Extracto
CDA-2 (celda agente de diferenciación 2), una preparación urinaria, tiene anti-proliferativa y potentes propiedades pro-apoptóticos en las células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos de acción inhibidora del tumor de CDA-2 están lejos de ser clara, y sobre todo no se informó sobre el cáncer de pulmón. Aquí demostramos que CDA-2 y su principal componente fenilacetilglutamina (PG) reducen el crecimiento del tumor de pulmón metastásico, y aumenta el tiempo de supervivencia después de la inoculación con células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) de una manera dependiente de la dosis en ratones C57BL6. análisis de programas proliferativa en células de cáncer reveló un impacto fundamental de CDA-2 y PG sobre la proliferación y la apoptosis, incluyendo ensayos de TUNEL Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, survivina, PCNA, Ki-67 y proteínas. CDA-2 y PG redujeron significativamente la actividad de NF-kB de unión a ADN en células de cáncer de pulmón y en los macrófagos alveolares de ratones portadores de tumores y, especialmente, disminuyó la liberación de factores inflamatorios, incluyendo TNF, IL-6, y KC. Por otra parte, CDA-2 y PG disminuyen la expresión de TLR2, TLR6, y CD14, pero no TLR1, TLR3, TLR4 y TLR9 en los macrófagos de médula ósea derivados (BMDM) de ratones estimulados por medio LLC acondicionado (LLC-CM ). Sobre-expresión de TLR2 en BMDM prevenirse CDA-2 y PG de inhibir la activación de NF-kappa B, así como la inducción de TNF y IL-6. TLR2: TLR6 complejos median el efecto de NF-kB inactivación por CDA-2. En conclusión, CDA-2 inhibe de forma potente el desarrollo de tumores de pulmón por la reducción de la inflamación en el pulmón a través de supresión de la activación de NF-kB en las células mieloides, asociando con la modulación de la señalización de TLR2
Visto:. Wang X, Jiang CM, wan HY, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et al. (2012) CDA-2, una preparación urinaria, inhibe el desarrollo del cáncer de pulmón a través de la represión de NF-kappaB activación de las células mieloides. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10.1371 /journal.pone.0052117
Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: Abril 26, 2012; Aceptado: 9 de noviembre de 2012; Publicado: 17 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Putuo (PTKW09-B02). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo, causando más de un millón de muertes en todo el mundo [1]. A pesar de los avances en la detección temprana y el tratamiento estándar, el cáncer de pulmón a menudo se diagnostica en una etapa avanzada y tiene un mal pronóstico. Por lo tanto, la prevención y el tratamiento de cáncer de pulmón son el foco de la investigación actual intensivo [2].
CDA-2 (agente de diferenciación celular 2) es una preparación urinario que aislada de la orina humana saludable en China. Es una droga multifuncional novedoso que es útil para la prevención y el tratamiento de varios tumores, incluyendo la leucemia, cáncer de mama, cáncer de hígado, y feocromocitoma, en investigaciones preclínicas [3] - [5]. Sin embargo, los mecanismos de acción inhibidora del tumor de CDA-2 están lejos de ser clara, y sobre todo no se informó sobre el cáncer de pulmón. CDA-2 contiene varios componentes activos, incluyendo fenilacetilglutamina (PG) (41%), glicocola de benzoilo (35%), péptidos (MW 400 a 2.800) (17%), ácido 4-OH-fenilacético (6%), y 5 ácido -OH-indolacético (1%), que con diferentes mecanismos de contra el cáncer [5]. Aunque la inhibición del tumor se puede atribuir a estos componentes, PG es probable que sea un importante componente inhibidor del tumor [3]. Fase I /II /III de ensayos clínicos de CDA-2 se han completado en China en 2003. En agosto de 2004, la Administración Estatal de Medicamentos (SDA) de China aprobó el uso de CDA-2 como un medicamento contra el cáncer en los tumores sólidos. Aunque se sugirió CDA-2 para contribuir a la inhibición del tumor a través de la regulación de peroxisoma receptor-γ activado por el proliferador (PPAR-γ) y la represión de PI3 /Akt en células tumorales de señalización, el efecto inhibidor de tumores de CDA-2 fue hasta ahora demostrado principalmente en las células de cáncer y su acción en los microambientes del tumor, especialmente a las células inmunes /inflamatorias en el estroma tumoral, no ha sido evaluado críticamente [6], [7].
NF-kappa B es una clave coordinador de la respuesta inflamatoria e inmune y se ha encontrado recientemente que desempeñar un papel fundamental en la carcinogénesis de un número de tipos de cáncer incluyendo cáncer de pulmón o carcinoma de colon [8], [9]. Es de destacar que las citocinas y quimiocinas proinflamatorias se han relacionado con los procesos cancerígenos en seres humanos y ratones, y están regulados por la vía de NF-kB. Por ejemplo, NF-KB-impulsado la producción de citocinas por las células mieloides (por ejemplo, macrófagos, células dendríticas maduras, y neutrófilos), como se requiere de TNF-α e IL-6 para el crecimiento del tumor de pulmón [9]. En un modelo de ratón de cáncer asociado con la colitis (CAC), IKKβ se ha eliminado en las células mieloides (que conduce a una disminución de la actividad de NF-kB), el tamaño del tumor fue considerablemente menor en comparación con los controles y la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, como TNF, IL -6, y la IL-1, también se redujo notablemente [10]. Así, en las células mieloides, la activación de NF-kB promueve el crecimiento del tumor. Este efecto se debe principalmente a proliferación de células tumorales mejorada a través de la producción de TNFa, IL-6, y otras citoquinas que son regulados por la vía de NF-kB en las células mieloides [10], [11].
Aquí , nos informan de nuestro trabajo reciente relativo a la supresión de tumores y los mecanismos moleculares de la CDA-2 y su componente principal, PG, el cáncer de pulmón. Se utilizaron modelos experimentales de cáncer de pulmón murino en el que CDA-2 y PG reduce el crecimiento del tumor de pulmón, y ha demostrado que la inactivación de NF-kB en las células mieloides es responsable de la regresión tumoral inducida por el CDA-2. Se encontró que la inhibición de la señalización de TLR-2 es un mecanismo clave de la inducida por CDA-2 inactivación NF-kB. Nuestros resultados sugieren una nueva teoría para la terapia del cáncer por CDA-2, basado en la inhibición de NF-kB en las células mieloides de microambientes tumorales.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
células el carcinoma de pulmón de Lewis de ratón (LLC) se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, laboratorios Hyclone. Inc, South, Utah, EE.UU.) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina y 100 U /ml de estreptomicina (Hyclone laboratorios. Inc, Sur, Utah, EE.UU.). Los cultivos celulares se realizaron a 37 ° C en el aire humidificado con un 5% de CO
2.
Animales
hembra C57BL /6 ratones se obtuvieron del Laboratorio Nacional de Recursos de roedores Animal (Shanghai rama , República Popular China) y se mantuvo bajo una Animalario central libre de patógenos, de la Universidad de Tongji. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de las Guías para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Tongji en el uso y cuidado de los animales.
Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Generación modelo de pulmón cáncer en ratones y Tratamiento del CDA-2 y PG
Un modelo de metástasis de cáncer de pulmón en ratones C57BL /6 se ha generado por la inyección intravenosa de células LLC. Brevemente, subconfluent células LLC o células A549 se recogieron y se pasaron a través de un filtro de 40 micras de células (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.), se lavaron tres veces con PBS, se resuspendieron en DMEM libre de suero y se inyectaron a una concentración de 2 × 10
5 células LLC por ratón en la vena de la cola. After14 días, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (ip) con 500 mg /kg, 1,000 mg /kg, y 2000 mg /kg CDA-2 (amablemente suministrada por Ever vida Pharmaceutical Co. Ltd. Hefei, Anhui, China) o 200 mg /kg, 400 mg /kg y 800 mg /kg PG (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) en PBS o PBS solo una vez al día durante 10 días.
Evaluación de los tumores pulmonares
en designada puntos de tiempo, los ratones fueron sacrificados y se retiraron sus pulmones, se pesaron y se examinaron histológicamente. Algunos ratones se mantuvieron hasta que se obtuvieron los datos de muerte y supervivencia. nódulos tumorales de pulmón se microdissected usando una aguja de 18 G bajo un microscopio para el análisis de proteínas. multiplicidad tumoral y tamaños máximos fueron determinar como se describe [9]. En resumen, los pulmones enteros portadores de tumores se inflaron de forma manual con y se fijaron en 4% de paraformaldehído y embebidos. pulmones incluidos en parafina se seccionaron en serie a 350 micras y un examen histológico con hematoxilina y eosina (H & amp; E).
Los análisis inmunohistoquímicos
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [12]. Mouse anti-Ki-67 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) se utilizó como anticuerpo primario. incubación del anticuerpo secundario y la tinción se realizaron utilizando el kit enVision® + Sistema-HRP (AEC) (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para el ensayo de TUNEL, un Sistema de DeadEnd ™ colorimétrico TUNEL (Promega) se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se midió el número de Ki-67 o TUNEL-positivas las células tumorales y las células totales número de tumores en seis campos microscópicos de tumores seleccionados al azar y, a continuación el valor medio se calculó como el porcentaje de células tumorales TUNEL-positivas Ki-67 o
Western Blotting
nódulos tumorales de pulmón se microdissected cuidadosamente usando una aguja de los pulmones 18 G con un microscopio. Para el aislamiento de proteína total, 10 mg nódulo tumoral se homogeneizaron en el tampón de 500 l de lisis celular (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) que contiene mM PMSF 5 e inhibidores de proteasa utilizando homogeneizador rotor-estator. Se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [13]. Brevemente, los extractos de proteínas totales fueron cargados en un 10% en geles de SDS-poliacrilamida, sometidos a electroforesis y se transfirieron a Hybond-C membranas extra (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Los anticuerpos primarios fueron: ratón anti-Bcl-XL, de ratón anti-Bcl-2 (ambos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); ratón anti-PCNA, conejo anti-cIAP1, conejo anti-survivina (los tres de Abcam, Cambridge, Reino Unido); ratón anti-β-actina (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). HRP-conjugado de cabra anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology) o conejo anti-ratón se utilizó como anticuerpo secundario (Dako, Glostrup, Dinamarca).
lavado broncoalveolar (BALF) el recuento de leucocitos y aislamiento de los macrófagos alveolares
BALF se determinó como se describe anteriormente [14]. Los porcentajes de subpoblaciones de leucocitos se determinaron contando 100 leucocitos en una parte seleccionada al azar de la corredera cytospin. El número total de leucocitos en BALF se determinó utilizando un hemocitómetro (Beckman Coulter, Miami, FL, EE.UU.). Los macrófagos alveolares se aislaron de la EMSA como se describe anteriormente [15]. Brevemente, el BALF fue semilla en DMEM y se mantiene en el plato de cultivo celular. Las células se incubaron a 37 ° C en aire humidificado con 5% de CO2 durante 1 hora. El plato luego se lavó 3 veces con PBS, y las células adherentes, predominantemente macrófagos, se recogieron para el extracto de proteína nuclear.
movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA)
proteínas nucleares se aislaron de pulmón tumores y macrófagos alveolares utilizando Extracto Kit Nuclear (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la actividad de unión a ADN de NF-kB se midió por la EMSA como se describe [13]. Brevemente, las proteínas nucleares se incubaron con [
32P] marcado con sonda consenso de doble cadena NF-kappa B (Promega) a temperatura ambiente durante 30 min. los complejos ADN-proteína se resolvieron en geles de poliacrilamida al 4%, equilibrada en 0,5 × TBE bajo 300V. Los geles se secaron y se expusieron a Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience) a -80 ° C y se desarrollaron usando una película Kodak (Eastman Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
Las citoquinas Ensayo ELISA
BALF muestras se prepararon como se ha descrito anteriormente. TNFa, IL-6, y KC se midieron mediante comercialmente disponible ELISA tipo sandwich (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), siguiendo las manufacturas 'instrucciones
derivadas de médula de ratón Bone macrófagos (BMDMs. ) Aislamiento y Luciferase reportero de ensayo
las células de la médula ósea de ratones C57BL6 se cultivaron en medio DMEMs (10% de FCS) suplementado con 10 ng /ml de ratón recombinante M-CSF (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU. ) durante 7 días para permitir la diferenciación de los macrófagos. construcciones adenovirales que codifican los de larga duración de cDNA TLR2 fueron creados usando el sistema AdEasy como se describe anteriormente [16], [17]. El NF-kB adenovirus luciferasa plásmido PNF-kappa B-Leu (BD Clontech) que contiene múltiples copias de la secuencia consenso de NF-kB para controlar la activación de NF-kB. BMDMs (1 × 10
5 por pocillo de placas de 12 pocillos) fueron infectadas con los plásmidos adenovirales TLR2 y plásmidos de control, después de 5 horas, las células fueron infectadas de nuevo con luciferasa plásmido de adenovirus PNF-kappa B-Leu. Seguido de 24 horas de incubación, se estimularon las células infectadas durante 24 horas con LLC-CM o /y CDA-2, y luego se lisaron y la actividad del gen indicador de luciferasa se determinó mediante el ensayo indicador de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) .
LLC acondicionado Medium
el medio condicionado se recogió de las células LLC incubadas en DMEM libre de suero (SFM) durante 24 h, y se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. Se añadieron muestras de medio acondicionado para BMDMs durante 24 h, después de lo cual se analizaron los genes TLR expresión.
Aislamiento de RNA y PCR en tiempo real
tejido pulmonar total y ARN BMDMs se prepararon con RNeasy mini-plus kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. tiempo real mezclas de reacción PCR se han descrito anteriormente [18]. Brevemente, el ADNc fue sintetizado por reacción de transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó utilizando el QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) en una máquina en tiempo real sistema de PCR AB 7300 (Applied Biosystems AB, Singapur). Se utilizaron los siguientes cebadores de PCR: ratón β-actina, 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 'y 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'; Il1β ratón, 5'-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 'y 5'-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3'; ratón IL6, 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 'y 5'-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3'; ratón TNFa, 5'-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 'y 5'-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3'; ratón Kc, 5'-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 'y 5'-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3'; ratón MIP1, 5'-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 'y 5'-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3'; ratón MCP1, 5'-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 'y 5'-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3'; Tlr2 ratón, 5'-TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG 3 'y 5' CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3 '; TLR6, 5'-CAACTTAACGATAACTGAGAG 3 'y 5' CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3 '; CD14, 5'-ACA TCT TGAACC TCC ACG AC-3 'y 5'-AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3'. La especificidad de RT-PCR se controló por '' no transcripción inversa '' controles y análisis de la curva de fusión. Cuantitativos resultados de la PCR se obtuvieron usando el método ΔΔCT (umbral de ciclo). Los datos se normalizaron a los niveles de ß-actina en cada muestra.
Análisis estadístico
Los valores se muestran como media ± SEM. Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante la prueba de la t (dos caras) o ANOVA para experimentos con más de dos subgrupos o análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos los valores de p inferior a 0,05.
Resultados
CDA-2 disminuye pulmón crecimiento tumoral en modelos de ratones de tumor
Para investigar el efecto de la CDA-2 y su principal componente PG en el crecimiento de tumor de pulmón, los tumores se generaron por inyección intravenosa de 2 × 10
5 células LLC en ratones C57BL6. After14 días, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (ip) con 500 mg /kg, 1,000 mg /kg, y 2000 mg /kg CDA-2 o 200 mg /kg, 400 mg /kg, y 800 mg /kg de PG en PBS o PBS solo una vez al día durante 10 días. Los ratones se sacrificaron, y se evaluaron su multiplicidad tumor y tamaños tumorales máximas de los tumores de pulmón. Por el contrario con el control, la administración de CDA-2 a los ratones reducidos significativamente pulmón multiplicidad tumor y tamaños tumorales máximas (Fig. 1A, B). H & amp; E tinción confirmaron la reducción masiva de la carga del tumor en los ratones tratados con CDA-2. (Fig. 1A). También hay diferencias significativas en las cargas tumorales de pulmón después de diferentes dosis de administración CDA-2 indica un crecimiento CDA-2 inhibe la metástasis del tumor de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1A, B). Del mismo modo, PG también tuvo un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento metastásico de tumor de pulmón, tal como se revela mediante el examen macroscopía y microscopía (Fig. 2A, B). También se determinaron los tiempos de supervivencia de los ratones inyectados tumorales que fueron tratados con CDA-2 mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. tiempos de supervivencia Los ratones fueron evaluados y mostraron que la esperanza de vida de ratones portadores de tumores fueron prolongada cuando se administra diferente concentración de CDA-2 de tratamiento (Fig. 1C). También tenían una diferencia significativa en la tasa de supervivencia de los ratones portadores de tumores tratados con CDA-2 distinta concentración (Fig. 1C). Estos resultados confirman los obtenidos mediante el examen de la multiplicidad de tumores, tamaños máximos tumorales, H & amp; E tinción de los modelos de carcinomas metastásicos de pulmón
(A) aparición de pulmón (arriba) y la histología. (H & amp; E mancha; abajo) en células LLC inoculado C57 /BL6 ratones 10 días después del tratamiento CDA-2 con dosis indicadas. 2 × 10
5 células LLC se inyectaron por vía intravenosa en ratones C57 /BL6 sexo, con ajuste por vena de la cola, 14 días después, los ratones fueron tratados con PBS o CDA-2 durante 10 días, en el día 25, se extrajeron los pulmones. (B) el número de tumores de pulmón y tumores máxima tamaños se determinaron mediante cortes seriados a intervalos de 350 micras. Los resultados son la media ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt; 0,05. (C) Las curvas de supervivencia de los ratones (p & lt; 0,001; Log-rank test para el análisis estadístico; n = 10).
(A) aparición de pulmón (arriba) y la histología (H & amp; E mancha; hacia abajo) en células LLC inoculada ratones C57 /BL6 10 días después del tratamiento con PG dosis indicadas. 2 × 10
5 células LLC fueron inyectados por vía intravenosa en ratones C57 /BL6 sexo, con ajuste por vena de la cola, 14 días después, los ratones fueron tratados con PBS o PG durante 10 días, en el día 25, se extrajeron los pulmones. el número de tumores (B) de pulmón y tamaños máximos de los tumores se determinaron como en la Figura 1B. Los resultados son la media ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt;. 0,05
CDA-2 Reducción de proliferación y apoptosis inducida en células de cáncer de pulmón
A continuación, para investigar si CDA-2 inducida por el cambio de la carga tumoral pulmonar se debe a la proliferación celular alterada o apoptosis, se analizó la proliferación celular mediante análisis inmunohistoquímico de Ki-67 y las células de la apoptosis mediante el etiquetado final situ terminal transferasa dUTP mediada por nick (TUNEL) ensayo. 2 × 10
se inyectaron 5 células LLC en ratones y kg CDA-2, 800 mg /kg PG o PBS se administró 14 días finales de 2,000 mg /como anteriormente durante 5 días. En consonancia con los cambios en la carga de tumor de pulmón, células Ki-67-positivas fueron inferiores en CDA-2 o tratados con PG tumores en comparación con los tumores de los animales tratados con PBS (Fig. 3A). Por el contrario, la apoptosis se upregulated significativamente después del tratamiento CDA-2 o PG, mientras que muy poco apoptosis fue visto después de tratamiento con PBS (Fig. 3B).
(A) ratones portadores de tumores se trataron con 2.000 mg /kg CDA 2 o 800 mg /kg PG durante 5 días, y se extrajeron los pulmones, fija y embebidos en parafina. secciones de pulmón portadores de tumor embebidas en parafina se examinaron por inmunotinción con anti-Ki-67-anticuerpos para detectar las células en proliferación. Bar = 100 micras. Los resultados son medias ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt; 0,05. las células (B) apoptóticas fueron identificadas por tinción de TUNEL. Bar = 200 micras. tumores (C) extirparon los pulmones se analizaron para la expresión de proteínas de proliferación y apoptosis indicados por análisis de inmunotransferencia. La expresión de β-actina se utilizó como control interno para la cantidad de proteínas.
Hemos examinado algunas proteínas y genes que se sabe están involucrados en la proliferación celular y la apoptosis. Los tumores se microdissected cuidadosamente el uso de agujas de los pulmones, se lisaron, y se examinaron mediante inmunotransferencia. En contraste con el grupo de tratamiento PBS, la expresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, y Survivin fueron fuertemente reducida en respuesta a CDA-2 de tratamiento (Fig. 3C). tratamiento CDA-2 también disminuyó la expresión del antígeno de proliferación celular (PCNA), otro marcador de la fase S del ciclo celular (Fig. 3C). El análisis por inmunotransferencia de lisados tumorales de ratones también reveló la regulación por disminución de Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, y survivina, así como PCNA en tumores de pulmón después del tratamiento PG (Fig. 3C). Estos resultados se correlacionan con las observadas por el análisis de Ki-67 y TUNEL.
CDA-2 inhibe la activación de NF-kB y la inflamación pulmonar en el pulmón de ratones
Se ha demostrado que NF activación -κB juega un papel fundamental en la regulación de la respuesta inflamatoria e inmune, la apoptosis y la oncogénesis que se asocia con la inflamación de promoción de crecimiento del tumor [19], [20]. Para dilucidar los mecanismos de efecto inhibidor de tumores del CDA-2, lo primero que comparó la activación de NF-kB de cáncer disecados de los ratones con CDA-2, PG o el tratamiento de PBS. Es de destacar que contenía tejido resecado el tejido tumoral incluyendo tumores y las células inflamatorias. Se prepararon extractos nucleares y la activación de NF-kB examinados por la EMSA. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento CDA-2 disminuyó significativamente la actividad de unión a ADN de NF-kappa B en comparación con el control después de 5 días 2,000 mg /kg de tratamiento CDA-2. Es importante destacar que la actividad de unión a ADN de NF-kappa B también fueron fuertemente inhibida en respuesta al tratamiento CDA-2 en los macrófagos alveolares de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) (Fig. 4B). A continuación, el tratamiento con 800 mg /kg PG durante 5 días en ratones portadores de tumores también inhibió eficazmente el ADN de NF-kB actividad de unión tanto en las células tumorales y los macrófagos alveolares (Fig. 4C). Este resultado sugiere que PG tiene efecto similar en la inhibición de la activación de NF-kappa B
.
EMSA de extractos nucleares aisladas de las células tumorales y los macrófagos alveolares que muestra la unión nuclear de NF-kappa B después de 5 días 2,000 mg /kg CDA-2 (A y B) o PG tratamiento 800 mg /kg (C). número total de células y la población de leucocitos en BALF recogidos de ratones C57BL6 3 o 5 días 2,000 mg /kg CDA-2 (D) y 800 mg /kg PG (E) o de tratamiento de PBS. composición celular se determinó usando preparaciones de Cytospin. Los resultados son medias ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt;.
0,05
A continuación, pregunta si la inactivación inducida por CDA-2 de NF-kB en las células mieloides cambia la situación inflamatoria en los pulmones. Se caracterizaron las células y mediadores inflamatorios en los pulmones de los ratones sometidos al modelo de cáncer de ratones. Número total de células y el número absoluto de macrófagos, neutrófilos, y linfocitos en BALF se redujo significativamente los 3 y 5 días después de 2000 mg /kg CDA-2 de tratamiento (Fig. 4D) o 5 días después de 800 mg de tratamiento /kg PG (Fig. 4E ). tratamiento CDA-2 o PG reduce eficazmente la expresión de varios mRNAs de citoquinas y quimioquinas inflamatorias, tales como IL1B, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, y MCP1 en el pulmón (Fig. 5A, B). tratamiento CDA-2 o PG también disminución de la secreción de TNF-α, IL-6, y KC por las células pulmonares (Fig. 5C, D). Tesis resultados sugieren que la reducción de la reacción inflamatoria mediante la inhibición de la activación de NF-kB, es probable que sean un importante mecanismo de inhibición de tumor de CDA-2 y PG.
La inducción de citoquinas inflamatorias y mRNA de quimioquinas en homogeneizados de 3 o los pulmones 5 días 2,000 mg /kg CDA-2 (a) o 800 mg /kg PG (B) tratados se midió por PCR en tiempo real. Los resultados son medias ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt; 0,05. La concentración de citoquinas inflamatorias en BALF de 3 o 5 días 2,000 mg /kg CDA-2 (C) o kg PG (D) los ratones 800 mg /tratado se evaluó por ELISA. Los resultados son medias ± SEM, n = 5, diferencia significativa, * p & lt;. 0,05
CDA-2 inhibe la señalización de TLR2 en macrófagos de médula ósea procedentes
Los estudios previos han mostrado que receptores toll-like (TLR) mediada por la señalización de favorecer la activación de NF-kB, lo que lleva a una respuesta pro-inflamatoria [21]. Para resolver si CDA-2 inhibe NF-kB a través de la vía de señalización de TLR, se analizó la expresión de los miembros de la familia TLR en los macrófagos de médula ósea derivados (BMDM) que se estimula por medio condicionado libre de suero de células LLC (LLC-CM) . LLC-CM indujo significativamente la expresión de TLR2 y su correceptor TLR6 y CD14 (Fig. 6A, B), pero no TLR1, TLR3, TLR4, y TLR9 en BMDM (datos no mostrados). Es importante destacar que, la adición de CDA-2 o PG suprimió significativamente la expresión de TLR2, TLR6, y CD14 de una manera dependiente de la concentración (6A. Fig, B). La incubación de BMDM con CDA-2 o PG solo no tuvo ningún efecto en TLR2, TLR6, y la expresión de CD14 (Fig. 6A, B). Estos resultados sugieren que TLR2 signiling podría actuar como mediador y contribuye a la inactivación de NF-kB por CDA-2 y PG.
BMDMs se trataron durante 24 horas por DMEM libre de suero (SFM) o LLC-CM o su combinación con CDA-2 (A) o PG (B). ARN totales se aislaron de BMDMs, y la expresión génica se evaluó mediante PCR en tiempo real. Los resultados son la media del cambio pliegue ± SEM, n = 3, diferencia significativa, * p & lt;. 0,05
La inhibición de la CDA-2 a NF-kB activación fue abrogada por la sobre expresión de TLR2
a fin de evaluar la señalización mediada por TLR2 activación de NF-kB fue regulada por CDA-2, se realizó un ensayo de gen indicador de luciferasa NFkB impulsada. vectores adenovirales recombinantes se generaron codifica TLR2 expresa en BMDM. TLR2 o control de vectores infectados BMDM estaban infectados por el NF-kB plásmido indicador de luciferasa de adenovirus. Ambos de tratamiento BMDMs infectado con LLC-CM dio como resultado aumentos significativos en la unión de NF-kappa B a su secuencia de consenso de ADN, como se muestra por un aumento en la activación de la luciferasa (Fig. 7A). TLR2 infectado BMDM mostró activaciones de referencia significativos de este factor de transcripción y valores más altos de LLC-CM en comparación con los valores de control (Fig. 7A). El tratamiento de la CDA-2 o PG causó una disminución significativa de LLC-CM inducida transactivación de NF-kappa B en el control infectado BMDM, mientras que no hay ningún cambio en la actividad de reportero por CDA-2 o PG en las células infectadas TLR2 (Fig. 7A). En consonancia con los resultados de transactivación de NF-kB, estas construcciones también producen efectos similares sobre expresiones de TNFαand IL-6 (Fig. 7B). Por lo tanto, se requiere la inhibición de la expresión de TLR2 por CDA-2 y su componente de PG para la inactivación de NF-kB en las células mieloides.
BMDMs (A) fueron co-infectados con TLR2 y NF-kB del gen indicador de luciferasa construcciones adenovirales . 24 horas después de la infección, las células se trataron con SFM o LLC-CM y /o CDA-2 o PG como se indica. Las actividades de luciferasa se determinaron 24 h después del tratamiento. Los datos se muestran como media ± SEM relativa pliegue de controlar. n = 3, diferencia significativa, * p & lt; 0,05; ns: no significativo. (B) La inducción de mRNA de citoquinas inflamatorias en BMDMs infectadas como se describe anteriormente. Los resultados son la media del cambio pliegue ± SEM, n = 3, diferencia significativa, * p & lt; 0,05; ns: no significativo.
Discusión
El principal hallazgo de este estudio es que CDA-2, una preparación urinaria, inhibe el crecimiento de tumores de pulmón a través de una célula mieloide intermedia. CDA-2 reduce la inflamación en los pulmones a través de supresión de la activación de NF-kB en las células mieloides asociar con la modulación de la señalización de TLR2. El principal constituyente del CDA-2, PG, es probable que desempeñe un papel fundamental al efecto antitumoral de CDA-2
.
Este estudio probó directamente el efecto inhibidor tumoral importante de CDA-2 mediante el uso experimental de pulmón modelos de tumores. Estudios anteriores habían demostrado que CDA-2 es de valor potencial como agente anti-cáncer [3], [7]. CDA-2 se ha estudiado y demostrado que inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama humano, células de glioma, y células de leucemia humana
in vitro
y
in vivo
[3], [7]. Clínicamente, CDA-2 mostró efectos significativos en la mejora de las respuestas de quimioterapia en el glioma, el hepatoma, cáncer de pulmón no de células pequeñas, y los pacientes con cáncer de mama [7]. PG es un componente bioactivo importante en CDA-2. Estudios previos sugieren que PG tiene un potencial efecto inhibidor del tumor, y también es un componente importante de AS2-1 antineoplaston, una mezcla de sales de sodio de ácido fenilacético y PG, que es un fármaco anti-tumor [3], [22] . Los datos actuales confirman que el tratamiento primero CDA-2 da como resultado directamente en una detención del crecimiento de tumor de pulmón y una vida útil prolongada en ratones que indica la actividad anti-tumor potente de CDA-2 en la inhibición de crecimiento del tumor de una manera dependiente de la dosis. Tanto la proliferación de inhibición y los efectos inductores de la apoptosis se observaron en los tumores de pulmón, como se demuestra por inmunohistoquímica y análisis Western Blot. PG también presenta un efecto directo sobre el crecimiento del tumor de pulmón, y tiene resultados similares de inhibición del tumor como CDA-2. Estos resultados sugieren que CDA-2 podría ser un remedio terapéutico potencial para el tratamiento de cáncer de pulmón, y PG se cree que contribuye la mayor bioactividad de CDA-2 debido a la alta por ciento (41%) y el efecto de supresión tumoral claro.
El microambiente tumoral juega un papel crítico en la iniciación del tumor y la promoción y contiene células del sistema inmune y el tejido conectivo, tales como fibroblastos, células endoteliales, pericitos y células mesenquimales [23]. Las células inmunes que se encuentran con mayor frecuencia en el microambiente del tumor son los macrófagos asociados al tumor (TAM). TAM sobre todo a promover el crecimiento del tumor y puede ser obligatorio para la angiogénesis, la invasión y la metástasis por la liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias, y su presencia en el cáncer de pulmón se ha correlacionado con mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón [24], [25] y otros resultados tales como aumento en el conteo de microvasos [26]. Como partes de los bucles positivos de alimentación directa, quimiocinas producidas por TMA atraen a las células inmunes /inflamatorias adicionales que incluyen macrófagos al microambiente tumoral [27]. Nuestros datos muestran el tratamiento de los resultados de CDA-2 o PG en una disminución del total de células en BALF, que en su mayoría macrófagos afectados, reducidos inflamación. Por lo tanto, es probable que CDA-2 inhibe el crecimiento del tumor de pulmón a través de la supresión de la población de células inmunes /inflamatorias y la inflamación en el pulmón.
La activación de NF-kappa B es responsable de la inducción de una variedad de genes diana que son importantes para la tumorigénesis [28], [29]. la activación de NF-kB en las células inflamatorias controla la producción de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo TNF, IL-1, IL-6, y IL-23, que median la promoción y progresión del tumor, así como la activación de NF-kB en las células tumorales [ ,,,0],8], [11]. la activación de NF-kappa B también se encuentra en las células tumorales en los que regula la proliferación celular, supervivencia, angiogénesis, invasión y metástasis [30] - [32]. El efecto promotor de la activación de NF-KB en la carcinogénesis de pulmón ha sido que se muestran con diferentes enfoques y reportado por diferentes grupos, y el agotamiento de mieloide celular o epitelial NF-kappa B parecen tener un efecto en la reducción de la tumorigénesis de pulmón [9], [ ,,,0],33] - [36].