Extracto
sobreexpresa CEACAM6 en los tejidos tumorales juega un papel importante en la invasión, metástasis y la resistencia a la anoikis en una variedad de cánceres humanos. Recientemente hemos informado de que la expresión CEACAM6 está regulada positivamente en el cáncer gástrico tejidos (GC) y promovido la metástasis GC. En este caso, nos informan de que CEACAM6 promueve la metástasis peritoneales
en
in vivo
y se correlaciona negativamente con la expresión de E-cadherina en los tejidos GC. Sobreexpresada CEACAM6 inducida transición epitelio-mesenquimal (EMT) en el GC, según lo medido por los aumentos en los marcadores de EMT N-cadherina, vimentina y Slug, mientras que la expresión de E-cadherina se redujo en las células que sobreexpresan GC CEACAM6; resultados opuestos se observaron en las células CEACAM6 silenciados. Por otra parte, la expresión de E-cadherina se correlacionó negativamente con la profundidad de la invasión tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio TNM en los tejidos GC. Además, la actividad CEACAM6 elevada metaloproteinasas de matriz-9 (MMP-9) en el GC, y el anticuerpo anti-MMP-9 podrían revertir la creciente invasión y la migración inducida por CEACAM6. CEACAM6 también aumentó los niveles de AKT fosforilada, que está implicado en la progresión de una variedad de tumores humanos. Se observó además que LY294002, un inhibidor de PI3K, podría revertir la EMT inducida por CEACAM6 través de la transición mesenquimal-epitelial. Estos hallazgos sugieren que CEACAM6 mejora la invasión y metástasis en GC mediante la promoción de EMT a través de la vía de señalización de PI3K /AKT
Visto:. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 promueve el cáncer gástrico invasión y metástasis mediante la inducción de la transición epitelio-mesenquimal a través de PI3K /AKT vía de señalización. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10.1371 /journal.pone.0112908
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 7 Agosto, 2014; Aceptado: 16 de octubre de 2014; Publicado: 14 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Zang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172324, Nº 91229106, Nº 81272749, 81372231 y N º), y Proyecto clave del Comité de Educación de Shanghai (núm 12ZZ105 y No.12ZZ102) y la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (núm 13ZR1425600). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GC es uno de los tumores malignos más comunes y un importante problema de salud en todo el mundo, especialmente en países del Este de Asia, como Japón, Corea, china, donde es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer [1] - [3]. Carcinoembrionario molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno-6 (CEACAM6) es un glicosilfosfatidilinositol (GPI) miembro de la superfamilia de inmunoglobulina -vinculada que se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos, especialmente cáncer gastrointestinal [4], y funciona como una molécula de adhesión intercelular [4] - [6]. Aunque CEACAM6 es una superficie celular anclada a GPI que carece de una glicoproteína transmembrana o dominio intracelular, pero es capaz de influir en los acontecimientos de señalización intracelulares y juega un papel importante en la progresión del cáncer gastrointestinal [4], [6] - [8]. moléculas ancladas a GPI a menudo se co-localizan en pequeñas microdominios de membrana en la membrana plasmática [9], que puede activar cascadas de señalización aguas abajo tales como la señalización de la integrina vía [10]. CEACAM6 actúa como un oncogén en los tumores y promueve la invasión del cáncer, la metástasis, la resistencia a la anoikis y la quimiorresistencia, e inhibe la diferenciación [7], [8], [11]. Recientemente hemos informado de que la expresión está regulada positivamente CEACAM6 y se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos en los tejidos GC [12]. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las influencias CEACAM6 transducción de señales intracelulares en GC no se habían determinado.
epitelio-mesenquimal transición (EMT) no sólo es un proceso fisiológico durante el desarrollo embrionario o la regeneración de tejidos, sino también un elemento patológico en la progresión del cáncer, que involucra la metástasis del tumor, la apoptosis y la resistencia a la senescencia [13] - [15]. EMT siempre indica un pronóstico clínico pobre en los cánceres humanos. Una serie de mecanismos pertinentes a EMT iniciación se han documentado, incluyendo el TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK y vías SRC [15] - [18]. En nuestro estudio anterior, se observó la activación de SRC CEACAM6 inducida por GC en las células [12], y observamos un aumento del número de células que sobreexpresan CEACAM6 en forma de huso en comparación con las células control. Por lo tanto, estábamos muy interesados en determinar la relación entre CEACAM6 y EMT en las células de GC. Aunque la correlación negativa entre CEACAM6 y EMT ha sido registrado en los carcinomas de páncreas [19], los mecanismos por los cuales CEACAM6 regula EMT son poco conocidos.
En este estudio, hemos examinado aún más los efectos y las posibles vías de CEACAM6 en GC invasión y metástasis, y se investigan su correlación con la EMT.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
escrito el consentimiento informado en el estudio se ha obtenido de todos los participantes. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Ruijin, Facultad de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong. los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) en la Universidad de Shanghai Jiao Tong, de Shanghai, China.
Líneas celulares y muestras de tejido
El humana líneas celulares GC SGC-7901, MKN-45 y MKN-28 se adquirieron de Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia china de Ciencias. Las células se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2 y la saturación de humedad en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%.
tumor gástrico y el tejido no tumoral adyacente se obtuvieron de 93 pacientes con GC que se sometieron a cirugía curativa en Shanghai Jiaotong University School of Medicine hospital Afiliado Ruijin entre 2010 y 2013. Los pacientes consistió en 69 hombres y 24 mujeres con una edad media de 62,1 años (rango, 30-85 años). Ninguno de los pacientes había recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Se recogieron los datos clínico-patológica y la estadificación del tumor se determinó según la clasificación TNM de la UICC. clasificación histológica se realizó al menos por dos patólogos expertos que trabajan de forma independiente en un diseño doble ciego. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Ruijin de Shanghai, y todos los pacientes se les informó sobre los procedimientos experimentales.
Vector construcción y transfección
De larga duración CEACAM6 cDNA se obtuvo por RT PCR a partir de ARN total extraído de muestras de GC. El primer secuencias fueron 5'-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 '(hacia delante) y 5'-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3' (hacia atrás). Se conformó una pIRES2-eGFP-CEACAM6 construir mediante la inserción de cDNA en CEACAM6 pIRES2-eGFP vector. A continuación transfectadas pIRES2-eGFP-CEACAM6 o vector pIRES2-eGFP en SGC-7901 y MKN-45 células usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. clones estables se seleccionaron con un tratamiento continuo con G418 (1,2 mg /ml; Gibco, Nueva York, EE.UU.)
Vector Lentiviral construcción
Sobre la base de datos de genes humanos CEACAM6, un par de secuencias de oligonucleótidos. y las secuencias de control negativo fueron diseñados y sintetizados por Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd. secuencias shRNA fueron los siguientes: CEACAM6, 5'-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 '(hacia adelante), y 5'-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3' (inverso); control, 5'-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 '(hacia adelante), y 5'-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3' (hacia atrás). CEACAM6 shRNA se subclonó en PL /ARNhc /F vector lentiviral para obtener una construcción PL /ARNhc /SHR-CEACAM6. A continuación, PL /ARNhc /SHR-CEACAM6 o controlar vectores de lentivirus se transfectaron en células MKN-28 GC. células transfectadas de manera estable se seleccionaron por tratamiento con 5 g blasticidin /ml y se utilizaron para la identificación y la investigación adicional.
Western blotting
Las células se recogieron y se lisaron usando tampón RIPA (Solarbio, Beijing, China ) que contiene inhibidores de la proteasa PMSF 1%. Un kit de ensayo BCA (Pierce, Rockford, EE.UU.) se utilizó para medir la concentración de proteína total. cantidades equivalentes de proteínas fueron separadas por 10% SDS-PAGE, y las proteínas resueltas se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 2 h y después se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: CEACAM6 (1:500; Abcam, EE.UU.), E-cadherina (1:500; Señalización Celular Tecnología (CCT), EE.UU.), N-cadherina (1:500; CST, EE.UU.), vimentina ( 1:1000; CST, EE.UU.), Slug (1:500; CST, EE.UU.), p-AKT (Ser473) (1:1000; CST, EE.UU.), AKT total de (1:1000; CST, EE.UU.) y GAPDH ( 1:10000; Abcam, EE.UU.). Las membranas se incubaron con anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente y se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
tinción inmunofluorescente
Las células se cultivaron en cubreobjetos durante 24 h y después se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Las células se lavaron con PBS, luego se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 durante 20 min y se bloquearon con 5% de BSA durante 30 min a temperatura ambiente. Seguidamente, las células teñidas con anticuerpo CEACAM6 (01:50; Abcam) a 37 ° C durante 2 h, seguido de incubación con anticuerpo secundario fluorescente para 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI. anticuerpo rodamina faloidina (1:150; citoesqueleto) se utiliza para visualizar el citoesqueleto de las células GC. Las láminas fueron analizados y fotografiado en un microscopio de fluorescencia.
La inmunohistoquímica
Las secciones de 4 micras de espesor fueron cortadas de los bloques de tejido incluidos en parafina y luego deparaffinized y rehidratada. La tinción inmunohistoquímica de las secciones se realizó de acuerdo con el protocolo de DAKO, a través del ratón anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) y E-cadherina (1:100; cSt) a 4 ° C durante la noche. Los portaobjetos se incubaron después con el anticuerpo secundario marcado con HRP y se visualizaron mediante diaminobencidina. Dos patólogos que desconocían los datos de los pacientes evaluados de forma independiente y se puntuaron las secciones. La inmunohistoquímica mancha Partitura = célula positiva + tinción puntuación de intensidad. El porcentaje de células positivas se obtuvo como sigue: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26 a 50%), 3 (51-75%) y 4 (& gt; 75%). intensidad de la tinción inmunohistoquímica se calificó como sigue: 0 (sin tinción), 1 (tinción débil), 2 (tinción marrón), y 3 (tinción marrón oscuro). Las puntuaciones totales de ≥3 se definieron como positivas para simplificar el análisis de datos. Para analizar la correlación entre CEACAM6 y la expresión de E-cadherina, Imagen-Pro Plus versión 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, EE.UU.) se utilizó para cuantificar la expresión de CEACAM6 y E-cadherina en 20 muestras.
gelatina zymography
Para examinar la actividad de MMP-9, zimografía se realizó utilizando 10% en geles de SDS-PAGE que contenía 1 mg /ml de gelatina (Sigma). Brevemente, las células de GC se cultivaron en medio RPMI-1640 sin suero durante 24 h y luego se recogieron y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min el sobrenadante. Los geles se lavaron dos veces en tampón de renaturalización (2,5% Triton X-100) durante 30 minutos cada vez para eliminar el SDS después de la electroforesis y después se incubó a 37 ° C durante 24 h en un tampón de reacción (Tris-HCl 50 pH 7,5, 5 CaCl2 mM, NaCl 150 mM). A continuación manchados los geles con 0,5% azul brillante de Coomassie R-250 durante 2 h y se destiñeron los geles en tampón (30% de metanol, 10% de ácido acético). bandas claras y transparentes en el fondo de la tinción de azul representan las actividades gelatinasa.
ensayos
migración celular y la invasión
Para los ensayos de migración celular y la invasión, un total de 1 × 10
5 células fueron suspendido en el suero libre de RPMI-1640 con o sin anticuerpo MMP-9 (Abcam, 2 g /200 ul) y se colocaron en transwell cámaras (8 micras para placa de 24 pocillos; Corning Costar, NY, EE.UU.) con o sin Matrigel ( BD Bioscience, CA, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para ambos ensayos, se añadió medio que contenía 10% de FBS a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 24 h de cultivo, las células fueron fijadas en 10% formalina y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Por último, las células en la cámara inferior se fotografiaron y se contaron mediante microscopía invertida.
ratón desnudo modelo de xenoinjerto
Cuatro semanas de edad, macho BALB /c ratones nude (Instituto de Zoología de la Academia China de Sciences) se utilizaron para evaluar el papel de CEACAM6 en peritoneal difusión
en
in vivo
. Los ratones desnudos fueron alojados en un entorno libre de patógenos específicos en la Unidad de Animales de Laboratorio, Facultad de Medicina, Universidad de Shanghai Jiao Tong, China. Los ratones recibieron cuidado humano y los protocolos de los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Shanghai Jiao Tong University de Shanghai, China. Un total de 2 × 10
6 SGC-7901-CEACAM6 o se inyectaron células SGC-7901-NC en cinco ratones cavidad abdominal de cada grupo (asignación al azar). Los ratones fueron sacrificados en el día 30 después de la inyección, y las masas abdominales fueron imágenes y fotografiados. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones oficiales de la comunidad animal chino.
Estadísticas
de Student
t-test
se utilizó para examinar las diferencias estadísticas entre los dos grupos . Las correlaciones entre la expresión de E-cadherina en los tejidos de GC y los parámetros clínico-patológicos y CEACAM6 expresión se analizaron mediante chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher o el análisis de correlación de Pearson. Los datos se muestran como media ± DE.
P Hotel & lt; 0,05 y
P
. & Lt; 0,01 fue considerado estadísticamente significativo y altamente significativo, respectivamente
Resultados
CEACAM6 afecta a la morfología celular y la citoesqueleto
Nuestros resultados anteriores implican que las células MKN-28 GC inherentemente expresan altos niveles de CEACAM6, mientras que las células SGC-7901 y MKN-45 GC expresan niveles bajos [12]. La sobreexpresión de CEACAM6 en SGC-7901 y MKN-45 células GC y la atenuación de la expresión CEACAM6 en las células MKN-28 GC por PL /ARNhc /SHR-CEACAM6 lentiviral vectores se confirmó a nivel de proteínas por Western blot (Fig. 1A). Siempre ensayos de inmunofluorescencia mostraron que las células SGC-7901-CEACAM6 expresan mayor cantidad de proteínas que CEACAM6 SGC-7901-NC células (fig. 1B).
(A) sobreexpresión estable y supresión de CEACAM6 en las células de GC. expresión (B) CEACAM6 se analizó mediante inmunofluorescencia, y no se detectó más expresión en células CEACAM6 CEACAM6 sobreexpresan que la de las células de control (200 ×). Azul: DAPI; rojo: CEACAM6. (C) La sobreexpresión de CEACAM6 en SGC-7901 y MKN-45 células inducen una morfología mesenquimal, mientras que desmontables de CEACAM6 en las células MKN-28 inducida por una morfología epitelial (200 ×). (D) La inmunotinción de F-actina en las células que sobreexpresan CEACAM6 y células de control (400 ×). Rojo: F-actina; azul:. DAPI
Curiosamente, la morfología celular se alteró tras CEACAM6 atenuación y la sobreexpresión. En comparación con las células de control, las células SGC-7901-CEACAM6 y MKN-45-CEACAM6 exhibieron una morfología más mesenquimales-como, y eran de huso y en forma fusiforme-(Fig. 1C). Por el contrario, se detectó la transición típica de mesenquimal epitelial morfología en las células MKN-28-SH en comparación con las células MKN-28-nc (Fig. 1C). Sin embargo, no estaba claro si la sobreexpresión CEACAM6 tuvo un efecto en el citoesqueleto, por lo tanto la tinción de inmunofluorescencia de la tinción de F-actina se realizó. Curiosamente, no se observaron células con forma fusiforme-de mayor tamaño para MKN-45-CEACAM6 y líneas SGC-7901-CEACAM6 en comparación con las células de control (Fig. 1D).
CEACAM6 está asociado negativamente con la E-cadherina en tejidos GC
se realizó un análisis inmunohistoquímico para determinar los niveles de expresión de e-cadherina en tejidos de cáncer y pareadas tejidos no tumorales adyacentes. La tinción inmunohistoquímica demostró la expresión de E-cadherina fue menor en los tejidos tumorales que en tejidos no tumorales adyacentes, y reveló que la E-cadherina se encuentra principalmente en el citomembrana de las células epiteliales (Fig. 2D, E, F). A continuación, se determinó la relación entre la expresión de E-cadherina y características clinicopatológicas de GC, y se encontró que downregulated E-cadherina se asoció con la profundidad de la invasión (
P = 0,046
), metástasis de ganglios linfáticos (
P
= 0,013), y el estadio TNM (
P = 0,035
), pero no con otros factores clínico-patológicos, como el sexo, la edad, o la diferenciación (Tabla 1). Además, CEACAM6 se correlacionó negativamente con la EMT en los carcinomas de páncreas [19] y la supresión CEACAM6 podría aumentar la actividad del promotor de la E-cadherina en el cáncer colorrectal [20].
(A) CEACAM6 expresión negativa en la mucosa gástrica no tumoral. (B, C) CEACAM6 expresión positiva o negativa en las muestras de GC. (D) la expresión de E-cadherina positivo fuerte en la mucosa gástrica no tumoral. (E, F) E-cadherina expresión negativa o positiva en las muestras de GC. (G) correlación negativa entre CEACAM6 y E-cadherina expresión se detectó en los tejidos GC (R = -0,636,
P Hotel & lt; 0,01). (200 ×)
Además, se investigó la correlación entre e-cadherina y la expresión CEACAM6 en GC por la sección de inmunohistoquímica serie (20 muestras). CEACAM6 expresión en los tejidos tumorales fue mayor que en los tejidos no tumorales emparejados (Fig. 2A, B, C), de conformidad con nuestros resultados anteriores [12]. Curiosamente, hemos encontrado que la expresión CEACAM6 se correlacionó negativamente con la expresión de E-cadherina en los tejidos mediante análisis GC coeficiente de correlación de Pearson (
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 2G).
CEACAM6 induce EMT en GC células
proteínas relacionadas con la EMT-GC en las células se evaluaron mediante análisis de Western blot. Se observó que la N-cadherina, vimentina y los niveles de proteína Slug se aumentó, mientras que la E-cadherina se redujo en las células CEACAM6 sobreexpresan en comparación con sus respectivas células de control (3A. Fig, B). Converse resultados se obtuvieron después de CEACAM6 fue derribado en MKN-28 células (Fig. 3C, D). Estos resultados sugieren un papel funcional para CEACAM6 en la regulación de EMT en células de GC. Por otra parte, estas observaciones en células GC fueron similares con los hallazgos en el tejido GC.
(A, C) Los niveles de proteína de marcadores de EMT se analizaron por Western blot en células de GC con CEACAM6 sobreexpresión o derribo. (B, D) la expresión de marcadores de EMT relativa en las células que sobreexpresan GC CEACAM6 y -silenced se calcula por la relación de la escala de grises. Los resultados son la media de tres experimentos independientes en los gráficos de barras. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
CEACAM6 eleva la actividad de MMP-9 en células GC
es bien sabido que la adhesión, la degradación y la migración son los principales problemas en la metástasis del cáncer. zimografía de gelatina se lleva a cabo para examinar los efectos de CEACAM6 sobre la actividad de MMP-9, que es importante en la degradación de ECM. la actividad de MMP-9 en células MKN-45-CEACAM6 SGC-7901-CEACAM6 y se aumentó en comparación con sus grupos de control (Fig. 4A, B). A continuación se investigó si el aumento de la actividad de MMP-9 inducida por CEACAM6 en células GC resultó en un cierto incremento en el número de invadir y migración de las células. lo tanto, examinar la contribución de los activos anticuerpo anti-MMP-9 o PBS a las células que sobreexpresan GC CEACAM6. Como se esperaba, hubo diferencias significativas en el número de invadir y migración de las células en las células tratadas con anticuerpo en comparación con las células tratadas con PBS (
P
& lt; 0.01; Fig. 4C, D, E, F).
(A) se recogió el sobrenadante de las células de GC después de 24 h. A continuación, la actividad de MMP-9 se examinó por zimografía de gelatina. (B) relativa expresión de MMP-9 en células de GC. ensayo (C, E) Transwell. Las imágenes muestran las células que habían viajado a través de la membrana de microporos con o sin matrigel (200 ×). (D, F) Los histogramas muestran el número de células que migran y células invasoras. Los resultados son la media de tres experimentos independientes en los gráficos de barras. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
CEACAM6 regula al alza la AKT fosforilada en células GC
Hemos observado anteriormente que la actividad de SRC fue inducida por CEACAM6 en las células GC SGC-7901. AKT es una proteína de aguas abajo de SRC y se asocia de forma espectacular con EMT, invasión y metástasis en la progresión tumoral. por lo tanto, se evaluó la actividad de Akt en células GC CEACAM6 sobreexpresa. transferencia Western mostró que la fosforilación de AKT en la serina 473 se aumentó notablemente en células GC CEACAM6 sobreexpresan en comparación con los grupos de control (5A. Fig, B). Para examinar si los cambios de EMT fueron inducidos por CEACAM6 través de la vía PI3K /AKT, las células SGC-7901-CEACAM6 y MKN-45-CEACAM6 fueron tratadas con 100 nM LY294002 durante 24 h. Curiosamente, E-cadherina se incrementó y N-cadherina se redujo en las células CEACAM6 sobreexpresan LY294002 tratados en comparación con los controles, tal como se mide por análisis de transferencia Western (Fig. 5C, D).
(A) Western El análisis de transferencia mostró que la sobreexpresión de CEACAM6 aumentó p-AKT fosforilación (Ser473). GAPDH y AKT total fueron utilizados como controles de carga. (B) La cuantificación de p-AKT expresión (Ser473) en células de GC. la expresión (C) E-cadherina se incrementó mientras que la expresión N-cadherina se redujo en las células GC CEACAM6-overexpressing tratados con LY294002, un inhibidor de PI3K. (D) En relación E-cadherina y la expresión de N-cadherina en las células que sobreexpresan CEACAM6 y GC tratado con LY294002 se calcularon por la relación de la escala de grises. Los resultados son la media de tres experimentos independientes en los gráficos de barras. *
P
. & Lt; 0,05
CEACAM6 promueve la difusión peritoneal in vivo
Por último, se examinaron los efectos de la sobreexpresión de CEACAM6 peritoneal y metástasis propagación
en
in vivo
. Hemos inyectado SGC-7901-CEACAM6 y SGC-7901-NC células en el abdomen de ratones desnudos. Amplia propagación peritoneal se observó en el grupo de SGC-7901-CEACAM6 comparación con el grupo SGC-7901-NC (Fig. 6A). Había nódulos peritoneales significativamente más visibles en el grupo SGC-7901-CEACAM6 que en el grupo control (5.400 ± 0.510
vs
1.400 ± 0.245,
P
. & Lt; 0,01; Fig. 6B ). Además, la sobreexpresión de CEACAM6 mejora de la metástasis
en
in vivo
se ha observado también en el cáncer de páncreas [19].
(A) se observó un aumento en el número de nódulos metastásicos en el grupo SGC-7901-CEACAM6 que el grupo de control, como se indica por las flechas negras. (B) Número medio de nódulos peritoneales en dos grupos. Más nódulos ocurrieron en el grupo SGC-7901-CEACAM6 que el grupo SGC-7901-NC.
Discusión
GC es la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1] . La evidencia creciente indica que CEACAM6 juega un papel importante en el cáncer gastrointestinal progresión [7], [20] - [22], y CEACAM6 está más ampliamente distribuida que la EC (CEACAM5) en los tejidos normales, con expresión significativa en muchos epitelios [4]. CEACAM6 influencias eventos de señalización intracelular a través de homophilic y adhesión heterófilos con otros CEACAMs o integrinas [23], [24]. El propósito de este estudio fue examinar los aportes de proteínas ancladas a GPI CEACAM6 en la progresión del GC.
Curiosamente, se observó que la morfología celular y la estructura del citoesqueleto se alteró por la regulación positiva estable y regulación a la baja en las células CEACAM6 GC. células que sobreexpresan CEACAM6 eran más mesenquimales-como y exhibieron un husillo y fusiforme forma, y se detectaron más fibras de estrés de actina en comparación con los grupos de control, en un proceso definido como EMT. El fenotipo mesenquimal dota a las células con propiedades migratorias e invasivas más [15]. Esta observación fue consistente con la
en
in vivo
resultados con lo que indujo CEACAM6 amplia difusión peritoneal en ratones desnudos. MET se observó siguiente silenciamiento de CEACAM6 en las células de GC. Estas observaciones demostraron que CEACAM6 puede estar implicado en la inducción de EMT en GC. A continuación examinó la correlación entre CEACAM6 y E-cadherina, un marcador de la EMT, en los tejidos GC por tinción inmunohistoquímica. Como era de esperar, se observó una correlación negativa significativa entre CEACAM6 y E-cadherina, y la expresión de E-cadherina se asoció con la profundidad de la invasión tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio TNM en los tejidos GC. Además, CEACAM6 promueve la metástasis de los ganglios linfáticos (
P
= 0,001) en 98 tejidos GC en nuestro estudio anterior [12]. Los resultados previos mostraron que CEACAM6 atenuación incrementó la actividad del promotor de E-cadherina en el cáncer colorrectal [20]. Sobre la base de las consideraciones expuestas, que postula que CEACAM6 promovió la invasión y la metástasis GC mediante la inducción de la EMT y puede servir como un marcador mesenquimal.
La metástasis es la causa principal de muerte asociada al cáncer, pero ha sido difícil de estudiar porque implica una serie de eventos raros, estocásticos. Un número de posibles vías de señalización relevantes para la metástasis del cáncer se han ilustrado, incluyendo la PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ, y las vías de MMPs [25] - [27]. En este estudio, la sobreexpresión de CEACAM6 elevada actividad de MMP-9, y el anticuerpo anti-MMP-9 podría revertir las propiedades invasivas y migratorias crecientes inducidos por CEACAM6. iniciación EMT se correlaciona significativamente con la metástasis del cáncer, e induce propiedades de células madre, previene la apoptosis y senescencia, y contribuye a la inmunosupresión en la progresión del cáncer [15]. EMT puede ser inducida mediante la activación de la vía de señalización de PI3K /AKT [28], [29]. funciones CEACAM6 como una molécula de adhesión intercelular y pueden formar grandes balsas de lípidos mediante la interacción con sí mismo u otros CEACAMs, activando de este modo las cascadas de señalización corriente abajo, tales como la integrina y las vías PI3K /Akt [10], [30]. Por lo tanto, hemos examinado los efectos de la sobreexpresión CEACAM6 en los niveles de fosforilación de AKT en las células de GC. los niveles de AKT fosforilada se incrementaron en las células que sobreexpresan CEACAM6, en consonancia con los resultados anteriores se señala en los carcinomas de páncreas [8], [11]. De acuerdo con estas observaciones, se propone una hipótesis mediante el cual EMT CEACAM6 inducida se produce a través de la activación de la cascada de señalización de PI3K GC /AKT. Por otra parte, las células que sobreexpresan CEACAM6 tratados con LY294002, un inhibidor de PI3K, se sometieron a una reversión de la EMT a través de MET. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que CEACAM6 induce EMT mediante la activación de la vía de señalización en GC y puede servir como un objetivo potencial en el tratamiento de tumores PI3K /AKT.
En conclusión, hemos ilustrado que CEACAM6 actúa como un oncogén mediante la promoción de la EMT a través de la activación de PI3K /AKT en GC. Por otra parte, la E-cadherina es downregulated notablemente en los tejidos de GC que los tejidos no tumorales adyacentes apareados. CEACAM6 promueve la invasión y la metástasis
en
in vitro
y
en
in vivo
, y puede ser un nuevo marcador diagnóstico y pronóstico potencial y nuevo objetivo para la GC la terapia.
Apoyo a la Información
Lista de verificación S1. Francia El LLEGA directrices. Todos los experimentos in vivo en nuestro manuscrito fueron exportados de conformidad con las directrices LLEGA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0112908.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
quisiera agradecer Xuehua Chen y Zhang Jianian para la asistencia técnica, a Beiqin Yu por su apoyo material.