Extracto
Hedgehog (Hh) de señalización juega un papel esencial en diversos procesos de desarrollo, y sus resultados aberrantes regulación en los trastornos genéticos o enfermedades malignas en varios tejidos. Hiperactivación de la señalización de Hh se asocia con el desarrollo del cáncer de pulmón, y no ha habido grandes esfuerzos para investigar cómo controlar vía de señalización Hh y regular la proliferación de células cancerosas. En este estudio se investigó el papel de CDO, un co-receptor Hh, en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La inhibición de la señalización de Hh por SANT-1 o siCDO en células de cáncer de pulmón reduce la proliferación y tumorigenicidad, junto con la disminución de la expresión de los componentes de Hh. El análisis histológico con tejido de ratón NSCLC demostró que CDO se expresó en grado avanzado de cáncer, y precisamente co-localizada con GLI1. Estos datos sugieren que la CDO es necesaria para la proliferación y supervivencia de células de cáncer de pulmón a través de la señalización de Hh
Visto:. Leem YE, Ha NS, Bae JH, Baek KH, Kang JS (2014) CDO, un HH-Coreceptor , media la proliferación de células de cáncer de pulmón y tumorigenicidad través de la señalización de Hedgehog. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10.1371 /journal.pone.0111701
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2014; Aceptado: 1 de octubre de 2014; Publicado: 4 de noviembre de 2014
Derechos de Autor © 2014 Leem et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvención financiado por el Gobierno de Corea (MSIP) (2012R1A1A2005448 a YEL) y (NRF-2011 a 0.017.315 de JSK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vía de señalización Hh es una de las vías de señalización esenciales, que está implicado en el desarrollo embrionario, la morfogénesis y la proliferación [1], [2], [3], [4], [5], [6]. El mecanismo molecular cómo regular la señalización de Hh está aún bajo investigación. Generalmente, una vez Hh ligando se une a su receptor primario, Patched 1 (PTCH1), Smoothened (SMO) es liberado de la inhibición mediada por PTCH1 y migra a cilio primario. La estimulación de SMO desencadena la transducción de señal secuencial que activa los factores de transcripción de la familia GLI. La forma activa de la proteína GLI se transloca en el núcleo y regula la expresión de los genes diana, incluyendo PTCH1 y GLI1 [1], [7], [8].
La pérdida de la señalización de Hh durante el desarrollo embrionario se asocia con varios trastornos genéticos, incluyendo holoprosencefalia, que es la malformación más común del cerebro anterior [9], [10], [11]. Por el contrario, la activación constitutiva de la señalización de Hh se ha conocido por estar involucrado en la iniciación y la progresión de varios tipos de cáncer en la piel de (carcinoma de células basales esporádico, BCC), cerebro (meduloblastoma), muscular (rabdomiosarcoma, RMS), tracto gastrointestinal, próstata, páncreas y de pulmón [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . El enlace de la vía de Hh a la carcinogénesis se informó inicialmente en el síndrome de Gorlin en el que la mutación en el
PTCH1
gen es responsable de la incidencia del cáncer [24]. Por otra parte, la regulación al alza aberrante de Hh señalización a través de la pérdida de PTCH1 o la mutación de ganancia de función en
SMO
se ha estudiado extensamente en BCC y meduloblastoma [13], [14].
la importancia de la señalización de Hh en la carcinogénesis también se exploró en la proliferación de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), que es un cáncer de pulmón altamente agresivo que constituyen aproximadamente el 20-25% de todos los cánceres de pulmón [21]. La inhibición de la actividad de la señalización de Hh mediante antagonista SMO, ciclopamina resultó en la reducción del crecimiento grave en las líneas celulares de SCLC [21], [23], [25], [26]. Considerando que, en un principio se sugirió que la señalización de Hh se asocia menos con NSCLC, el tipo más dominante de cáncer de pulmón y el cáncer más letal. Sin embargo, varias evidencias han indicado que recientemente NSCLC depende de la actividad de señalización Hh en la proliferación, así [27], [28], [29], [30].
Aunque el principal receptor contra Hh es PTCH1, hay co-receptores adicionales que asisten a la señalización de Hh positivamente, tales como CDO, BOC y GAS1 [31], [32], [33], [34], [35]. señalización Hh está implicada en diversos procesos celulares y de desarrollo, y por consiguiente que las estrictas regulaciones son absolutamente necesarios para la señalización de reconocer y controlar micro-variaciones en el entorno celular. Mientras tanto, muchas líneas celulares de cáncer de pulmón están produciendo varios niveles de Hh ligando [25], [30]. Incluso si un bajo nivel de ligando Hh se ve en algunas células de cáncer de pulmón, estas células muestran el aumento de la Hh expresión del gen diana implica la regulación positiva de la señalización de Hh. En estas circunstancias, la presencia de co-receptores Hh puede contribuir a la amplificación de la señal extracelular débil en células de cáncer, además del ajuste fino de la señalización de Hh durante la embriogénesis.
Entre los co-receptores, CDO es una proteína transmembrana que pertenece a la inmunoglobulina (Ig) /fibronectina tipo III (FNIII) superfamilia y juega un papel importante en la diferenciación muscular, el desarrollo embrionario y la diferenciación neuronal [36], [37], [38], [39]. El análisis estructural demuestra que las repeticiones de fibronectina en el dominio extracelular de CDO es crítica para Hh de unión [39]. La regulación positiva de la vía de señalización Hh por CDO se identificó inicialmente en
Drosophila
. Se ha sabido que ihog (ortólogo de CDO en
Drosophila
) junto con boi (ortólogo de BOC en
Drosophila
) es importante para la activación de la señalización de Hh en el desarrollo de ala imaginal discos [ ,,,0],40], [41]. En ratones, la deficiencia de Cdo exhibe múltiples defectos congénitos, incluyendo holoprosencefalia, que es el defecto comúnmente, asociado con mutaciones en la señalización de Hh [39], [42]. Además, CDO está implicado en el patrón neural ventral mediada por Hh del tubo neural de mamífero [31] y, así como en la proliferación mediada por células Hh en progenitores gránulo de neuronas del cerebelo (CGNPs) [43].
Además al papel de CDO en el desarrollo de órganos y la diferenciación celular, la asociación de CDO a la señalización de Hh, que está implicado en la tumorigénesis nos intrigado para dilucidar el papel de CDO en la proliferación celular del cáncer de pulmón. En el presente estudio hemos tratado de descubrir la contribución de CDO para Hh señalización en NSCLC y, además, a la proliferación y tumorigenicidad de células tumorales de pulmón. Se encontró que el nivel de CDO fue mayor en células de NSCLC, y que la inhibición de la expresión CDO downregulated de señalización Hh, y la reducción de proliferación y la tumorigénesis en células de cáncer de pulmón humano. Además, se observó expresión CDO en la etapa avanzada de tejidos de NSCLC. Tomados en conjunto, todos los datos sugieren que CDO, como un co-receptor para Hh, es crucial para la proliferación de células cancerosas y la tumorigenicidad, y por lo tanto puede ser considerado como un buen candidato para aplicaciones terapéuticas contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células y reactivos
líneas de células BEAS-2B y NSCLC, A549, H1299, H460 y H520 fueron amablemente proporcionados por el Prof. DH Kim (Universidad de Sungkyunkwan, Samsung Instituto de Investigación Biomédica, Corea) [44]. La cultura de BEAS-2B siguieron las directrices del ATCC. células de NSCLC se cultivaron en un incubador humidificado con 5% de CO
2 en un medio RPMI-1640 (Invitrogen) con suero bovino fetal al 10% (FBS), complementado con penicilina y estreptomicina. Para la medición de la expresión de ARNm /proteína o la muerte celular en las células transfectadas con siCDO, el medio se cambió a medio RPMI-1640 con FBS al 0,5% un día después de la transfección, y las células transfectadas se cultivaron durante 2 días más. 50 M de SANT1 (S4572, Sigma-Aldrich) disuelto en DMSO o el volumen correspondiente del vehículo DMSO se trató a las células cultivadas en medio RPMI-1640 que contenía 0,5% de SFB en el punto de tiempo indicado.
experimentos de interferencia de ARN
Cada línea celular se transfectó con NSCLC siCDO utilizando reactivo Lipfectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las siguientes secuencias se utilizaron como siRNA contra CDO. siCDO#1, sentido, 5'-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 ', antisentido, 5'-ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3'. siCDO#2, sentido, 5'-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 ', antisentido, 5'-UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU'. Para
in vivo en el ensayo de
tumorigenicidad, las células A549 que expresan de forma estable los pequeños ARN de horquilla (shRNA) contra el CDO se prepararon mediante la transfección con pSuper-puro-shCDO. pSuper-puro-shCDO vector se informó anteriormente [42].
preparación de ARN total y en tiempo real QRT-PCR
El ARN total se aisló utilizando el kit de extracción de ARN total easyBLUE (Intron Biotechnology Inc. , Corea), y se sintetizó ADNc utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT (TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En tiempo real QRT-PCR se realizó utilizando SYBR Premezcla ExTaq kit (Takara, Japón) y el sistema de Thermal Cycler tiempo real Dice (TP800, TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El avance (F) y atrás primers (R) utilizado en este estudio se enumeran a continuación.
SHH
F, 5'-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 ', R, 5'-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3';
PTCH1
F, 5'-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 ', R, 5'-TCTGATGAACCACCTCCACA-3';
GLI1
F, 5'-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 ', R, 5'-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3';
CDO
F, 5'-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 ', R, 5'-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3';
18S rRNA
F, 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ', R, 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'. Cuantificación relativa de una expresión de genes se describe como pliegue de los cambios relativos en los niveles de ARNm en comparación con un control, utilizando la 2
-ΔΔCt ecuación, [ΔΔCt = Ct (gen diana) -ΔCt (gen de referencia)]. 18S rRNA se utilizó como gen de referencia.
proliferación celular y viabilidad de ensayo
Las células se sembraron a una concentración de 5 x 10
3 o 1 × 10
4 células por 96 pocillos y se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 0,5% de FBS. Trypsinized células se tiñeron con solución de azul de tripano (TB), y se contaron las células viables no manchados. Para el ensayo de MTT, 20 l de 5 mg /ml de MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] bromuro de 2,5-difeniltetrazolio) se añadió a 5 × 10
3 o 1 × 10
4 células por 96 pocillos. Después de 4 horas de incubación a-37 ° C, la sopa de cultivo se cambió a 200 l de DMSO. La absorbancia se midió a 595 nm. Para el ensayo de BrdU, las células se cultivaron con 10 mM bromodesoxiuridina (BrdU, Sigma-Aldrich Corp.) durante 1 hr. Las células fijadas por PFA al 4% se probaron con anticuerpo anti-BrdU (Chemicon International Inc.). La fluorescencia se detectó por Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón (Molecular Probe).
La citometría de flujo ensayo de la apoptosis
La apoptosis se midió mediante el uso de ApoScan Anexina V FITC kit de detección de apoptosis (BioBud, Corea ) y el flujo BD FACS citómetro CANTO II (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Western blot
se realizaron análisis de Western blot como se describe anteriormente [37]. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se enumeran a continuación; Escindido Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (sc-81663, Santa Cruz), Cdk2 (sc-6248, Santa Cruz), ciclina D1 (sc-246, Santa Cruz), ciclina E (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Corea), p21 (sc-6246), p27 (ab7961, Abcam).
formadoras de colonias ensayo
Cinco mil de las células se mezclaron suavemente con 10% de FBS RPMI-1640 medio que contiene 0,35% de agarosa. La mezcla superpuesta sobre la parte inferior de agarosa al 0,5% con medio FBS al 10% en placas de 6 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37 ° C en una incubadora humidificada durante 3 semanas con la alimentación de medio de cada segundo día. La formación de colonias se visualizó con 0,01% de cristal violeta y se analizaron con un microscopio de disección. La cuantificación del número de colonias por campo se determinó usando ImageJ. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces
En viv sobre O tumorigenicidad ensayo
5 × 10
6 del mando (pSuper-puro) -. O células A549 transfectadas con pSuper-puro-shCDO se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de 6 a 8 semanas de edad, los ratones hembra desnudos. El volumen del tumor se midió cada 4 días, y se calcula como se describe [45]. Todos los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Internacional de Animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Escuela de Medicina SKKU (SUSM). SUSM es una Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) instalación acreditada internacional y se rige por el Instituto de Investigación Animal de Laboratorio (ILAR) guía.
Los ratones e inmunohistoquímica
LSL-K-ras
G12D
ratones fueron proporcionados por el doctor Tyler Jacks (MIT Centro de cáncer) [46], [47]. Las secciones de parafina de
LSL-K-ras
G12D
ratones fueron immunoreacted con 2B3 (ascitis de ratón contra CDO) y anticuerpo anti-GLI1 (1:100; ab49314, Abcam), y se detectaron mediante inmunofluorescencia. La microscopía confocal se realizó en la Facultad de Medicina SKKU del Fondo de Microscopía de recursos compartidos con Zeiss LSM-510 microscopio confocal Meta. Todos los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Internacional de Animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Escuela de Medicina SKKU (SUSM). SUSM es una Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) instalación acreditada internacional y se rige por el Instituto de Investigación Animal de Laboratorio (ILAR) guía.
El análisis estadístico
Se realizaron análisis estadísticos utilizando
t de Student
. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes y consideraron significativas cuando
valores de p
eran & lt; 0,05 (*) o. & Lt; 0,01 (**)
componentes Hh, que están involucrados en la proliferación de células de cáncer de pulmón fueron inhibidos por el agotamiento CDO en NSCLCs
literaturas anteriores han demostrado que CDO actúa como un receptor para el ligando accesorio Hh y regula positivamente la señalización Hh [39] , [48]. El cerrar relevancia de la activación de la señalización de Hh a la proliferación de células de cáncer nos llevó primero en probar la expresión en las células NSCLC CDO. Para ello, ARN totales se aislaron de A549, líneas celulares H1299, H460 y H520 de NSCLC, así como de células de pulmón no canceroso humano BEAS-2B, y se utilizan para el análisis de expresión CDO haciendo tiempo real QRT-PCR. El resultado mostró que CDO se expresó más alta en el A549, las células H1299 y H520 que BEAS-2B embargo H460 revelaron relativamente más bajo nivel de CDO (Figura 1A). Además, se determinó la expresión de los componentes de señalización Hh en células de NSCLC mediante la realización en tiempo real QRT-PCR. La mayor expresión de SHH se observó en las cuatro líneas celulares de NSCLC que en el pulmón de células no cancerosas. Del mismo modo, los genes diana aguas abajo de la señalización de Hh, y PTCH1 GLI1 se expresaron mayor en esas células de NSCLC (Figura 1A). A549 mostró relativamente más bajo nivel de ligando Hh, en comparación con otras líneas celulares, sin embargo reveló el aumento de Hh expresión del gen diana (PTCH1 y GLI1). En H520, CDO, SHH y PTCH1 se expresaron comparativamente más alto que cualquier otro líneas celulares pero la expresión GLI1 era bastante bajo.
A. En tiempo real QRT-PCR para los niveles de expresión de CDO y los componentes de señalización Hh (SHH, PTCH1 y GLI1) en líneas celulares de cáncer (A549, H1299, H460 y H520) BEAS-2B y. Cada nivel de expresión se normalizó al nivel de 18S rRNA. Se determinó la cantidad relativa de cada componente en NSCLC como la cantidad de cada uno en BEAS-2B se ajustó a 1,0. B. El número de células viables se determinó por recuento celular en el tiempo indicado en A549, H1299, H460 y H520 tratados con o sin 50 mM SANT1. C. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT en el momento indicado en A549, H1299, H460 y H520 tratados con o sin 50 mM SANT1. La absorbancia se midió a 595 nm. D. RT-PCR para CDO en el A549, H1299 y H460 transfectadas con el ARNsi revueltos o siCDO#1. E. En tiempo real QRT-PCR para componentes de señalización Hh en el A549, H1299 y H460 transfectadas con el ARNsi revueltos o siCDO. El nivel de expresión de cada componente se normalizó al nivel de 18S rRNA. La cantidad relativa de cada componente en NSCLC empobrecido en CDO se determinó como la cantidad de cada una de las células de control se estableció a 1,0 (línea roja). Todos los valores representan las medias de determinaciones por triplicado al menos ± 1 SD. *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & Lt; 0,01
Se determinó en primer lugar el efecto inhibidor de SANT1 en la señalización Hh mediante el examen de la expresión de Hh señalización genes diana después del tratamiento SANT1. SANT1 se une directamente al SMO, impidiendo la señalización. ARN total aislado de DMSO o A549 tratada SANT1, H1299 y H460 se utilizaron para el análisis de PTCH1 y expresiones GLI1 por tiempo real QRT-PCR. Como se predijo, la adición de SANT1 resultó en una reducción de PTCH1 y expresiones Gli1 (Figura S1 en File S1). Con el fin de determinar el efecto de la señalización de Hh en la proliferación de NSCLC, inhibimos señalización Hh en el A549, H1299, H460 y H520 mediante el uso de SANT-1. A continuación, el recuento de células TB y el ensayo de MTT se realizaron para analizar la proliferación celular y la viabilidad. Los datos mostraron que la adición de 50 mM SANT1 resultó en una reducción significativa en el crecimiento celular y la viabilidad de las cuatro células de NSCLC individuales (Figura 1B y C). El efecto de la inhibición mediada por SANT1 era más fuerte en puntos de tiempo finales. Estos datos indican que las células de NSCLC probados requieren actividad de señalización Hh para retener su proliferación.
A continuación, se preguntó si CDO contribuyó a la actividad de la señalización de Hh en NSCLC. Para determinar que, transfectadas tres líneas celulares de cáncer diferentes, A549, H1299 y H460 con siCDO o el ARNsi revueltos y evaluamos el efecto de la deficiencia de CDO en las expresiones de los componentes de señalización Hh por tiempo real QRT-PCR. La expresión de CDO se redujo sustancialmente con siCDO en todas las líneas celulares (Figura 1D). Para agotar la expresión CDO, hemos utilizado dos diferentes secuencias de siRNA, siCDO#1 y#2. Ambos siCDOs mostraban el agotamiento similares CDO y los resultados (datos no mostrados), y que están presentando los datos de siCDO#1. Los niveles de los componentes de señalización Hh, SHH, PTCH1, y GLI1 se redujeron significativamente en células de cáncer de pulmón CDO-agotado en comparación con el control mezclado (Figura 1E). Estos datos indican que CDO actúa como un regulador positivo de la señalización de Hh en células de NSCLC, con independencia de su nivel de expresión.
agotamiento CDO condujo a una inhibición de la proliferación y la inducción de la apoptosis en NSCLCs
como se muestra en la Figura 1B y C, se observó que la proliferación de células de NSCLC era bastante sensible a SANT1. Por lo tanto, decidimos determinar el efecto de la baja regulación de la señalización de Hh por CDO caída en la proliferación de células cancerosas. Para ello, se evaluó la tasa de proliferación celular de A549, H1299, H460 y H520 en condiciones CDO-agotado realizando el recuento de células TB y el ensayo de MTT (Figura 2 A y D). El resultado mostró que CDO caída en todas las células de NSCLC examinados disminuye considerablemente el número de células y la viabilidad, en comparación con el control mezclado. Sin embargo, el alcance de la reducción proliferación no fue más fuerte que en el tratamiento SANT1 (comparar Figura 2A y D a la Figura 1B y C, respectivamente). La pendiente de los gráficos para el número de células y la viabilidad en las células cancerosas CDO-agotado todavía siguió aumentando en día ya punto de tiempo 5, en comparación con la de SANT1 tratamiento a pesar de que los niveles eran absolutamente mucho más bajo que los de las células de control revueltos. Para evaluar el efecto del agotamiento del CDO en la proliferación adicional, se realizó ensayo de incorporación de BrdU. El resultado mostró que CDO caída en células de NSCLC llevó a 20-40% de disminución en la proliferación celular (Figura 2B).
A. El número de células viables se determinó por recuento de células en el momento indicado en el control- o A549 empobrecido en CDO, H1299, H460 y H520. B. La proliferación celular de CDO A549 desmontables, H1299, H460 y H520 se determinó la incorporación de BrdU. El análisis de transferencia Western C para la expresión de los reguladores del ciclo celular (ciclina D1, ciclina E y CDK2), represores (p27 y p21) y marcadores de apoptosis (caspasa 3 escindida y se escindió de caspasa 9) en el control o células A549 CDO desmontables. GAPDH se utilizó como control de carga. D. ensayo de MTT para la viabilidad celular del o de control A549 transfectadas-siCDO, H1299, H460 y H520 en el momento indicado. La absorbancia se midió a 595 nm. E. Anexina apoptosis y citometría de flujo análisis con A549, H1299, H460 y H520 transfectadas con el ARNsi revueltos o siCDO V-FITC. Todos los valores representan las medias de determinaciones por triplicado al menos ± 1 SD. *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & Lt; 0,01
La disminución de la proliferación celular y la viabilidad de las células de NSCLC CDO-empobrecido podría ser debido a la progresión del ciclo celular reducido y /o muerte celular mejorada. Para comprobar los niveles de expresión de /represores, células A549 reguladores del ciclo celular transfectadas con el revueltos o siCDO se examinaron para inmunotransferencia. Como resultado, se redujeron los niveles de proteína de los reguladores del ciclo celular (ciclina D1, ciclina E, y CDK2), mientras que las expresiones de inhibidores de Cdk (p27 y p21) fueron elevados en células A549 tratadas con siCDO en comparación con las células tratadas revueltos- (Figura 2C). Estos datos indican que la inhibición de la expresión de CDO parece causar la detención del ciclo celular en células de NSCLC.
Entonces, nos preguntamos si la depleción de CDO también se asoció con la muerte celular. La inmunotransferencia contra las formas escindidas de la caspasa-9 y -3 mostró que estos factores apoptóticos se detectaron más fuerte en A549 transfectadas con siCDO que en el control (Figura 2C). En consonancia, la citometría de flujo para la apoptosis perfil con el A549, H1299, H460 y H520 mostraron que un mayor porcentaje de anexina-V y las células doble positivas PI se encontró en cuatro NSCLC CDO-agotado individuales (Figura 2E). Por lo tanto, estos datos sugieren que la disminución de la proliferación de NSCLC en el agotamiento del CDO es debido al aumento de la muerte celular, así como la progresión del ciclo celular atenuada.
inhibición de la expresión CDO en NSCLCs mostró la reducción de
in vitro
y
in vivo
tumorigenicidad
la proliferación celular disminuida en CDO caída nos llevó a investigar la influencia de agotamiento de CDO de características malignas de las células NSCLC. Para ello, se evaluó el grado de formación de colonias de células A549 transfectadas con siCDO, H1299, H460 y H520 células en agar blando (Figura 3A y B). El resultado muestra una marcada reducción en la clonogenicidad
in vitro
cuando el nivel de CDO se redujo.
A. La formación de colonias del control o CDO desmontables A549, H1299, H460 y H520 en agar blando. B. Análisis cuantitativo del experimento descrito en el número de colonias por A. campo se determinaron mediante ImageJ. Los valores representan las medias de determinaciones por triplicado ± 1 SD. *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p Hotel & lt; 0,01. C. Representante crecimiento del tumor 50 días después de la inyección subcutánea de ratones desnudos con el control o las células A549 tratadas con shCDO. D. El volumen de los tumores de los ratones desnudos con el A549 de control (n = 8) o A549 CDO-empobrecido (n = 10) se describe en C. Medios se muestran como barras de error. E. Los tumores de los ratones desnudos inyectados con el A549 de control o células A549 CDO-agotado se muestra en C.
Con el fin de apoyar a los datos de
in vitro
tumorigenicidad, hemos preparado línea celular estable de A549 expresar shRNA contra el CDO, y inyectaron por vía subcutánea el control o las células agotadas en CDO a los costados de ratones desnudos. El tamaño del tumor se midió periódicamente. Como se muestra la figura 3C, D, y E, se observó una disminución significativa en el crecimiento del tumor en ratones desnudos inyectados con A549 CDO-caída. En conjunto, estos datos indican que se requiere CDO para la
in vivo
crecimiento de las células de NSCLC.
CDO expresión se detectó con GLI1 juntos en estadios avanzados de NSCLC
Para determinar CDO expresión durante la progresión del cáncer de pulmón, que aprovechó un modelo de ratón de NSCLC,
LSL-K-ras
G12D
ratones [46], [47]. En caso de inhalación intranasal de Ad-Cre para inducir la tumorigénesis de pulmón espontánea en
LSL-K-ras
G12D
ratones, se evaluó la expresión de CDO en el tejido tumoral de pulmón que muestra cuatro grados individuales de la progresión del tumor mediante técnicas de inmunohistoquímica fluorescente. expresión CDO fue casi indetectable en el grado-1, que es una etapa temprana de la progresión del tumor con hiperplasia atípica adenomatosa (AAH) o pequeño adenoma (Figura S2 en File S1). Sin embargo, su expresión se enriqueció como la progresión del tumor ha avanzado. En el grado-2, en el que se detectan adenomas grandes con un poco de núcleos grandes, se observó expresión CDO en el citoplasma de las células en las lesiones tumorales, y esta alta expresión se mantuvo hasta el grado-3 (Figura 4). Como los tumores progresaron a ser adenocarcinomas invasivos (grado-4), la expresión fue algo CDO disminuyó y se detecta en la membrana celular. La expresión de CDO en las lesiones tumorales nos llevó a investigar la expresión de componentes de la ruta Hh en el tejido tumoral. imágenes confocal de inmunofluorescencia mostraron que GLI1, uno de los factores de señalización Hh se colocalized con CDO, y, además, su expresión fue también altamente observa en lesiones de grado-2 y -3 de tumores, no en el grado-4 (Figura 4). La deficiencia de expresión GLI1 en el grado-4 se corresponde con los resultados sugeridos por varios estudios anteriores [23], [29]. Los resultados de estos experimentos indican que la expresión CDO puede correlacionarse con la sobre regulación de la señalización de Hh en lesiones tumorales y CDO también está probablemente relacionado con la progresión de tumor de pulmón, no en la iniciación del tumor
.
detección de inmunofluorescencia confocal de CDO (rojo) y GLI1 (verde) en el grado-2, -3, y -4 tejidos tumorales de pulmón de
LSL-K-ras
G12D
modelo. Los núcleos celulares se visualizaron por DAPI (azul) y las imágenes de contraste de fase se muestran. La barra de escala indica 50 micras.
Discusión
De hecho, la importancia de CDO en la proliferación de células de cáncer era algo descubierto y se hace referencia anteriormente. Hayashi
et al.
[49] hizo un esfuerzo para descartar a los genes que codifican proteínas transmembrana, que son altamente expresado en líneas celulares de cáncer de próstata. Entre los candidatos, se centraron en el 83% de cáncer de próstata CDO-sobreexpresado, y demostraron que la reducción de la apoptosis inducida por la expresión de CDO y la invasión celular inhibida en el cáncer de próstata. Sin embargo, no se explica el mecanismo molecular de cómo CDO está implicado en la proliferación de células de cáncer de próstata. En este estudio, se reveló que la puesta a punto y sobre regulación de la señalización de Hh por CDO es muy necesario para la proliferación celular en el cáncer de pulmón. Estamos, además, observamos que el nivel de ARNm de CDO en las líneas celulares de cáncer de pulmón probados, excepto H520 fue mayor que en BEAS-2B, pero no fue significativa. Particularmente nivel CDO mRNA en A549 era aproximadamente 1,7 veces mayor que el nivel basal de la misma en BEAS-2B. A pesar de que el aumento no es dramáticamente alta, es digno de mención, si tenemos en cuenta que la expresión CDO se encuentra generalmente durante el desarrollo y la embriogénesis, y apenas se detectó en tejidos adultos [36].
Se supuso inicialmente que Hh señalización rara vez estaba vinculada con CPNM porque Hh y GLI1 se observaron en un nivel relativamente bajo en NSCLC. Desde entonces, los datos, incluyendo los datos actuales, de la inhibición de la proliferación de NSCLC por un antagonista SMO sugieren que la activación de la señalización de Hh a través del bajo nivel de Hh es, sin duda asociada con la tumorigénesis en NSCLC. Bajo esta circunstancia CDO puede jugar un papel crítico como un sensor de ligando para una pequeña cantidad de Hh, apoyando el receptor principal, PTCH1 y después de todo induce la activación de la señalización de Hh.
Mientras tanto, la función de CDO en la celda la proliferación parece ser ambivalente dependiendo del nivel de Hh. Delloye-Bourgeois
et al.
[50] sugirió recientemente que, el nivel de Hh es importante para CDO para funcionar como un receptor de la dependencia, que está estrechamente relacionado con la inducción de la señal de proapoptótico. De acuerdo con ellos cuando Hh ligando es bastante limitado, la caspasa 3/9 son reclutados al sitio de escisión de la caspasa en el dominio intracelular de CDO y evocan la escisión proteolítica. Esta escisión mediada por caspasa, finalmente desencadena la apoptosis. El papel de CDO como un receptor dependencia básicamente entra en conflicto con la función de CDO en las células de cáncer con expresión Hh, lo que hemos descubierto en este estudio. Por lo tanto, el nivel adecuado de Hh ligando parece ser esencial para determinar la función de CDO como un regulador positivo de la señalización de Hh o un receptor de dependencia.
La inhibición de la señalización de Hh por SANT1 en todas las células de NSCLC mostró una reducción más sustancial de la proliferación celular y la viabilidad en el punto de tiempo más largo, en comparación con la inhibición por el agotamiento del gen CDO (comparar Figura 1B y C a la Figura 2A y D, respectivamente). El efecto limitado de CDO caída en la inhibición de la proliferación celular puede deberse a que los otros co-receptores Hh, tales como BOC y GAS1 todavía se expresan y activa, a pesar de que no podemos descartar la posibilidad de que el agotamiento de CDO transitoria con siRNA. Se ha demostrado que todos los co-receptores Hh, CDO, BOC, y GAS1 se requieren colectivamente para la activación completa de la señalización de Hh. CDO, BOC y GAS1 individualmente hacer un complejo con PTCH1 y la formación de los complejos es crítica para la proliferación mediada por CGNP Hh [43]. Basado en esto, la comprensión de los papeles de BOC y GAS1 durante la tumorigénesis mediada por Hh sería necesario más tarde.
detección de la expresión CDO en lesión tumor de alto grado de modelo de ratón NSCLC, no en la lesión de grado-1 , excitado nuestra curiosidad sobre el papel de la señalización de Hh CDO mediada en la progresión tumoral. Se ha sugerido que dominantemente la sobre regulación de la señalización de Hh parece estar correlacionado con el grado del tumor aunque es controvertido en algunos tipos de cáncer. En el cáncer de próstata, los niveles de mRNA de SHH, PTCH1 y GLI1 fueron muy elevados en las etapas más avanzadas del cáncer, y todos esos componentes están estrechamente vinculados con puntuación de Gleason [51]. Por otro lado, Gialmanidis
et al.
[29] secciones de tejido pulmonar embebidos en parafina han analizado inmunohistoquímica de 80 pacientes con CPNM. Ellos encontraron que la activación de la señalización de Hh se asoció con el grado del tumor, y la alta activación de la señalización se detectó principalmente en bien diferenciadas y los tumores moderadamente diferenciados. La expresión robusta de CDO en el alto grado de tumor puede conducir a la posibilidad de que CDO como un regulador positivo regula y da lugar a la activación aberrante de la señalización de Hh en el desarrollo y progresión del tumor.
Hasta ahora, los esfuerzos para encontrar terapias contra el cáncer se han dirigido principalmente SMO, y de hecho varios inhibidores de SMO han estado aplicando a la clínica [52]. La expresión de CDO se restringe generalmente en el desarrollo y la embriogénesis, no en la etapa adulta. La expresión anormal de CDO en la condición cancerosa es, posiblemente asociado con la proliferación celular aberrante.