Extracto
CD44 es un gen del receptor de ácido hialurónico transmembrana que codifica más de 100 diferentes isoformas de proteínas específicas de tejido. El estándar CD44 más ubicuo, se ha utilizado como un marcador de células madre de cáncer en los cánceres de ovario y otros. La expresión de la variante CD44 epitelial que contiene los exones (v8-10 CD44v8-10) se ha asociado con tumores más chemoresistant y metastásicos en los cánceres gastrointestinales y de la mama, pero su papel en el cáncer de ovario es desconocida; por lo tanto, se investigó su uso como un marcador de pronóstico en esta enfermedad. Los perfiles de expresión génica de 254 muestras tumorales de cáncer El Atlas del Genoma RNAseqV2 se analizaron para determinar la presencia de isoformas de CD44. Se observó una tendencia a una mayor supervivencia en pacientes con alta expresión de isoformas de CD44 que incluyen exones v8-10. El análisis inmunohistoquímico (IHC) de los tumores para la presencia de CD44v8-10 se realizó en una cohorte independiente de 210 pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado utilizando un microarray de tejido tumoral. estratificación de los pacientes sobre la base de análisis de software de tinción reveló un aumento estadísticamente significativo de la supervivencia en pacientes con los niveles más altos de expresión de la proteína transmembrana (10 o 20%) en comparación con aquellos con la expresión más baja (inferior 10 y 20%) (p = 0,0181 , p = 0,0262 respectivamente). Expresión de CD44v8-10 en líneas celulares de cáncer de ovario primario se correlaciona con un fenotipo predominantemente epitelial caracterizado por una alta expresión de marcadores epiteliales y baja expresión de marcadores mesenquimales por qPCR, Western blot, y IHC. A la inversa, la detección de dominio extracelular proteolíticamente escindido y soluble de CD44v8-10 en muestras de ascitis de pacientes se correlaciona con pronóstico significativamente peor (p & lt; 0,05). Por lo tanto, la presencia de CD44v8-10 transmembrana en la superficie de células tumorales primarias puede ser un marcador de un tumor altamente epitelial con mejor pronóstico, mientras que la escisión enzimática de CD44v8-10, tal como se detecta por la presencia del dominio extracelular soluble en el líquido de ascitis, puede ser indicativo de una enfermedad metastásica más y peor pronóstico
Visto:. Sosulski a, Cuerno H, Zhang L, C Coletti, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 variante de empalme v8-10 como un marcador de pronóstico del cáncer ovárico seroso. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10.1371 /journal.pone.0156595
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN
Recibido: 28 Septiembre, 2015; Aceptado: 17-may de 2016; Publicado: June 2, 2016
Derechos de Autor © 2016 Sosulski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos se encuentran dentro del documento y sus archivos de información de apoyo o en la página web TCGA en http://cancergenome.nih.gov/
financiación:. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. él autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la causa más común de muerte entre las mujeres con cáncer ginecológico en todo el mundo, con la alta mortalidad atribuible a la etapa avanzada en la que se diagnostica, por lo general mucho después de haberse producido la diseminación metastásica intraperitoneal [1]. A fin de que la metástasis a ocurrir, las células de cáncer de ovario a menudo alteran la expresión de las proteínas implicadas en la interacción de la matriz extracelular, tales como CD44, para modular la invasión [2, 3]. Como una molécula de adhesión celular y un importante glicoproteína extracelular, el receptor CD44 ácido hialurónico ha sido implicada en la invasión tumoral y la metástasis en mama, pulmón, y cánceres gastrointestinales [2].
CD44 está codificada por un máximo de 20 exones, 10 de los cuales se conocen como exones variante. La isoforma estándar (CD44s) contiene sólo 10 exones, incluyendo los 5 primeros exones del extremo 5 'y los últimos 5 exones del extremo 3', por lo que carecen de los exones variantes en el medio, referido como V1-V10 o exones 5a -15 en la nomenclatura estándar [1, 4, 5]. CD44s es la isoforma más ubicuo, ampliamente expresado en la superficie de la mayoría de los tejidos y todas las células hematopoieitic en los que es responsable de homing de linfocitos y otra célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular. Un gran número de isoformas de empalme alternativos de CD44 existir que contienen una combinación de exones variantes (V1 a través de V10) insertado en la región extracelular juxtamembrane bajo el control de las proteínas reguladoras de empalme epitelial (ESRP) 1 y 2 [6]. Muchas variantes isoformas de CD44 tienen expresión específica de tejido; CD44v8-10 se expresa en los tejidos epiteliales y en carcinomas de tipo epitelial del páncreas, próstata, mama y pulmón [7], en el que se ha estudiado ampliamente como un marcador específico de las células malignas, con aumento de la expresión observada durante la carcinogénesis gástrica en un modelo murino y en el adenoma a carcinoma progresión en el cáncer humano de colon [8-10] y cáncer gástrico [11].
CD44s e isoformas variantes de CD44 han sido implicados en la resistencia a fármacos e identificado como marcadores de células madre [ ,,,0],12]. En el cáncer de ovario, los estudios usando la expresión de CD44s y sus isoformas variantes en resultados contradictorios pronóstico evaluación han producido, con algunos que muestra disminución de pronóstico, y otros mejorado el pronóstico, o ningún efecto [13]. Sin embargo, los estudios sobre las isoformas que contienen diferentes exones variante individual en el cáncer de ovario en general han sugerido mejora de la supervivencia global asociado a isoformas de empalme de CD44 [14]. La variante de empalme epitelial 8-10, expresando v8, v9 y v10 juntos, no se ha examinado en el cáncer de ovario seroso de alto grado; Por lo tanto, es la fiabilidad y viabilidad para predecir el pronóstico fue investigado en este estudio.
Materiales y Métodos
El Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) análisis de datos
Los datos de expresión (Nivel 3 ) en CD44s documentados e isoformas variantes de CD44 para tumores de ovario seroso cystadenocarcinoma se analizó en una cohorte de 255 sujetos en el TCGA (después de la censura de muestras de tumores recurrentes y centrarse sólo en la enfermedad de alto grado (G2 y G3)). Utilizamos datos del Nivel 3 para evitar la re-análisis de los conjuntos de datos en bruto; para más información, véase la publicación original [15]. Con base en el archivo de anotación para el análisis RNAseqV2 (S1 Tabla), definimos una isoforma de CD44 como v8-10 que contiene los exones chr11: 35,229652 millones a 35,229753 millones: +, chr11: 35231512 a 35231601: + y chr11: 35232793 hasta 35232996: +. El análisis de supervivencia de la parte superior e inferior al 10% en base a la media de expresión de los tres (v8-10) exones, se llevó a cabo utilizando la "supervivencia" y el paquete "survMisc" en R. En concreto, se utilizó el supremo (Rényi) versión de la prueba de log-rank, que está diseñado para el análisis de cruce de las curvas de supervivencia.
tumor de tejido los análisis de micromatrices
Una segunda cohorte de pacientes cystadenocarcinoma seroso de ovario 210 de alto grado hospitalizado en el Massachusetts hospital general y Brigham y el hospital Centro de cáncer Dana Farber de las mujeres entre 1993-2009 [16] se estudiaron bajo tarjeta de revisión interna (IRB) aprobó protocolos (MGH2007P00001918 o DFCI 02-051). Se obtuvieron muestras de núcleos de tumor (3 mm) en la cirugía de reducción de volumen inicial, se calificó de acuerdo con las directrices Federación Internacional de Ginecología Obstetricia (FIGO), y fueron fijados con formalina y embebidos en parafina. Todas las biopsias de tumores, descartan las muestras sin identificación ascitis, y la correspondiente información de los pacientes se recogieron bajo protocolos aprobados por el IRB después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Cada nuevo bloque de parafina contenía 24 núcleos tumorales distribuidas al azar, con al menos 2 núcleos por paciente, y se seccionaron a 7 micras de espesor como se describe anteriormente [17]. La inmunohistoquímica se realizó en portaobjetos con microarrays tumor secciones (TMA) tal como se publicó anteriormente [16] antes de ser bloqueado con una solución de 1% de albúmina de suero bovino (BSA) con suero de burro 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a la habitación temperatura, se incubaron con un anticuerpo para CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] en 1: 12.500 durante la noche en una cámara humidificada a 4ºC, se lavaron con PBS, y se incubaron con un secundario de cabra anti-rata peroxidasa de rábano (HRP) anticuerpo conjugado ( biotecnología Santa Cruz, Dallas TX) a 1: 200 durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las láminas fueron lavadas y teñidas con una solución de diaminobencidina (DAB), contador de teñido con hematoxilina (Dako, Carpinteria CA), deshidratados, y coverslipped antes de ser escaneada y digitalizada con un sondascopio (Leica, Buffalo Grove IL) y se analizaron con el software Aperio Imagescope (Leica, Buffalo Grove IL). La positividad y la intensidad (PI) resultados se calculan como el producto de la fracción manchada área (positividad) y su intensidad. Para el propósito del análisis de la tinción, se examinaron sólo los núcleos en la que más del 50% del tejido se mantuvo intacta en el portaobjetos de vidrio. Sobre la base de este criterio teníamos 6 pacientes en los que se calculó la puntuación de PI utilizando un solo núcleo, y 203 en el que tomó la puntuación media PI de 2 núcleos, para un total de 209 pacientes analizados. La supervivencia del paciente se calcula a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha de la muerte, o la entrada en cuidados paliativos cuando no está disponible y convertido desde días hasta meses dividiendo el número de días por 30. La supervivencia global fue analizada por parcelas de Kaplan-Meier y la significación estadística inferidas por log-rank pruebas. Las correlaciones con los parámetros clínicos se realizaron mediante análisis de Chi-cuadrado. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism 6 (GraphPad, La Jolla CA).
Líneas Celulares
Una serie de líneas celulares de cáncer de ovario primario fue derivado de ascitis de pacientes, según el protocolo del IRB-aprobada (# 2007P001918 /MGH) [16]. En pocas palabras, después de la centrifugación del fluido de ascitis, los sedimentos celulares se introdujeron en el cultivo de tejidos en dos condiciones diferentes (adherentes y esferoides). En cultivos adherentes, las células se mantuvieron a una confluencia completa para varias semanas a varios meses hasta que se observaron apretados clones de células epiteliales. La contaminación de tipos de células (leucocitos, mesotelial, y células de fibroblastos) se eliminaron por digestión con tripsina repetida parcial hasta no se pudieron observar los tipos de células contaminantes. Posteriormente, las células se pasaron al menos 5 veces a una dilución 01:10 para derivar la línea celular homogénea estable. Alternativamente, para los cultivos de esferoides (denotados por el sufijo-sph), las células se sembraron en matraces regulares para células de 24 horas y no adherentes se recogieron y se transfirieron a matraces nuevos ultra-bajo de unión, mientras que se descartaron las células unidas. culturas esferoides se pasaron por la disociación y se diluyeron 1:10 para al menos 5 pasajes para derivar líneas celulares homogéneas estables. El panel de líneas de células primarias se compone de 16 tipos de cáncer epitelial de ovario seroso (PTab, PTab-sph, PTAF, PTAF-sph, PTW, PTW-sph, PTAO, PTAO-sph, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL- sph, PTAM-SPH, Ptak-SPH), uno endometrioid cánceres epiteliales (PTAP-SPH), y uno cáncer de ovario epitelial mucinoso (PTG) cultivado en condiciones de cultivo adherentes y /o esferoide.
líneas de células primarias fueron mantenido en cultivo de células en monocapas en DMEM: medio F12 con 10% FFBS 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de L-glutamina (Corning, New York NY) o como esferas no adherentes en medios esfera tumor libre de suero [16] en 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2. líneas celulares Adicionalmente, cáncer de ovario establecidos OVCAR5 [18] y OVCAR8 [19], se mantuvieron en medio DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de L-glutamina (Corning, New York NY).
Q-PCR y análisis de componentes principales
PCR cuantitativa se realizó en líneas celulares primarios derivados de ascitis de los pacientes (PTab, PTab-sph, PTAF, PTAF-sph, PTW, PTW-SPH , PTAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, PTAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH) y en las líneas celulares de cáncer de ovario epitelial establecidos OVCAR-5 y OVCAR-8. Los sedimentos celulares se obtuvieron después de la centrifugación, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se congelaron a -80ºC, hasta la extracción de ARN usando un kit de Qiagen RNeasy Mini (Germantown, MD) y se cuantificaron por Nanodrop. ADNc se sometió a transcripción inversa utilizando 500 ng de RNA por muestra con Superíndice III En primer capítulo de síntesis Super Mix (Invitrogen, Carlsbad CA), y qPCR se realizó para los fabricantes establecidos de transformación epitelial a mesenquimal (EMT), y pluripotencia incluyendo CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], vimentina, e-cadherina, ESRP1, ZEB1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-cadherina, y EpCAM, con GAPDH como patrón interno. expresión relativa se infiere por la determinación de ciclo umbral (Ct) y calcula utilizando 2 ^ transformación -ΔCt normalizado a GAPDH Ct. Análisis de componentes principales (PCA) se realizó usando estos valores de expresión génica después de la transformación log utilizando el paquete de "FactoMineR" en R. PCA con mesenquimales, así como marcadores epiteliales claramente separados en el primer componente, mientras que EMT y pluripotentes marcadores fueron perpendicular en la segunda componente, pero indistinguibles unos de otros.
Análisis Western
Los sedimentos celulares cosechados a partir de un panel de líneas celulares de pacientes primarios (ascitis PTab, PTab-sph, PTAF, PTAF-sph, PTW, PTW -sph, PTAO, PTAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, PTAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH, Ptak-SPH) y 2 líneas celulares de cáncer establecidas (OVCAR-5 y OVCAR-8) se lavaron dos veces con 10 ml de hielo frío PBS y extractos de células enteras preparadas en tampón de lisis 1x (Cell Signaling Technology, Danvers MA) en agua estéril que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Indianapolis, IN) y comprimidos de inhibidor de fosfatasa (Roche, Indianapolis IN). Se obtuvo proteína total por lisado utilizando un ensayo de ácido bicinconínico Pierce (BCA) kit de cuantificación de proteína (Thermoscientific, Rockford IL), y cantidades iguales de proteínas (15ug) reducidos, cargado en cada carril, y separadas por NuPAGE 4-12% geles ( Life Technologies, Carlsbad CA). Las proteínas se transfirieron a Immobilon difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica MA), bloqueado en la leche no grasa 5% disuelta en solución salina tris-tamponada y solución de Tween 20 (TBST), y después se incubaron durante la noche a 4ºC para detectar completa longitud transmembrana o intracelular de proteínas con la rata primaria de anticuerpos contra CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) [8], o el ratón anti-CD44s (I + D, Minneapolis MN) (1: 500), de conejo anti vimentina (Abcam, Cambridge MA) (1: 1.000) o conejo anti-E-cadherina (Abcam, Cambridge MA) (1: 10.000) anticuerpos, cada uno diluido en 5% de leche sin grasa en TBST. a continuación, las membranas de PVDF se lavaron con TBST y se incubaron con un anticuerpo secundario apropiado, ya sea un (tecnología de Señalización Celular, Danvers MA) de conejo anti, anti ratón (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA), o anti rata (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) anticuerpo conjugado con un indicador de peroxidasa de rábano picante, cada uno a 1: 10.000 en 5% de leche en disolución TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron de nuevo en TBST y se trataron con sustrato de quimioluminiscencia ECL Pico ™ para la visualización de proteínas (Thermoscientific, Rockford IL). la abundancia relativa de proteínas se midió mediante densitometría de las bandas de Western blot y normalizado para la igualdad de la carga de proteínas usando la densidad B-actina por análisis de software J Imagen.
ascitis de pacientes se obtuvieron de paracentesis terapéuticas frescas, por un protocolo aprobado por el IRB (# 2007P001918 /MGH). 1 ml de ascitis se sometieron a ultrasonidos las muestras de sobrenadante de fluido, se centrifugaron a velocidad máxima durante 10 min para limpiar, y se diluyeron 1:50 en tampón de lisis antes de que se ejecuta en una transferencia de Western como se describe anteriormente. Las membranas se incubaron con rata anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) o de ratón anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500) durante la noche a 4ºC y desarrollados como anteriormente usando sustrato de quimioluminiscencia ECL ™ femto (Thermoscientific, Rockford IL) para determinar la presencia de dominio extracelular escindido y secretada soluble de CD44v8-10 y CD44s arrojar en el líquido ascítico de pacientes. Como control de carga se utilizó IgG anti-humana de cadena pesada y ligera de rábano picante conjugada con peroxidasa, 1: 20.000 (Life Technologies, Carlsbad CA). Las imágenes fueron capturadas por BioRad XR Gel Doc software imagen laboratorio (BioRad, Hercules CA) y se analizaron por Image-J como un porcentaje de IgG abundancia cadena ligera. luego arrojar nivel de proteínas se correlacionó con la supervivencia del paciente, con puntos finales siendo la fecha de la muerte, o la entrada en cuidados paliativos cuando no está disponible.
La inmunohistoquímica de marcadores epiteliales y mesenquimales en pDXA explantados tumores
en el Paciente xenoinjertos derivados de ascitis (pDXA) si se establece mediante la implantación de 5 millones de células de líneas primarias de bajo paso (PTAP-SPH, PTW, PTAM-SPH, PTH, PTab-SPH, PTD) volvió a suspender 1: 1 en Matrigel (Corning, Nueva York NY ) y se implantaron subcutáneamente en los flancos de ratones NOD /SCID /IL2RGamma Jax ™ (Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) en virtud de un protocolo experimental aprobado por el IACUC (# 2009N000033) [16]. OVCAR5 tumores se obtuvieron utilizando un protocolo idéntico utilizando xenoinjertos 1 millón de células. Los tumores resultantes se fijaron en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina y se seccionaron a 7 micrómetros de espesor en Fisher Scientific
Sonda On Plus portaobjetos de microscopio
(Fisher Scientific, Nueva York NY). Las láminas fueron deparaffinized en xileno, se rehidrataron en alcohol, y calentados en citrato de sodio tamponada (0,01 M) para la recuperación de antígenos durante 5 minutos a alta potencia, 10 minutos a una potencia del 10%, y 10 minutos a una potencia del 20%, luego se enjuaga en agua destilada . Los portaobjetos se trató con peróxido de hidrógeno al 3%, se lavó, y se bloqueó con una solución de 1% de BSA con suero de 2% de ternera fetal (FCS) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, después se incubaron con anticuerpo CD44v8-10 (RV3 monoclonal de rata) (1: 12.500), y en comparación con las incubadas con CD44s (I + D, Minneapolis MN, 16ug monoclonal de ratón /ml), anticuerpo anti e-cadherina (Abcam, Cambridge MA, conejo) (1: 500), o anti vimentina anticuerpos (Abcam, Cambridge MA, conejo) (1: 500) durante la noche en una cámara húmeda a 4ºC. Después de incubar con un anticuerpo HRP de cabra anti-rata (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), HRP de burro anti-ratón o anticuerpo HRP anti-conejo de burro (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) durante 1,5 horas a la habitación la temperatura, los portaobjetos se lavaron y se tiñeron con una solución de DAB (Sigma Aldrich, St Louis MO), y el contador de teñido con hematoxilina (Dako, Carpinteria CA), deshidratados, y se cubrieron. micrografías representativas se obtuvieron para la comparación espacial de las proteínas previamente detectados por análisis de Western de las líneas celulares primarios de los que se hayan cultivado los tumores.
Resultados
Expresión de las isoformas variantes de CD44 que contenían el exón 8 a 10 ( V8-10) mRNA en el Atlas del Genoma del cáncer (TCGA) RNAseqV2 ovario conjunto de datos cáncer
Para determinar los niveles de expresión de ARNm de CD44s y su variante V8-10 isoformas que contienen (figura 1A) en tumores ováricos serosos, analizamos el recurso de RNAseqV2 TCGA, que incluye una cohorte de 255 muestras de tumor de grado 2 y 3. La expresión de los exones individuales V8, V9, V10 y se correlaciona fuertemente en todas las muestras, que también pueden ser observados por los exones "estándar" 1-5 y 15-18 (S1 figura), lo que sugiere que se expresan predominantemente como un bloque de V8 -10. Por otra parte, los exones V8-10 parece ser el más abundante de todos los exones variables, lo que sugiere que contienen cd44v8-10 isoformas predominantes son las transcripciones empalmados alternativamente de CD44 (Figura 1B). Los pacientes fueron estratificados basan en medios niveles de expresión de ARNm de exones V8-10 en su tumor y se dividieron en grupos de alto y bajo que expresa (superior e inferior 10%), de los cuales y las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se generaron indica un pronóstico significativamente mejor en la escuela expresadores (p = 0,035) (Fig 1C). Para determinar la contribución relativa de cada isoforma distinta que contiene los exones v8-10 comparamos su expresión en general y una estimación de la influencia sobre la supervivencia. Se observó una tendencia hacia una mayor supervivencia para todos menos uno isoformas de CD44 que contienen V8-10, aunque ninguno fue significativo en el aislamiento (S2 figura). El análisis multivariante utilizando el modelo proporcional de Cox razón de riesgo encontrado que sólo la edad tuvo un impacto significativo sobre la supervivencia global (Tabla 1).
A) Representación esquemática de las isoformas de empalme alternativo que expresan exones variables V8-V10. B) La distribución de los datos de expresión RNAseq2 más de 254 muestras de todos los exones CD44 en el conjunto de datos de cáncer de ovario TCGA. Las muestras con ninguna expresión fueron omitidos de esta figura. C) gráfico de Kaplan-Meier de la curva de supervivencia comparando CD44v8-10 alta y baja expresión de muestras y tabla correspondiente con el número de pacientes en cada punto de tiempo dado. Definimos el conjunto expresando alta (rojo) y la baja expresión de conjunto (negro) que las muestras con la expresión más alta y más baja, respectivamente, usando la parte superior /inferior al 10% de expresadores, con la trama que se extiende a 5 años. Las barras representan puntos de datos censurados.
CD44v8-10 tinción en los tumores primarios se asocia con una mayor supervivencia en una cohorte independiente de pacientes con cáncer de ovario seroso 210 de alto grado analizados por microarray tumor inmunohistoquímica
para confirmar las tendencias observadas en el análisis de los datos del TCGA que sugiere un mejor pronóstico fue asociado con la expresión CD44v8-10, hemos decidido examinar los niveles de proteína de CD44v8-10 en biopsias de tumores. La expresión en superficie de la proteína transmembrana CD44v8-10 se analizó en el carcinoma de ovario seroso de alto grado mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico CD44v8-10 en una micromatriz de tumor que contiene muestras de tumores primarios de una cohorte de 210 pacientes. Todos los tumores fueron de histología serosa de alto grado con la gran mayoría (71%) se calificó como al menos FIGO Etapa III y Grado 3 (89%) al momento del diagnóstico (tabla 2). Todas las muestras de microarrays de tumores primarios examinados fueron tomadas en el momento de la cirugía de reducción de volumen inicial. tinción difusa y focal se observó en el epitelio columnar de las papilas, a menudo en la capa basal (flechas) (Fig 2A, 2B y 2C) del epitelio, pero no en el estroma tumoral en cualquiera de los núcleos (Fig 2D), y siempre en la superficie celular en lugar de una ubicación intracelular o citoplásmica (Fig 2B, inserto). La intensidad total de píxeles positivos y el número total de píxeles positivos, como se determina por el software Imagescope, se combinaron en una puntuación de intensidad positiva (PI), que fue un promedio a través de los dos núcleos representativos por paciente, y se utiliza para la estratificación del paciente. Elegimos la parte superior e inferior 10 y 20 por ciento de los pacientes para comparar las diferencias de supervivencia entre expresadores bajas y altas de proteína de la superficie CD44v8-10 transmembrana, y encontramos un aumento significativo de la supervivencia, tanto para la parte superior del 10% y el 20% de los pacientes que expresan altos niveles de CD44v8-10, con una supervivencia media de 30 y 29 meses en comparación con los pacientes que expresan el 10% más baja (p = 0,0181) y 20% (p = 0,0262), con una supervivencia media de 49 y 52 meses, respectivamente (Fig 2E) . La composición de la parte superior e inferior 10% y el 20% de los pacientes fue similar al examinar parámetros clínicos de grado FIGO, etapa, y la edad (S2 Tabla), con la excepción de una diferencia en el pequeño número de grado 2 pacientes. Cuando esta población de grado 2 se excluyó del análisis para descartar la influencia de estos tumores raros de grado inferior, la diferencia en la supervivencia se mantuvo significativa entre los expresadores altos y más bajos de la proteína CD44v8-10 (Fig S3)
.
fijos incluidos en parafina núcleos de microarrays de tejidos se tiñeron por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo contra CD44v9, digitalizadas mediante un sondascopio Aperio, y analizados mediante el software Aperio Imagescope algoritmo de número de píxeles positivo. Imágenes representativas tomadas a alta (40x) muestran el poder de tinción del epitelio basal en A y C, la tinción del epitelio superficial más difusa en b, y el estroma negativa con las células epiteliales positivas aisladas en d. e.) la supervivencia global de los pacientes con alto grado de carcinoma de ovario seroso por la expresión variante de CD44. Izquierda variante de la expresión 10% más alta y la más baja y la más alta y la más baja botón secundario del 20% de la expresión de la variante, demuestra la supervivencia global significativa en los más altos expresadores con p = 0,0181 yp = 0,0262, respectivamente.
se analizaron
el análisis multivariante de los parámetros clínicos registrados como la edad, grado, estadio, estado de reducción de volumen, y la intensidad de la tinción CD44v8-10 por su efecto sobre el pronóstico (Tabla 3).
la edad tuvo el más fuerte influencia en el pronóstico seguido de CD44v9 intensidad de la tinción del tumor, mientras que la estadificación FIGO o de clasificación y de reducción de volumen de estado no fueron significativas. Dado que la razón de riesgo proporcional de Cox (tabla 3) mostró una dependencia de la edad y la expresión de marcadores de superficie CD44v8-10, queríamos explorar la correlación variable usando una estratificación imparcial paciente para generar un árbol de decisión que maximiza las diferencias de pronóstico (figura 3). Se estratificaron los grupos de pacientes en base a la edad, estadio FIGO, Clasificación, estado de reducción de volumen y expresión CD44v8-10. La clasificación resultante mostró que los pacientes de & gt; 59,2 años de edad no se benefician significativamente de mayor expresión de CD44. Los pacientes más jóvenes muestran una fuerte correlación de una mejor supervivencia cuando se tiene una elevada marcador de superficie CD44. Estas observaciones refinar los resultados del modelo de relación de riesgo de Cox y definen un árbol de decisión que podría ser utilizado clínicamente para maximizar el poder pronóstico de la tinción del tumor CD44v8-10 (figura 3).
Los pacientes de la matriz tumoral SampleSet fueron estratificados utilizando la edad, intensidad de la tinción CD44v9 (σ de expresión CD44v9), grado, estado de reducción de volumen, y la puntuación de la FIGO. Se realizó un análisis multivariante y efecto sized clasificó para generar un árbol de decisión binaria para maximizar el poder pronóstico de una manera imparcial y asignar significación estadística. Sólo las variables estadísticamente significativas (edad y tinción CD44v9) se muestran junto con su efecto sobre la supervivencia global de pacientes en parcelas de Kaplan-Meier. Las barras representan puntos de datos censurados.
Expresión de CD44v8-10 se correlaciona con un fenotipo epitelial
Se realizó el análisis de componente principal (PCA) (FactoMiner) sobre la expresión del ARNm, tal como se define por qPCR valores de 2
-ΔCt normalizaron a GAPDH, en una serie de diferentes epitelial (EPCAM, ESPR1, e-cadherina) y mesenquimales (ZEB1, vimentina, N-cadherina) marcadores en un panel de 15 principal (PTab, ptAB- sph, líneas celulares de cáncer de ovario PTAF, PTAF-SPH, PTW, PTW-SPH, PTAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, PTAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH) y 2 establecidas (OVCAR5, OVCAR8). El PCA confirmó que CD44v8-10 mRNA expresión se asocia con otros marcadores epiteliales, mientras que CD44s expresión se correlaciona con marcadores mesenquimales en el cáncer de ovario (Figura 4A). La expresión de marcadores de pluripotencia (Lin28, SOX2, Oct4) se asoció con ninguno, ni marcadores epiteliales mesenquimales, lo que sugiere stemness es independiente de epitelial o mesenquimal de estado (Figura 4A).
A) Análisis de Componentes Principales mediante qPCR cuantificación relativa de la expresión de epiteliales, mesenquimales, y los marcadores de pluripotencia en líneas celulares de cáncer de ovario primario. pulsadores de colores que indican las instrucciones para cada grupo de marcadores. B) Análisis de Western de lisados de proteína línea de células primarias para la expresión de la proteína CD44v8-10 utilizando un anticuerpo monoclonal de rata a CD44v8-10 humano.
Del mismo modo, la expresión de la proteína en la célula CD44v8-10 derivado del paciente línea lisados por Western blot muestran una tendencia a la co-expresión de CD44v8-10 con e-cadherina, o CD44s con vimentina, de una manera mutuamente excluyente (Fig 4B), confirmando los datos de qPCR que indica que CD44v8-10 es un marcador epitelial y CD44s un marcador mesenquimal en el cáncer de ovario seroso de alto grado.
para determinar la expresión espacial de CD44v8-10, y su relación con las epiteliales o tumorales mesenquimales histologías, xenoinjertos de ascitis derivadas del paciente (de pDXA) [16] se analizaron por inmunohistoquímica (IHC). En general, los tumores crecen
in vivo
recapitula el epitelial o mesenquimal heterogeneidad observada en la línea celular primaria
in vitro gratis (figura 4). Los tumores con un fenotipo altamente epitelial expresan bajos niveles de vimentina, que se limita a las células del estroma (PTW, OVCAR5) y altos niveles de expresión CD44v8-10, que era específica a la superficie celular de las células cancerosas del tumor (Fig 5A, insertar). Por el contrario, los más tumores mesenquimales (PTH, esferas PTAM, y esferas PTab) expresado vimentina tanto en las células de cáncer epitelial, así como las células del estroma del tumor, y tenía muy baja expresión de CD44v8-10 (Fig 5B). Los tumores del fenotipo intermedio con ambas características epiteliales y mesenquimales tenían expresión de CD44v8-10 y vimentina en las células epiteliales, así como el estroma (Fig 5C).
tinción de anticuerpos de secciones de tejido de los tumores desarrollados in vivo después de la inyección de 1 a 5 millones de células de cáncer de ovario derivados del paciente primarios. secciones representativas de tumores derivados de OVCAR5, PTAP-SPH, Pt W (A), PTAM-SPH, se muestran PTH, PTab-SPH (B) y PTD (C). CD44v8-10, y vimentina tinción inmunohistoquímica se muestra con contratinción de hematoxilina al aumento de 100x. CD44v8-10 etiquetas de la superficie de las células de cáncer epitelial (Insert), mientras que las etiquetas de vimentina células del estroma en los tumores epiteliales y más en la mayoría de las células mesenquimales más tumores (Insert). Los tumores se agrupan en epitelial (A), mesenquimales (B) o fenotipo mixto (C) en base a la tinción.
Soluble CD44v8-10 es detectable en el sobrenadante de las muestras de ascitis y se correlacionan con un peor pronóstico
Se evaluó el potencial de detectar el dominio extracelular soluble de CD44v8-10 como un fragmento escindido en ascitis sobrenadante líquido mediante Western blot de 28 diferentes muestras de ascitis de pacientes. Soluble escinde CD44s se expresa de forma homogénea en todas las muestras de ascitis, incluyendo controles benignos, lo que sugiere que es una proteína de la sangre en todas partes. Curiosamente, el dominio extracelular soluble escindida y cobertizo de CD44v8-10 se detectó en 27 de 28 muestras de ovario ascitis de pacientes, con niveles muy variables, pero no era detectable en la ascitis hepáticos benignos, lo que sugiere que puede ser cáncer-específica. Una transferencia de Western representativa de 6 ascitis paciente se demuestra en la Figura 6A. La abundancia de proteínas del dominio extracelular soluble de CD44v8-10 se midió por densitometría de las bandas de transferencia de Western y se normalizó para la igualdad de la carga de proteínas usando la densidad de la cadena ligera de IgG por análisis de imágenes de software J. Después de la estratificación de los pacientes en función de los niveles de CD44v8-10, hemos observado una significativa disminución de la supervivencia en los pacientes con altos niveles de CD44v8-10 soluble (50% superior) con una supervivencia media de 39 meses frente a 59,27 meses para la parte inferior del 50% (p . = 0,0481) (figura 6B)
a) ascitis muestras (N = 28; 6 muestras mostradas como representante) se obtuvieron de los pacientes sometidos a paracentesis terapéutica, y probaron por el Western Blot para CD44v8-10, CD44s, y cadena humana contra la luz IgG como control de carga. densitometría de proteínas se realizó y se analizaron muestras para los niveles de expresión de CD44v8-10 soluble y se separa en dos grupos iguales de niveles altos y bajos CD44v8-10.