Extracto
Objetivo
El cáncer de pulmón sigue siendo la causa número uno de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. la desregulación del ciclo celular juega un papel importante en la patogénesis de células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC). CDC25A representa un regulador del ciclo celular crítico que mejora la progresión del ciclo celular. En este estudio tuvo como objetivo investigar el papel de una novela CDC25A variante transcripcional, CDC25A
Q110del, sobre la regulación de la proteína CDC25A, y su impacto en el pronóstico de los pacientes con CPNM.
Metodología /Principales conclusiones
Aquí mostramos una nueva variante de CDC25A transcripción con el codón 110 (glutamina) eliminación, que hemos denominado CDC25A
Q110del en las células NSCLC. En 9 (75%) de las 12 líneas celulares de cáncer, CDC25A
expresión Q110del representó más del 20% de las transcripciones Cdc25A. Los efectos biológicos de CDC25A
Q110del se investigaron en las células H1299 y HEK-293F utilizando la radiación UV, citometría de flujo, el tratamiento ciclohexamida, y microscopía confocal. En comparación con CDC25A
en peso, CDC25A
Q110del proteína tenía una semivida más larga; las células que expresan CDC25A
Q110del eran más resistentes a la irradiación UV y mostró más actividad mitótica. Taqman-PCR se utilizó para cuantificar CDC25A
niveles de expresión Q110del en pares de tejido 88 primaria tumor de NSCLC /normales. En pacientes con NSCLC, las curvas de Kaplan-Meier mostraron tumores que expresan altos niveles de CDC25A
Q110del en relación con los tejidos pulmonares adyacentes, presentan una supervivencia global significativamente inferior (
P = 0,0018
).
importancia
Aquí hemos identificado CDC25A
Q110del como una nueva variante transcripcional de CDC25A en el CPNM. La naturaleza específica de la secuencia de la anomalía podría ser un indicador pronóstico en pacientes con CPNM, así como un objetivo candidato para futuras estrategias terapéuticas
Visto:. Younis RH, Cao W, Lin R, R Xia, Liu Z, Edelman MJ, et al. (2012) CDC25A
Q110del: A Novel de la célula División Ciclo 25A isoforma expresado de forma aberrante en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10.1371 /journal.pone.0046464
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Junio, 2012; Aceptado: 30 Agosto 2012; Publicado: 5 de Octubre, 2012
Copyright: © Younis DDS, MDS, PhD, et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01 CA126818 y R01 CA136635. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de enfermedad maligna. muertes relacionados con la PI en todo el mundo a pesar de los avances en modalidades terapéuticas [1]. De células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) es el tipo más común de cáncer de pulmón y es el resultado de alteraciones moleculares acumulados que conduce a la desregulación de varios procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular [2]. En NSCLC, varios reguladores del ciclo celular que juegan un papel crítico en controles de los puntos de verificación del ciclo celular se alteran, que permite a las células cancerosas evitan los diferentes puestos de control, especialmente en G1 /S y G2 /M con la proliferación celular incontrolada posterior [3] - [ ,,,0],7].
25A ciclo de división celular (CDC25A) es un miembro de la familia CDC25 de las fosfatasas de doble especificidad y juega un papel crítico en la progresión del ciclo celular [8], [9]. funciones Cdc25A para eliminar los fosfatos inhibidores de residuos de treonina y tirosina en los sitios de unión a ATP de las CDK, la promoción de la progresión del ciclo celular [10], [11]. CDC25A es también un objetivo corriente abajo del puesto de control vía mediada por Chk1: activación de Chk1 por DNA condiciones perjudiciales objetivos CDC25A para la degradación del proteasoma, que evita que las células con anomalías cromosómicas de progresar a través del ciclo celular [10], [12], [13]. Mientras CDK1 juega un papel crítico para la estabilización CDC25A durante la mitosis [8], [10], [11]. CDC25A frecuencia se sobreexpresa en cánceres incluyendo NSCLC. Esta sobreexpresión se asocia con un comportamiento clínico más agresivo y la supervivencia inferior [7], [8], [12] - [19]. Aunque CDC25A ha sido ampliamente estudiado por su papel en la progresión tumoral y como un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer, los mecanismos de CDC25A sobreexpresión en el cáncer aún no se ha investigado [12]. Algunos estudios han demostrado que la sobreexpresión de CDC25A en los cánceres podría resultar de desregulaciones post-transcripcional [20], tales como la sobreexpresión de hidrolasa DUB3 ubiquitina [21], la inactivación de la glucógeno sintasa quinasa-3beta (GSK-3beta), que fosforila CDC25A para promover su proteólisis en las fases del ciclo celular temprana [22], la activación de LIN28A que regula la expresión CDC25A mediante la inhibición de la biogénesis de let-7 miARN [23], y microRNA-21 que regula negativamente CDC25A, de modo que sus menores de expresión resultados en CDC25A sobreexpresión en el cáncer de colon [24].
a continuación se presenta la identificación de una novela, corte y empalme alternativo isoforma CDC25A que resultó en la eliminación de codón 110 denominado CDC25A
Q110del. Se demuestra que CDC25A
Q110del se expresa en altos niveles en el 75% de las líneas celulares de cáncer. CDC25A
Q110del proteína tenía una mayor estabilidad y una distribución más nuclear. Las células que expresan alto nivel de CDC25A
Q110del eran más resistentes a la irradiación UV. En pacientes con NSCLC, altos niveles CDC25A
Q110del en los tumores se asociaron con un mal resultado clínico. Nuestros datos indican que la expresión CDC25A
Q110del es común en NSCLC y puede desempeñar un papel en la tumorigénesis de pulmón y la progresión del cáncer.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
HEK293 y células de NSCLC se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA), y se mantuvieron en DMEM - 5% de suero bovino fetal. líneas bronquiales humanas inmortalizadas de células epiteliales (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 y HBEC5 (regalo de los Drs. John Minna y Jerry Shay, de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], se mantuvieron en suero de queratinocitos libres (KSF) los medios de comunicación con el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (regf) y extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA). la transfección del plásmido se realizó usando lipofectamina 2000 (Invitrogen).
Western Blot
Las células se recogieron en tampón RIPA con inhibidores de la proteasa (Roche Bioscience), y se separó por SDS-PAGE. Los anticuerpos primarios contra CDC25A (clones 144 y F-6), p34 cdc2 (H-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, CA), fosfo-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA), fosfo se han usado CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ). NE-PER kit de extracción de proteínas (Pierce Biotech, Rockford, IL) se utilizaron para fraccionar citosólicas y proteínas nucleares. Ciclohexamida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se reconstituyó en DMSO.
La extracción de RNA, transcripción reversa y PCR en tiempo real
El ARN total fue extraído por medio de TRIzol reactivo, y se convierte en ADNc utilizando el kit de superíndice III primer capítulo de síntesis (Invitrogen). de longitud completa CDC25A cDNA se amplificó usando ADN iProof de alta fidelidad de la polimerasa (Bio-Rad, Hercules, CA), y se clonó en pEF6 /V5 Sus (Invitrogen, Carlsbad, CA) o pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, CA) para la normalización de bienes Las reacciones de PCR en tiempo, radiación UV, tratamientos CHX, análisis de secuencias y la digestión con enzimas de restricción, pEGFP-N1 fundido a EGFP o m-cereza se utilizó para el análisis de imágenes y citometría de flujo o cuando se indique Todas las manipulaciones de ADN se realizaron en el nivel de bioseguridad 1 o 2 laboratorios.
Para cuantificar la transcripción total de CDC25A, en tiempo real el ensayo de PCR fueron ensambladas utilizando el cebador directo 5'-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT 3 ', el cebador inverso 5'TGGACTACATCCCAACAGCTT-3', y FAM ™ sonda marcada con colorante 5 '-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3'; para cuantificar la transcripción de tipo salvaje CDC25A, el ensayo se montó usando el cebador directo 5 '-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3', el cebador 5 'ACTACATCCCAACAGCTTCTG- 3' y FAM ™ sonda 5'-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3 marcado con colorante «inversa. El ensayo se realizó por triplicado con TaqMan PCR Universal Rápido mezcla maestra (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) en el sistema de PCR en tiempo real rápida Applied Biosystems 7900HT. En todas las reacciones, GAPDH ensayo TaqMan VIC rápida sonda marcada con colorante se añadió como control de carga de ARN.
Cuando la expresión total de CDC25A es designado como el gen endógeno de referencia, la abundancia de CDC25A
Q110del puede ser calculado como Ct = Ct
p-Ct
tot. Por lo tanto, la abundancia relativa de CDC25
peso en tumor emparejado frente a tejido normal se calcula 2 método
-ΔΔCt, donde ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (Boletín del usuario#2 Applied Biosystem). Si los niveles de expresión de CDC25A
Q110del y CDC25
en peso son iguales en el tumor correspondiente y el tejido pulmonar normal adyacente, el valor de abundancia relativa calculada se 1. Un valor & lt; 1 indica que el tumor expresa un nivel más alto de CDC25A
Q110del que el tejido pulmonar normal emparejado. A la inversa, un valor & gt;. 1 indica que el tejido pulmonar normal expresa un mayor nivel de CDC25A
Q110del que el tumor emparejado
análisis de la secuencia y la enzima de restricción digestión
clones de ADN se secuenciaron en la Universidad de Maryland, Baltimore, instalación de secuenciación o GENEWIZ Inc., (South Plainfield, Nueva Jersey). La alineación se realizó contra referencia CDC25A NM_001789. Los clones de ADNc utilizados para los ensayos funcionales se amplificaron a partir de líneas celulares de NSCLC (Tabla S1). Para el análisis de la digestión enzimática, un fragmento de 292 pb de CDC25A cDNA se amplificó usando los cebadores: 5'-transmita CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 'e inverso 5'-CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3', se digirió con la endonucleasa de restricción Bpu10I (New England Biolabs, Ipswich, MA) a continuación, se separaron en gel de agarosa.
UV irradiación
Para el tratamiento UV de células en cultivo, se retiró el medio, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se irradiaron a continuación en placas de cultivo de tejido no cubiertas con 254 nm de luz UV (UVC) en Stratalinker UV Crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA). medio de cultivo nuevo se vuelve a añadir, y las células se incubaron adicionalmente durante los momentos de la hora de describir.
Análisis del ciclo celular
Se recogieron las células, se fijaron en etanol al 70%, se suspendió en PI /RNasa tampón de tinción (BD Pharmingen ™, San Jose, CA) que contiene 0,1% Citrato de sodio y 0,1% de Triton X-100. El análisis de datos se realizó en la Universidad de Maryland, Baltimore Medical Center, citometría de flujo Core y analizada con el software FlowJo.
análisis de imágenes
Las células que expresan CDC25A
en peso o CDC25A
Q110del- fusionado con mCherry o EGFP fueron fijadas en paraformaldehído al 2%, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100, se tiñeron con DAPI. Las imágenes fueron capturadas utilizando un Zeiss LSM 510 Meta láser confocal de barrido microscopio con DAPI, FITC y rodamina fiters. El representante histograma de la expresión FITC y rodamina fue producida usando
imagen J
software.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se midió utilizando el reactivo de proliferación celular WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).
pacientes y tejidos
se evaluaron los tumores primarios de NSCLC y sus correspondientes tejidos pulmonares no malignas adyacentes de 88 individuos con estadio patológico I a IIIA. Todos los pacientes fueron tratados con cirugía sola excepción de aquellos con enfermedad estadio IIIa que también podrían habían recibido radioterapia postoperatoria y quimioterapia adyuvante, de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) de 1995 a 2000. Las muestras fueron inmediatamente congelados y almacenados a -80 ° C. La selección de estos pacientes se basó en la disponibilidad de tumor fresco archivado y tejidos pulmonares normales correspondientes para los investigadores. La información clínica y la información de seguimiento para el estudio se basa en la revisión de forma gráfica y los informes de servicio de registro de tumores MDACC. El consentimiento informado para el uso de tejidos resecados residuales para la investigación se obtuvo de todos los pacientes incluidos en el estudio.
Declaración de Ética
consentimiento informado por escrito para usar tejido resecado residual para la investigación se obtuvo de todos los pacientes incluidos en el estudio. El procedimiento de autorización y el uso de estos materiales y la información clínica fueron revisados y aprobados por el comité de vigilancia de la Universidad de Texas MDACC.
El análisis estadístico
Estudiantes
se utilizó t-test
para el análisis estadístico de los ensayos funcionales. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier curvas se generaron con el análisis de log rank utilizando Proc LIFETEST en SAS 9.2. Todas las pruebas son de dos lados y los valores de P & lt; 0,05 se considera estadísticamente significativa
Resultados
Identificación de CDC25A
Q110del en CPNM
Para investigar posibles alteraciones de. CDC25A a nivel de mRNA, la secuencia clones CDC25A de ADNc derivadas de un panel de 10 líneas celulares de NSCLC. Entre el total de 16 clones de cDNA a partir de las líneas celulares 10, se observó una supresión de trinucleótidos específico en 7 de los 16 clones de 5 de las líneas celulares 10 (Fig. 1A) (Tabla S1). La deleción se localiza en las posiciones 328-330 en referencia a NM_001789.2, CDC25A transcripción 1, que predice una deleción de glutamina en el codón 110 (Fig. 1B). Este residuo de aminoácido que se encuentra en el dominio regulador de CDC25A, y se conserva entre varios vertebrados (Fig. 1C y D). Llamamos a la nueva isoforma CDC25A con el codón 110 de eliminarlos, CDC25A
Q110del. Esta supresión es probablemente el resultado de corte y empalme de ARN alternativo, ya que ninguna alteración de la secuencia de ADN genómico se encontraron en las líneas celulares de cáncer (datos no mostrados) (Fig. 1E) Para confirmar la presencia de CDC25A
Q110del en líneas de células de NSCLC y tejidos tumorales NSCLC primarios, se examinaron los ADNc de 4 líneas de NSCLC de células y tejidos tumorales 5 NSCLC primarios utilizando digestión con endonucleasas de restricción por Bpu10I, que pueden escindir la secuencia 5'-CCTNAGC, un sitio único en CDC25A
secuencia Q110del, para producir una más corto banda de ADN escindido. Todas las muestras se detectó la banda de ADN escindido más corto en varias densidades (Fig. S1).
A. secuencia de ácido nucleico de eliminación triplicado CDC25A-CAG (328-30) en líneas celulares de cáncer. B. CDC25A-CAG (328-30) se traduce en la eliminación Q110 (CDC25A
Q110del). C. El aminoácido Q110 de CDC25A es evolutiva conservada en otros organismos. D. Q110 se encuentra en el dominio regulador, más cerca de CDK1 sitio de fosforilación de estabilización mitótico (S116) y el sitio de fosforilación de Chk1 degradación (S124). Rojo: CAG (328-30) eliminación de ácidos nucleicos y de aminoácidos correspondiente Q110, sombra: los sitios de fosforilación de serina (S116 y S124). E. Esquema del sitio de corte y empalme alternativo sugerido. zona donante alternativo: 5 'nudo de empalme (zona donante), el cambio de la 3' frontera del exón aguas arriba, produciría el CDC25A
peso de transcripción, mientras que un sitio aceptor alternativo: un 3 'nudo de empalme (sitio aceptor), cambiar el límite 5 'del exón aguas abajo, produciría el CDC25A
Q110del transcripción.
a continuación realizamos un tiempo real el ensayo de PCR (Fig. 2A) para evaluar la cantidad de CDC25A
Q110del entre las transcripciones totales Cdc25A en líneas celulares de cáncer y muestras de tejidos, para demostrar que el ensayo puede medir cuantitativamente la abundancia relativa de las isoformas Cdc25A, se construyó una curva de Ct usando ADN plásmido purificado que contiene ya sea CDC25A
en peso o CDC25A
Q110del inserto de ADNc. El resultado mostró una relación casi lineal con diferente tipo salvaje y la relación de Q110del se utilizó a continuación (Fig. 2B) .Este método para evaluar CDC25A
Q110del expresión en líneas celulares y tejidos. En 4 líneas celulares HBEC, CDC25A
expresión Q110del era detectable pero en general, menos de 20% de los transcritos totales Cdc25A (Fig. 2C). Debe tenerse en cuenta que estas líneas de células se derivan de células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas de pacientes con cáncer de pulmón. En comparación, 9 (75%) de las 12 líneas celulares de NSCLC expresó CDC25A
Q110del mayor que 20% de las transcripciones Cdc25A totales incluyendo 3 (20%) de las líneas de células expresó CDC25A
Q110del a nivel casi 50% (Fig. 2C). La diferencia de CDC25A
Q110del niveles de expresión entre las líneas celulares HBEC y las líneas celulares de cáncer fue estadísticamente significativa (
P = .003
). Curiosamente, el las líneas celulares H549 que muestran CDC25A
Q110del AT & gt; H596 y el 50% del total de CDC25A, tiene un alto número cromosómico modal en un alto porcentaje, NCI-H596 número modal = 71; rango = 65 a 75.This es una línea celular humana triploide próximo. Mientras que el A549 es una línea celular humana hypotriploid con el número cromosómico modal de 66, que se produce en el 24% de las células (de acuerdo con la "American Type Culture Collection"). Esto sugiere CDC25A
Q110del a desempeñar un papel en la inestabilidad genómica y cambios malignos acumulativos [26]. Una correlación entre la acumulación de CDC25A
Q110deland de células hyperploid se describe a continuación en la distribución del ciclo celular.
A. En tiempo real el ensayo de PCR para evaluar la cantidad de CDC25A
Q110del en relación con las transcripciones totales Cdc25A en líneas celulares de cáncer y muestras de tejido, el "total" ensayo de PCR en tiempo real, determina la plantilla CDC25A total en la reacción (Ct
tot ), mientras que el ensayo de PCR en tiempo real "en peso" determina el gen diana que es el CDC25A
en peso plantilla (Ct
en peso), a continuación, calcular el CDC25A
Q110del = Ct = (Ct
en peso ct
tot). B. curva estándar ilustra los valores de Ct correspondientes a diferentes proporciones de CDC25A
peso: CDC25A
Q110del, pEF6-V5-His-CDC25A
en peso y pEF6-V5-His-CDC25A
Q110del se incorporaron juntos en varias proporciones como plantilla en cada reacción de PCR en tiempo real uniplex, desarrolladas por triplicado, a continuación, el CDC25A
Q110del calcula (CDC25A
Q110del = Ct = Ct
p-Ct
tot). C. 50% de la NSCLC muestran Cdc25A
valores Q110del que corresponden a un 30-50% de las plantillas totales Cdc25A en referencia a la curva estándar (B), mientras que las líneas celulares expresan HBEC ~ 20% de las plantillas totales Cdc25A (
P = .003
).
CDC25A
estabilidad de la proteína y la supervivencia de la célula Q110del
CDC25A es una proteína lábil, estrictamente regulados a través de varios eventos de fosforilación en su dominio regulador [8]. Para investigar el efecto de la eliminación Q110 sobre el destino de la regulación de proteínas CDC25A, hemos probado la velocidad de degradación de CDC25A
Q110del mediante tratamiento ciclohexamida (CHX). En las células H1299 tratadas con CHX, se observó que CDC25A
Q110del tiene una vida media más larga en comparación con CDC25A
wt (Fig. 3A). Además, cuando CDC25A
en peso y CDC25A
Q110del fueron co-transfectadas, más CDC25A
Q110del se acumuló de CDC25A
en peso a 72 h después de la transfección (Fig. S2) en ambos H1299 y 293F células.
A. ciclohexamida curso de tiempo (50 ug /ml) el tratamiento de células H1299 transfectadas con pEGFPN1-CDC25A
en peso o pEGFPN1-CDC25A
qdel en condiciones no perturbadas mostraron aumento de la vida media de CDC25A
Q110 (~ 15 minutos) versus CDC25A
en peso. la radiación ultravioleta B. seguido de 30 minutos de incubación de las células 293F de 37 ° C, CDC25A
Q110del mostró una mayor estabilidad en comparación con CDC25A
en peso. C. Las células 293F chapados a una densidad de células transfectadas igual y con la misma cantidad de EGFP etiquetados CDC25A
Q110del o CDC25A
en peso. Después de 72 horas de la transfección, citometría de flujo análisis de compuerta número igual de células EGFP para cada isoforma expresar. Histograma muestra la intensidad de la expresión de CDC25A
Q110del-EGFP (media 59,2) frente a CDC25A
wt-EGFP (media 40,5) (t-test
P
= .05). D. La misma población de células cerradas para la expresión EGFP-CDC25A se estudió para la distribución del ciclo celular. El CDC25A
wt-EGFP mostró a arrestar en la fase posterior G2 (& gt; G2 /M) en comparación con el control (p = 0,055). Los EGFP-CDC25A
Q110del células que expresan mostraron una menor acumulación de población de células hiperploide a & gt; fase G2 /M y se aceleraron las células más a través de la mitosis en comparación con la EGFP-CDC25A
peso de las células que expresan (p = 0,0047). E. ensayo de viabilidad celular de H1299 que expresa CDC25A
peso frente CDC25A
Q110del después de 24 h de varias dosis de radiación UV. CDC25A
Q110del expresión rescatado sensibilidad H1299 a la radiación UV en relación con el grupo de control.
En 293F células transfectadas con cualquiera de CDC25A
en peso o CDC25A
Q110del y se trató con 10 y 20 J /m
2 radiación UV, las células transfectadas con CDC25A
Q110del mostró una estabilidad proteica mejorada 30 minutos después de la irradiación UV, pero no las células transfectadas con CDC25A
en peso (Fig. 3B).
Para obtener una medición más cuantitativa de CDC25A
Q110del y CDC25A
peso de niveles, se midió la intensidad de fluorescencia de las proteínas de fusión CDC25A-EGFP gating igual número de células 293F expresar CDC25A
wt-EGFP o CDC25A
Q110del-EGFP y observó un nivel significativamente más alto de intensidad de fluorescencia en el CDC25A
células Q110del-EGFP transfectadas (Fig. 3C). El análisis del ciclo celular de la misma población cerrada de células, mostró una mayor población después G2 (células hyperploid) del CDC25A
wt-EGFP células que expresan en comparación con el CDC25A
Q110del-EGFP, mientras que el CDC25A
Q110del EGFP se aceleró las células más a través de la fase de post G2 (mitosis) en comparación con el CDC25A
en peso (p = 0,0047) (Fig. 3D). Esto sugiere que el CDC25A
Q110del puede abrogar el punto de control G2 /M en comparación con el CDC25A
en peso, conduciendo las células más a través de la mitosis [26], [27].
Para investigar si el CDC25A
Q110del puede afectar a la supervivencia de células de NSCLC en condiciones perturbadas, las células H1299 transfectadas con CDC25A
Q110del fueron tratados con radiación UV a diferentes dosis, H1299 expresa CDC25A
Q110del eran más resistentes a UV muerte celular inducida en comparación a las células transfectadas con el vector de control o CDC25A
en peso, especialmente a dosis altas UV (fig. 3E).
localización celular y la actividad mitótica de CDC25A
Q110del
células H1299, CDC25A
Q110del mostraron un aumento considerable en la localización nuclear de CDC25A
en peso (Fig. 4A). 24 horas después de la irradiación UV, las células transfectadas con CDC25A
Q110del mostraron una mayor estabilidad de la proteína si bien el aumento de la fosforilación de la respuesta al daño del ADN aguas arriba (DDR) marcador pChk1-ser345 (Fig. 4B). Como nuevo CDC25A evidencia apunta como un miembro de la familia CDC25 necesaria para la activación completa de CDK1 nuclear [11], [28], [29], y desde Q110del es más cercana a S116 - el sitio de fosforilación de CDK1 crítico para estabilizar CDC25A en un bucle de retroalimentación durante mitosis - [11], además de nuestros resultados que mostraron la CDC25A
Q110del para conducir las células más a través de la mitosis en comparación con el CDC25A
wt (Fig. 3D), nos examinamos para investigar el efecto de CDC25A
Q110del en la actividad mitótica y en la activación de CDK1. Después de la transfección de 293F células con CDC25A
Q110del-EGFP, se observó un aumento en la proporción de células en la fase mitótica, un fenómeno que no se observó en las células transfectadas con CDC25A
wt-EGFP (Fig. 4C). En comparación con las células transfectadas con CDC25A
wt-EGFP, las células transfectadas con CDC25A
Q110del-EGFP mostraron un menor nivel de fosforilación en CDK1- Tyr15, 24 horas después de la transfección (Fig. 4D), que es coherente con la presencia de CDK1 más activa para promover la transición G2 /M fase (Fig. 3D). La disminución de la CDK1 total en el CDC25A
en peso y CDC25A
Q110del células en comparación transfectadas para se espera que el control-, desde la detención en el ciclo celular G2 /M fase (Fig. 3D), pueden causar la represión de expresión de CDK1 en el nivel transcripcional en un tiempo y manera dependiente tipo de células [30].
a. Inmunotransferencia de células H1299 mostró CDC25A
Q110del para localizar más en el núcleo en comparación con el CDC25A
en peso. B. 24 horas después de la irradiación UV, CDC25A
Q110del mostró una mayor estabilidad en H1299 y mantuvo correspondencia con mayor fosforilación de Chk1 marcador DDR-ser345. C. Microscopía confocal de células 293F después de 24 horas de la transfección: CDC25A
Q110del expresión mostró frecuentes figuras de mitosis en metafase (flechas finas ""). Co-expresión de CDC25A
en peso y CDC25A
Q110del al (01:01) Relación de la actividad mitótica se notó aún (citocinesis, "flechas en negrita"). El histograma es representativa de la cantidad de píxeles para el FITC por condición y la rodamina. D. pCDK1-Tyr15 desfosforilación como lector de aguas abajo para aumentar la actividad de la fosfatasa relativa de CDC25A
Q110del comparación con CDC25A
en peso después de 24 horas de la transfección en células 293F.
CDC25A
Q110delexpression en el CPNM y su asociación con los parámetros clínicos
para determinar si hay un impacto potencial de CDC25A
Q110del expresión en los tumores de pacientes con CPNM, cuantificamos CDC25A
Q110del expresión en los tumores primarios y sus tejidos pulmonares adyacentes apareados de 88 pacientes con CPNM. CDC25A
expresión Q110del varió de indetectable a cerca de 100% de los transcritos totales Cdc25A en los tumores, con 50% de los tumores que expresan CDC25A
Q110del en exceso de 20% entre los transcritos totales Cdc25A. Curiosamente, muchos de los tejidos pulmonares normales adyacentes de los mismos pacientes con cáncer de pulmón también expresaron CDC25A
Q110del, lo que sugiere que este es un evento temprano en la carcinogénesis pulmonar.
A continuación, analizamos la asociación entre los niveles de expresión de CDC25A
Q110del en el tejido tumoral y los parámetros clínicos patológicos. A excepción de una asociación marginal con histología de adenocarcinoma (
P = .068
), no se observó ninguna otra asociación (Tabla S2 y S3). En concreto, no hubo asociación con la etapa, el sexo o la historia de tabaquismo. Sin embargo, los pacientes cuyos tumores tenían mayores CDC25A
niveles de expresión Q110del demostraron una tendencia no significativa hacia una peor supervivencia global (
P = .074
mediante la prueba de log-rank) (figura 5A;. Tabla S2). Curiosamente, cuando se toma en consideración CDC25A
Q110del expresión en los tejidos pulmonares normales adyacentes, se observó que los pacientes cuyos tumores expresado considerablemente mayor CDC25A
Q110del que sus tejidos pulmonares normales adyacentes apareados tuvieron una supervivencia global significativamente peor (
P = 0,0018
mediante la prueba de log-rank) (figura 5B;. Tabla S4 y S5)
A.. Kaplan Meier de supervivencia mostraron CDC25A
Q110del en el tejido tumoral se correlaciona con una pobre supervivencia global de los pacientes con CPNM (rango
P = .074
log). B. curvas de supervivencia de Kaplan-Meier mostraron que cuando CDC25A
en peso es mayor en tumor frente par tejido normal, se correlaciona con una mejor supervivencia global (log rank
P = 0,0018
). La cuantificación relativa de gen diana "CDC25A
wt" en NSCLC tejido tumoral con respecto al par de tejido normal de pacientes de NSCLC de acuerdo con la fórmula: 2
-ΔΔct. CDC25A plantilla del tumor o normal se llevó a cabo por triplicado de reacción uniplex para cada uno de los Ct
ensayos tot
wt y TC, y la media se calculó para cada ensayo.
Discusión
nivel CDC25A está estrechamente regulada de manera que la progresión del ciclo celular y la transición puesto de control se mantiene en condiciones fisiológicas [20], [26], [31] - [35]. Anteriormente, se informó de que CDC25A es a menudo sobreexpresado en NSCLC en el nivel de la transcripción [7]. En este estudio, se presenta la identificación de una nueva isoforma CDC25A, Q110del CDC25A
, como resultado de un empalme de ARN alternativo. Se encontró que CDC25A
Q110del se expresó en la mayoría de las líneas celulares de cáncer, así como los tumores primarios. Además, la búsqueda de tejidos que histológicamente normales adyacentes al cáncer frecuentemente expresan CDC25A
Q110del implica que este es un evento temprano y puede desempeñar una función biológica importante en la tumorigénesis pulmonar.
CDC25A
carece de un Q110del glutamina en la posición 110 que está adyacente a 2 sitios conservados de serina de fosforilación en las posiciones 116 y 124 (Fig. 1). S116 puede ser fosforilada por Cdk1 para estabilizar CDC25A en la mitosis a través de un bucle de retroalimentación positiva, mientras S124 puede ser fosforilada por Chk1, Chk2, y MAPKAPK-2 para acelerar la renovación CDC25A [11], [14], [27], [36] . irradiación ionizante puede inducir la fosforilación de S124 a través de Chk1 y Chk2 quinasas [37], [38]. En un modelo animal transgénico con S124 sustituido por una alanina, CDC25A se encontró situado en centrosomas y que los niveles Cdc25A no se redujeron después de la irradiación ionizante [39]. En este estudio, hemos observado que CDC25A
Q110del tiene una proteína de vida media prolongada de CDC25A
en peso, sobre todo después de la irradiación UV, lo que sugiere que CDC25A
expresión Q110del puede afectar la respuesta celular al daño inducido por la radiación ionizante . Consistente con esta noción, se encontró que las células transfectadas con CDC25A
Q110del son resistentes a UV inducida por la muerte celular de las células transfectadas con control de vector o CDC25A
wt (Fig. 3E), consistente con una activación más profunda de Cdk1 (Fig. 4D).
fosfatasa CDC25A se regula principalmente a través de la degradación de proteínas [8], [21], [31]. La fosforilación de serina o treonina residuos específicos de las proteínas quinasas, principalmente Chk1, p38 y GSK-3β, sean necesarias para su proteólisis mediada por ubiquitina [22], [37], [40], mientras que la fosforilación en S18 y S116 por CDK1 puede estabilizar CDC25A [11]. La fosforilación regula también el secuestro de CDC25A por 14-3-3 proteínas [41]. En nuestro estudio, hemos observado que la proteína CDC25A
Q110del tiene una baja tasa de rotación, incluso después de la irradiación UV (Fig. 3B y 4B), y la acumulación nuclear más. Dos posibilidades que pueden explicar estas observaciones. En primer lugar, la supresión Q110 en el polipéptido puede producir cambios significativos conformacionales en las inmediaciones y /o una región vecina, alterando la afinidad de unión con sus quinasas, lo que lleva a una baja tasa de rotación de CDC25A
Q110del. En segundo lugar, CDC25A
Q110del proteína puede tener una capacidad diferente a la de transporte entre compartimentos citoplásmicos y nucleares a través de las proteínas 14-3-3 [42]. La secuencia de aminoácidos que precede inmediatamente a Q110, RRIHSLP, constituye un consenso 14-3-3 sitio de unión, (R) RxxSxP [43]. Desde la unión de 14-3-3 con su diana depende de la fosforilación y está influido por el contexto de secuencia, esto plantea la interesante posibilidad de que una proteína quinasa desconocido puede fosforilar este sitio e influir en el tráfico de CDC25A. Estos hallazgos tienen potencial importancia en el contexto de la resistencia al daño del ADN en las células con la expresión ectópica CDC25A
Q110del (Fig. 3E). será necesaria una investigación adicional para determinar si los tumores con mayor CDC25A
Q110del son más resistentes a agentes que dañan el ADN o la radioterapia y si la orientación CDC25A
Q110del sensibilizará estos tumores a estos tratamientos [44].
una observación interesante es la expresión de CDC25A
Q110del en los tejidos pulmonares que aparecen normales adyacentes a CPNM, a veces con gran abundancia, lo que sugiere la anormalidad es un evento temprano en la carcinogénesis pulmonar [44].