metástasis de CCR7 + células madre cancerosas a los ganglios linfáticos [28]. La sobreexpresión de CCR7 en células madre cancerosas es probable que contribuya a las frecuentes metástasis ganglionares cervicales en pacientes NPC [29]. La capacidad de formación de esferas abolida de las células NPC después de la neutralización CCR7 sugirió CCR7 también podría regular las propiedades de CSC en la APN.
La resistencia a fármacos es una característica importante de los CAC, que constituye la base de la recurrencia del tumor después de los tratamientos de quimioterapia [30 ]. El aumento de expresión de casete de unión a ATP-(ABC) transportador de la familia es responsable de la eflujo de fármacos terapéuticos y es un mecanismo común para el mantenimiento de la resistencia a fármacos en células madre cancerosas [31], [32]. Como se muestra en nuestro estudio de microarrays, se encontró que la sobreexpresión significativa de ABCC3 y ABCC11 en las células de formación de esferas. ABCC3 es un miembro de la subfamilia de proteínas resistencia a múltiples fármacos (MRP) y se demostró que era más expresada en carcinoma de ovario y la línea celular de cáncer de pulmón doxorrubicina resistentes a [33], [34]. ABCC3 sobreexpresión puede contribuir a las propiedades de resistencia a las drogas en las líneas de células C666-1 /doxorrubicina resistentes a cisplatino (Fig. S5). ABCC11 es otro miembro de la familia MRP hasta regulado en esferoides derivados de la APN. Es el principal transportador de 5-fluorouracilo (5-FU) [35], que es uno de los principales medicamentos quimioterapéuticos para NPC [3]. La sobreexpresión de la ABCC11 en las células de formación de esferas sugiere que la población de CSC en la APN es resistente a los fármacos quimioterapéuticos y por lo tanto contribuyen a la recurrencia del tumor.
vía de señalización Hedgehog es un importante regulador de CSC mantenimiento y función. En esferoides C666-1, el estudio de microarrays también se ha detectado el aumento de la expresión de GLI1, un importante activador de la transcripción de la vía de señalización hedgehog. En el carcinoma de ovario, GLI1 se informó para regular el crecimiento de las células madre cancerosas [36]. Para dilucidar el papel de GLI1 y vía hedgehog en células madre cancerosas de la APN, se examinaron los efectos de silenciamiento de la expresión GLI1 en la formación y las propiedades tumorigénicas de las células de formación de esferas. La elucidación de los mecanismos que regulan la proliferación y la apoptosis de las células madre cancerosas APN beneficiará a las terapias dirigidas en esta subpoblación de células resistentes a los medicamentos de señalización.
En conclusión, hemos identificado células madre cancerosas altamente tumorigénicas en NPC VEB positivo y esto podría ser subpoblación enriquecida por CD44 de la superficie celular e identificado junto con Sox2. Nuestro estudio ha descubierto varias moléculas cruciales incluyendo CCR7 y ABCC11 implicado en el mantenimiento de las funciones de la APN CSC. Los presentes hallazgos proporcionan una base para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a la APN CSC que puede potenciar la eficacia de los tratamientos actuales.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares, xenoinjertos de tumores primarios y
Una línea de VEB positivo NPC celular (C666-1) y 3 xenoinjertos (xeno-666, xeno-2117 y C17) fueron incluidos en este estudio [13], [14], [15]. Parental C666-1 se cultivó en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen). Para el cultivo de esfera tumor, las células se cultivaron en DMEM-F12 sin suero (Invitrogen) en placas de fijación ultra-bajas. Esferoides se disocian y se pasaron cada 6-8 días. Un total de 1 × 10
6 C666-1 células fueron sembradas por pocillo y el número de esferoides formados se contó.
cinco biopsias de tumores endoscópicos para el análisis de FACS se obtuvieron de pacientes NPC con consentimientos por escrito de la Departamento de Otorrinolaringología, hospital Príncipe de Gales, CUHK. Todos los casos fueron positivos para
EBER CD -
In situ
hibridación e histológicamente diagnosticados como NPC no diferenciado o pobremente diferenciados. También hemos contratado a 49 tumores incluidas en parafina fijadas con formalina de archivo primarias a partir del banco de tejidos del Departamento de Anatomía de & amp; Patología Celular, CUHK tinción inmunohistoquímica (IHC). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética Clínica de Investigación de la Universidad China de Hong Kong.
cuantitativa transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) Análisis
Un total de ARN se obtuvieron mediante los kit Qiagen RNeasy (Qiagen) y transcritas invertir en cDNA utilizando superíndices síntesis de cDNA kit (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo a continuación con cebadores específicos (Invitrogen, secuencias de cebadores que se enumeran en la Tabla S1) y la mezcla de alimentación SYBR® Green PCR (Applied Biosystems). expresión β-actina se utilizó para la normalización de datos. Todos los QRT-PCR se realizaron por triplicado en un sistema ABI 7500-PCR en tiempo real (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante.
celular activada por fluorescencia (FACS) Análisis
Una sola célula suspensiones obtenidas a partir de líneas celulares y tejidos tumorales se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS (10
5-10
6 células /100 l). Para la tinción intracelular, las células fueron fijadas en 70% de etanol durante 24 horas a -20 ° C antes de la rehidratación con PBS.