Extracto
El inhibidor canceroso de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) es un factor oncogénico que estabiliza la proteína c-Myc. CIP2A se sobreexpresa en varios tumores, y los niveles de expresión son un marcador independiente para el resultado a largo plazo. Para determinar si
CIP2A
expresión es elevada en el cáncer de colon y si podría servir como un marcador pronóstico para la supervivencia, se analizaron
CIP2A
la expresión del ARNm por PCR en tiempo real en 104 muestras de cáncer de colon.
CIP2A
mRNA se sobreexpresa en muestras de cáncer de colon y
CIP2A
niveles de expresión significativamente correlacionado con el estadio del tumor. Hemos encontrado que
CIP2A
sirve como un marcador pronóstico independiente de libre de enfermedad y la supervivencia global. Además, se investigó efectos CIP2A-dependientes en los niveles de c-Myc, Akt y en la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de colon tres silenciando CIP2A usando interferencia pequeño (si) y corto horquilla ARN (SH). El agotamiento de CIP2A inhibe sustancialmente el crecimiento de líneas celulares de colon y redujo los niveles de c-Myc sin afectar la expresión o función de la quinasa reguladora aguas arriba, Akt. Se encontró que la expresión de CIP2A ser dependiente de la actividad MAPK, que une elevada expresión de c-Myc a la transducción de señales desregulado en el cáncer de colon
Visto:. Wiegering A, Pfann C, Uthe FW, Otto C, Rycak L, Mäder U, et al. (2013) CIP2A influye en la supervivencia en cáncer de colon y es fundamental para mantener la expresión de Myc. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10.1371 /journal.pone.0075292
Editor: Gnanasekar Munirathinam, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2013; Aceptado: August 12, 2013; Publicado: 1 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wiegering et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AW tiene la financiación de la universidad de Würburg para una pantalla en comparación con el número de APC es la financiación: IZKF B-186. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito para este estudio. Esta publicación fue financiada por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y la Universidad de Würzburg en el programa de financiación de Publicaciones de Acceso Abierto. No hay corrientes diferentes fuentes externas de financiación para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el más. tumores gastrointestinales. Hay aproximadamente 664.000 nuevos casos cada año en todo el mundo. La mitad de estos pacientes morirán de este carcinoma [1]. Actualmente, el tratamiento estándar es la cirugía primaria y, dependiendo de la etapa del tumor, quimioterapia adicional [2]. Debido a la alta tasa de recurrencia, se necesitan nuevos objetivos potenciales y marcadores de pronóstico para identificar a los pacientes que puedan beneficiarse de la terapia adicional.
En 2007, Junttila y Westermarck identifican el inhibidor canceroso de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) como una oncoproteína humana. CIP2A se sobreexpresa en carcinomas de cabeza y cuello de células escamosas y en carcinomas de colon [3]. CIP2A inhibe la proteína fosfatasa 2A (PP2A). PP2A a su vez tiene un papel crítico en la facturación de la oncoproteína c-Myc, ya dephosphorylates PP2A c-Myc en la serina-62 (S62). Se requiere desfosforilación en S62 para la ubiquitinación de c-Myc por la ubiquitina ligasa Fbw7 y por lo tanto, inicia la degradación de c-Myc [4]. La sobreexpresión de CIP2A inhibe la actividad de PP2A y por lo tanto se estabiliza c-Myc. En consecuencia, esto induce la inmortalización y la transformación maligna de las células humanas [3]. sí c-Myc sigue siendo el motor oncogénico más importante en el cáncer colorrectal [5].
Estudios recientes han demostrado que CIP2A se sobreexpresa en varios tumores malignos humanos. CIP2A niveles de expresión se correlacionan con la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS) en los carcinomas gástricos, en el cáncer de ovario seroso, en el carcinoma de células renales y en el cáncer de mama [6]; [7]; [8]; [9]. En la leucemia mieloide crónica (LMC),
CIP2A
expresión en el momento del diagnóstico de tiempo es un marcador pronóstico para el desarrollo de una crisis blástica más adelante [10]. Además, algunos factores oncogénicos, incluyendo
helicobacter pylori
y papiloma virus 16 E7, regulan al alza la expresión de CIP2A y esto puede ser crítico para su actividad oncogénica [11]; [12].
Recientemente, dos grupos informaron de resultados contradictorios en relación con el impacto pronóstico de CIP2A en el cáncer colorrectal [13], [14]. Bockelman et al. estudiados 752 pacientes, pero no se pudo determinar ninguna importancia pronóstica; en contraste Teng et al. 167 pacientes estudiados y la expresión CIP2A identificado como un factor pronóstico para el carcinoma de colon
.
El objetivo del presente estudio fue analizar la importancia de la expresión CIP2A en el cáncer de colon. En primer lugar, analizamos la expresión de
CIP2A
en una cohorte de pacientes con cáncer de colon con 104 seguimiento documentado y confirmado su sobreexpresión. En segundo lugar, se investigó la asociación entre el
CIP2A
la expresión del ARNm y las variables clínico-patológicas; Por último, nuestro propósito es determinar las vías moleculares que regulan la expresión y CIP2A, están regulados por CIP2A. Nuestros datos apoyan la noción de que la expresión desregulada de CIP2A es un evento oncogénico crítico en el carcinoma de colon.
Pacientes y métodos
muestras de pacientes
Ciento cuatro pacientes con cáncer colorrectal se incluyeron en el estudio. Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía en el Hospital de la Universidad de Würzburg, Alemania, entre 2003 y 2012. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Tratamientos después de la cirugía se realizaron de acuerdo con las directrices para el tratamiento del cáncer colorrectal. El diagnóstico fue confirmado por examen histopatológico de los especímenes. Después de la cirugía, se recogieron muestras de tumor y se almacenan en nitrógeno líquido. Se recogieron datos clínicos de todos los pacientes se obtuvieron de los registros hospitalarios y los registros posteriores a través del Centro Integral del Cáncer Mainfranken.
Declaración de Ética se obtuvo
La aprobación ética para la investigación del Comité de Ética de Investigación Humana de la Universidad de Würzburg. Todos los pacientes que proporcionaron muestras de tejido tumoral y tejido de colon normales para esta investigación firmaron un formulario de consentimiento antes de la extirpación quirúrgica del cáncer intestinal.
Líneas celulares y cultivo celular
Caco2, HCT116 y SW620 las células fueron adquiridos de American Type Culture Collection. Todas las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal und 1% de penicilina /estreptomicina.
En tiempo real de transcripción inversa-PCR Análisis cuantitativo
La expresión génica de
CIP2A
se analizó usando PCR en tiempo real. El ARN celular total se extrajo a partir de muestras tumorales y líneas celulares con RNeasy Minikit (Qiagen; Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los conjuntos de cebadores (Qiagen) que apuntaron
CIP2A
ARN fueron diseñados por Biomers (Ulm, Alemania). Matched ADNc de colon humano (Pharmingen; Heidelberg, Alemania) sirvió como control positivo, estandarizado a la línea base. Los genes de limpieza, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
) y beta-2 microglobulina (
b2MG
) fueron utilizados como estándares internos para la cuantificación relativa y control de calidad de ADNc. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo con un Opticon 2 Sistema de DNA Engine (MJ Research, Biozym; Oldendorf, Alemania). Cuantificación relativa, basada en la diferencia de plegado, se calculó con el método de ciclo umbral (Ct), expresado como 2
-ΔΔCt (secuencia del cebador en la Tabla S1).
Análisis de inmunotransferencia
Las células cultivadas se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo, se recogieron y se lisaron directamente en tampón de muestra RIPA para el análisis por inmunotransferencia. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C, y el sobrenadante se utilizó como lisado de proteína total. Para cada muestra, 10 g de lisado de proteína total se sometió a electroforesis en 10% de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de análisis por inmunotransferencia. Las inmunotransferencias se probaron con anticuerpos contra CIP2A (A301-454A; Bethyl Laboratories), c-Myc C33 (C33,#42; Santa Cruz), beta-actina (AC-15 /A5441; Sigma), vinculina (V9131; Sigma), AKT, pAKT
473 (CS-9271), GSK3 (CS-9315), pGSK serina-9 (CS-9336), s6 (CS-2212), ps6 (CS-2215); pmTOR (CS-2917), y mTOR (CS-2972). Todos los anticuerpos eran de señalización de la célula y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las manchas de transferencia se visualizaron con anticuerpos secundarios (GE Healthcare) contra ratón (NA9310) o conejo (NA9340) anticuerpos primarios.
Inmunohistoquímica
El anticuerpo CIP2A fue el mismo que para el análisis de inmunotransferencia, control de isotipo anticuerpo se adquirió de eBioscience (San Diego, EE.UU.). El anticuerpo secundario era una IgG anti-conejo conjugado con Cy3 AffiniPure a una dilución 1:200. tinción CIP2A se realizó en secciones de criostato de muestras de cáncer de colon snap-congelados que expresan diferentes niveles de mRNA CIP2A con tejido normal del colon vecinos y 10 especímenes de colon normal. secciones de criostato (5 M) se incubaron con el anticuerpo o anticuerpo de control primario seguido de incubación con el anticuerpo conjugado con Cy3 secundario. Los portaobjetos se contratiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y se cubre con polivinil-alcohol medio de montaje (DABCO, Sigma-Aldrich) y se analizaron utilizando una cámara Zeiss (Oberkochen, Alemania).
siRNA transfección
Para silenciar la expresión génica, las células fueron transfectadas con pequeños RNAs de interferencia (siRNAs). En-blanco de la piscina de SMART (Dharmacon) siRNA además para apuntar CIP2A (L-014135-01-005) y un control de siRNA (D-001810-10-05) fueron utilizados. Las piscinas siRNA (concentración final 100 nM) se transfectaron en las células con el kit RNAimax de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron 72 h más tarde; expresión de proteínas se determinó mediante análisis por inmunotransferencia.
shRNA y lentivirus
Para silenciar la expresión de ARNm CIP2A con secuencias cortas de ARN de horquilla (shRNA), dirigido a
CIP2A
fueron clonados en un vector lentivirus (plko1 puro), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector se transfectó transitoriamente en células HEK293T junto con plásmidos de paquetes. Después de 48 y 72 h, se recogieron y se filtraron los sobrenadantes que contienen el virus. líneas celulares de cáncer de colon se infectaron con el lentivirus CIP2A y 24 horas más tarde, se seleccionaron las células infectadas con puromicina. Los experimentos se realizaron con las celdas seleccionadas.
Formación de Colonias Ensayo
2.5 × 10
3 células infectadas con shRNA CIP2A o SCR. se sembraron en placas de seis pocillos. Las colonias se tiñeron con 0,5% de cristal violeta en etanol al 20%. Las fotografías fueron tomadas y la densidad relativa determinaron con ImageJ.
Análisis estadístico
Los análisis univariados para determinar la asociación con la supervivencia fueron evaluados con las curvas de Kaplan-Meier y las comparaciones se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Un análisis multivariante se realizaron con un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. & lt; P-valores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Expresión de CIP2A y variables clínico de pacientes con cáncer de colon
La expresión de
CIP2A
ARNm. se evaluó inicialmente utilizando conjuntos de datos de expresión derivados de un análisis de microarrays publicado, que se realizó originalmente para identificar marcadores pronósticos en carcinomas colorrectales según el estado de los ganglios linfáticos metástasis [15]. conjuntos de datos completos (DFS, estadios tumorales), comparando
CIP2A
la expresión del ARNm en el carcinoma de que en los tejidos adyacentes emparejados, estaban disponibles para 226 carcinomas.
CIP2A
expresión se puso a prueba utilizando dos sondas independientes presentes en esta matriz. No se encontró correlación entre el
CIP2A
expresión y la edad al momento del diagnóstico, o de género en este conjunto de datos, pero
CIP2A
ARNm se expresó en niveles más altos en los tejidos de cáncer colorrectal que en los tejidos adyacentes coincidentes en ambos conjuntos de sonda (datos no mostrados). Curiosamente, alta
CIP2A
expresión del ARNm se correlaciona significativamente con una menor supervivencia libre de enfermedad (DFS) (Fig. S1 A, B). En análisis separados de los pacientes en la Unión para el Control Internacional del Cáncer (UICC) en estadio I (infiltración tumoral para muscular propia), II (infiltración tumoral más allá muscular propia) o III (metástasis ganglionares), solo los pacientes en estadio UICC III mostraron una correlación significativa entre los
CIP2A
expresión y DFS. En comparación, los pacientes en estadio I y II de la UICC mostraron sólo una ligera correlación entre la baja
CIP2A
expresión y la supervivencia prolongada que no alcanzó significación estadística. Esto puede ser debido al pequeño número de muestras y menos eventos de recaída en comparación con los pacientes en la etapa UICC III (Fig. S2A-C). Como DFS no pudo ser localizado en la etapa de la UICC IV (metástasis a distancia), no fue posible analizar la correlación de
CIP2A
expresión para la supervivencia de los pacientes en estadio IV UICC con este conjunto de datos.
Asimismo, analizaron
CIP2A
niveles de mRNA en un conjunto independiente de 104 muestras de tejido de cáncer colorrectal utilizando un enfoque de RT-qPCR. La expresión de
CIP2A
ARNm se determinó en relación con dos genes de limpieza, beta-2 microglobulina (
b2MG
) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
). Los niveles de expresión se compararon con la mediana
CIP2A
la expresión de ARNm en el tejido de la mucosa normal.
CIP2A
expresión en relación con
b2MG
o relativo a
GAPDH
mostró una alta correlación (R
2 = 0,86) (Fig. S3). De acuerdo con resultados previos sobre la expresión CIP2A en el cáncer, encontramos
CIP2A
la expresión de ARNm en 93 de 104 muestras (89,4%) de cáncer de por lo menos cuatro veces mayor que en los tejidos normales de la mucosa del colon. Por otra parte,
CIP2A
nivel de expresión se correlacionó de manera significativa a la etapa de la UICC, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, y la clasificación histológica del tumor (Fig. 1). No se encontró asociación entre el
CIP2A
expresión y la edad del paciente, el sexo o la ubicación del cáncer (derecha vs colon izquierdo) (Tabla S2).
Los paneles muestran caja y bigote parcelas documentar relativa
CIP2A
niveles de mRNA en tumores estratificados de acuerdo a UICC etapa (a) (UICC I vs. II p & lt; 0,0001; II vs. III p = 0,0046; III vs. IV p = 0,0002), de acuerdo con la linfa nodo metástasis (B; N- vs. N + p & lt; 0,0001), de acuerdo con metástasis a distancia (C; M0 vs. M1 p & lt; 0,0001), y de acuerdo con la clasificación histológica (D: G2 G3 vs. p = 0,0084) .
CIP2A mRNA expresión y postoperatorio La supervivencia de los pacientes con cáncer de colon
La supervivencia global (OS) se utilizó para el análisis de supervivencia. La supervivencia global se definió como el intervalo de tiempo entre la cirugía y la muerte asociado a un tumor. Los análisis univariado OS de 1, 3 y 5 años reveló que los pacientes con un estado avanzado del tumor primario, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, avanzado UICC-etapa, y los altos grados histológicos tenían peores resultados (Tabla 1). Para su posterior análisis, los pacientes fueron divididos en dos grupos, con
CIP2A
expresión anterior (alto) o por debajo del valor de la mediana (bajo). Los pacientes con alta
CIP2A
la expresión del ARNm tenían OS significativamente más bajos que los de baja
CIP2A
la expresión del ARNm (Fig. 2A, B). La comparación de pacientes en estadios I-IV de la UICC separado con alta y baja
CIP2A
la expresión del ARNm, sólo en la etapa de la UICC III, los pacientes con alta
CIP2A
niveles tuvieron una SG reducida (Fig. 2C, RE). Además, un análisis multivariado indicó que un avanzado UICC-etapa y alta
CIP2A
expresión (
CIP2A
encima de la mediana y
CIP2A
expresión utilizada como un marcador continua) eran independientes factores pronósticos de mal pronóstico en pacientes con cáncer de colon (Tabla 2).
Los gráficos muestran las curvas de Kaplan-Meier de OS acuerdo con
CIP2A
la expresión del ARNm. (Rojo:
CIP2A
la expresión del ARNm de abajo incremento medio de la expresión de valor por encima de 10,5 tejido normal), verde:
CIP2A
la expresión del ARNm por encima de incremento medio de la expresión de valor por encima de 10,5 tejido normal) (a & amp; B) Todos los pacientes con respecto a
CIP2A
la expresión de ARNm normalizada de limpieza de genes (n = 75) (a: b2MG; B: GAPDH) pacientes en estadio II UICC con respecto a (C)
CIP2A
la expresión del ARNm normalizó a GAPDH limpieza de genes (n = 29) (D) Los pacientes en etapa III UICC con respecto a
CIP2A
la expresión del ARNm normalizado a GAPDH limpieza de genes (n = 21).
Para probar si
CIP2A
expresión del ARNm se correlaciona con la expresión de la proteína CIP2A en el CCR, diez secciones normales de tejido de la mucosa, cuatro muestras de tejido que expresa CRC baja
CIP2A
los niveles de ARNm y cinco muestras de tejidos que expresan altos
CIP2A
niveles de mRNA se tiñeron para la expresión de proteínas CIP2A. En las secciones normales de tejido mucosa, ninguna o sólo se pudo detectar una tinción muy débil para CIP2A (datos no mostrados). Los cánceres que expresan bajos niveles de
CIP2A
ARNm mostraron una tinción débil para la proteína CIP2A, mientras que los cánceres que expresan alta
CIP2A
niveles de mRNA mostraron una fuerte tinción de la proteína CIP2A. Estos resultados demuestran que la proteína CIP2A y los niveles de mRNA se correlacionan estrechamente
in vivo
. (Fig. 3).
Los paneles muestran ejemplos representativos de la tinción de inmunofluorescencia, que muestran la expresión de proteínas en células de cáncer CIP2A de pacientes con baja (A + B) o alta
CIP2A gratis (C + D ) la expresión de ARNm (a + C x 100, B + D magnificación x200).
Efectos de CIP2A agotamiento en el crecimiento celular y la expresión de Myc en CRC
Hemos querido aclarar aún más la influencia de CIP2A en sus proteínas diana en líneas celulares de CRC. expresión de la proteína de CIP2A se redujo notablemente en tres líneas celulares de colon (Caco2, HCT116 y SW620) después del tratamiento con siRNA contra
CIP2A
. Por otra parte, CIP2A caída dio lugar a una reducción sustancial de los niveles de c-Myc en las tres líneas celulares (Figura 4A;. N = 3 para cada línea celular). Esto fue debido a la regulación postranscripcional de los niveles de proteína c-Myc, ya que se detectó ningún cambio en
MYC
la expresión del ARNm (figura 4B;. N = 3). Estudios previos indicaron que CIP2A caída condujo a una reducción de la actividad de Akt, que se muestra por la fosforilación reducida en la serina 473 (pAkt
473), y por lo tanto, inhibe la vía PI3K /mTor. Sin embargo, no se detectó ningún cambio significativo en la Akt fosforilada después CIP2A caída en células Caco2, HCT116 o SW620. Por otra parte, la fosforilación de Akt los objetivos intermedios, incluyendo pmTor, ps6, y pGsk3, no se alteró significativamente después de la caída CIP2A (Figura 4C;. N = 3 para cada línea celular). En general, esto demuestra que la proteína c-Myc está bajo el control de CIP2A en CRC, mientras que la PI3K /mTor parece ser independiente de CIP2A.
(A) El análisis por inmunotransferencia de CIP2A y la proteína c-Myc expresión en Caco2, HCT116 y SW620 células transfectadas con siRNA dirigidos CIP2A o controlar siRNA. Las células se recogieron 72 h después de la transfección (n = 3 para cada línea celular). (B) Análisis de PCR en tiempo real de
CIP2A
y
c-Myc
la expresión de ARNm en las células HCT116 transfectadas con siRNA dirigidos CIP2A o controlar siRNA (n = 3). (C) El agotamiento de CIP2A no cambia el estado de activación de AKT o sus objetivos de abajo. Los paneles muestran inmunotransferencias de las proteínas indicadas y las proteínas fosforiladas (P) en Caco2, HCT116 y SW620 células transfectadas con siRNA dirigidos CIP2A o controlar siRNA como antes (n = 3 para cada línea celular).
Debido a siRNAs son típicamente pierden con el tiempo, y para excluir los efectos fuera de la meta, hemos probado dos diferentes shRNAs dirigidos
CIP2A
para evaluar el efecto de inhibir el crecimiento de CIP2A caída. HCT116 células fueron infectadas con lentiviral vectores que llevan shRNAs contra
CIP2A
. análisis de inmunotransferencia mostraron caída sustancial de proteína CIP2A con la correspondiente reducción en los niveles de proteína c-myc (Fig 5A;. n = 2). En consecuencia, la proliferación celular se alteró notablemente en las células infectadas con shRNA contra
CIP2A
(Fig 5B;. N = 2).
(A) El análisis por inmunotransferencia de CIP2A y la proteína c-Myc expresión en HCT116 células infectadas con lentiviral shRNA orientación CIP2A o una ctr. shRNA. Números por debajo de las líneas indican la expresión de la proteína c-myc en relación con los niveles de c-myc en células de control (n = 2). (B) La formación de colonias de las células HCT116 después de 7 días. (
Top of), la densidad de las colonias teñidas con cristal violeta; (
inferior), representante de los cultivos indicados (n = 3).
Expresión CIP2A está aguas abajo de la quinasa MEK en el CCR
Para identificar los posibles reguladores de aguas arriba de
CIP2A
expresión, se trataron Caco2, HCT116 y las células SW620 con UO126, un bien caracterizado Mek1 /2 inhibidor [16]. El tratamiento con UO126 durante 24 h dieron lugar a una reducción significativa en
CIP2A
mRNA y CIP2A expresión de la proteína en comparación con células tratadas DMSO (Fig 6a, b;. N = 3 para cada línea celular). Este efecto fue más pronunciado en las células que albergaban una mutación vía MAPK, como SW620 (
KRAS
) y HCT116 (
KRAS
), que en las células Caco2 que son de tipo salvaje para
KRAS
.
Caco2, las células HCT116 y SW620 fueron tratados con DMSO o el inhibidor de MEK para UO126 24 (n = 3 para cada línea celular). (A) El análisis por inmunotransferencia de CIP2A y expresión de la proteína p-ERK en Caco2, HCT116 y SW620. (B) Análisis de PCR en tiempo real de
CIP2A
expresión de ARNm (* & lt; 0,05; ** & lt; 0,005) guía empresas
Discusión
Recientemente "La. Genoma del cáncer Atlas de red "demostró que desregulado expresión de c-Myc es un sello de prácticamente todos los CRCs, independiente del conjunto de mutaciones específicas que están presentes en cada tumor [5]. Por ejemplo, las mutaciones en el gen supresor tumoral
APC
y el oncogén
KRAS
conducen a una regulación al alza de los
MYC
ARNm [5]. En el nivel postranscripcional, la pérdida de la familia miR34 por hipermetilación, que ocurre en más del 90% de todos los CRC, estabiliza
MYC
ARNm [17], [18]. Por otra parte, un modelo de ratón de cáncer de colon accionado por pérdida de
APC
muestra que la formación de tumores de colon depende de la expresión de c-Myc continua [19].
Hasta el momento, se sabe poco acerca de la postraduccional regulación de los niveles de c-Myc en el CCR. En el presente estudio, hemos demostrado que
CIP2A
expresión es elevada en las muestras de carcinoma de colon, en comparación con su expresión en el tejido normal grande, delgado, y que
CIP2A
expresión se correlaciona negativamente con ambos OS y los parámetros clínicos patológicos. Dado que no existen puntos de corte validados para
CIP2A
niveles de expresión para aclarar altas frente a grupos de baja expresión, hemos utilizado el nivel de expresión del ARNm de la mediana como punto de corte. A pesar de un número relativamente bajo de pacientes en nuestro estudio, y por lo tanto un número relativamente bajo de muertes relacionadas con cáncer en análisis de subgrupos, hemos podido demostrar una correlación significativa de
CIP2A
niveles con la supervivencia asociada al tumor.
Dos estudios previos analizaron los niveles de expresión de CIP2A en el CCR y demostraron niveles incrementados de CRC en relación con la mucosa normal, de acuerdo con los resultados presentados aquí [13], [14]. Por otra parte, una estrecha correlación entre los niveles de CIP2A y Myc se ha observado antes [3], [13] y se muestra aquí que se requieren niveles elevados de CIP2A para mantener la expresión Myc en las líneas celulares de CRC. Sorprendentemente, la correlación con OS se observó en sólo uno de los estudios anteriores [14]. Aunque no sabemos la razón exacta de la discrepancia, se observa que tanto Teng et al. [14] y nuestro estudio, se asignó un porcentaje relativamente alto de los pacientes al grupo de baja expresión (68 y 50% respectivamente), mientras que Bockelman et al. [13] define sólo el 15% de los pacientes con tumores tan bajas expresión CIP2A. Sugerimos que estas diferencias en la estratificación de los pacientes de acuerdo con los niveles de CIP2A puede dar cuenta de los diferentes resultados. La noción de que CIP2A se sobreexpresa en el cáncer de colon, mejorando de este modo los niveles de proteína Myc y que influyen en la supervivencia relacionada con tumor, es consistente con los resultados previos en otros tumores sólidos [6]; [7]; [8]; [9]. Se requerirá un estudio prospectivo para evaluar si la expresión de ARNm o CIP2A nivel de proteínas puede servir como un marcador predictivo para la supervivencia de los pacientes con CCR.
Se ha demostrado previamente que CIP2A estabiliza c-Myc mediante la inhibición de la PP2A la degradación mediada en células tumorales [3]. En consonancia con este modelo, el presente estudio muestra que se observa regulación a la baja de la proteína c-Myc cuando CIP2A es silenciado con siRNAs o shRNAs en células de carcinoma colorrectal. Debido al hecho de que hemos utilizado las líneas celulares que albergan mutaciones diferentes de la vía oncogénica comúnmente mutado en el CCR (Caco2: APC
mut, KRAS
en peso, PI3K
en peso; HCT116: APC
en peso, SS- catenina
mut, KRAS
mut, PI3K
mut; SW620: APC
mut, KRAS
mut, PI3K
en peso), se postula que la dependencia de la expresión de la proteína c-Myc en CIP2A es independiente de la presencia de mutaciones en WNT, PI3K /o mTor MAPK vías, pero esto tendrá que ser evaluada. También se encontró que el agotamiento mediado por shRNA de CIP2A en células de carcinoma de colon HCT116 reduce notablemente su potencial de crecimiento. Esto es coherente con los informes de que la inhibición CIP2A resultó en la detención del crecimiento y la disminución de potencial clonogénico en varios otros tumores malignos [6]; [7]; . [8]
PP2A dephosphorylates pAkt y CIP2A mejora de señalización PI3K /mTor mediante la inhibición de la PP2A desfosforilación mediada de pAKT en los carcinomas hepatocelulares (HCC) [20]; [21], [22]. Nuestros resultados muestran que el agotamiento de expresión CIP2A en células de cáncer colorrectal no afecta a la señalización de Akt, en contraste con las observaciones en células de HCC. También se encontró ninguna o sólo cambios menores en los niveles pAkt o abajo objetivos Akt conocidos. Lo más probable, por lo tanto, la actividad de PP2A hacia algunas de sus sustratos (Akt) difiere entre diferentes tejidos.
Poco se sabe sobre el mecanismo subyacente a la mayor expresión de CIP2A en las células malignas. En el cáncer gástrico,
Helicobacter pylori
infecciones hasta de regular
CIP2A
expresión a través de una vía de Src /Erk dependientes [11]. El virus del papiloma humano 16E7 regula al alza la oncoproteína
CIP2A
en el cáncer cervical [12]. Actualmente no está claro lo que contribuye a CIP2A sobreexpresión en cáncer de colon. Dos hallazgos apoyan la hipótesis de que la expresión CIP2A en el cáncer de colon se encuentra aguas abajo de la vía MAPK. En primer lugar, el trabajo previo mostró que la expresión CIP2A se correlaciona positivamente con la expresión de EGFR [13]. La vía MAPK es una de las principales metas de la señalización de EGF. En segundo lugar, demostramos que CIP2A es downregulated después de la inhibición de la vía MAPK en líneas celulares de carcinoma de colon tres; regulación a la baja en las líneas celulares que alberga un
KRAS mutación
(HCT116, SW620) es más pronunciada que en Caco2 no albergar una mutación MAPK vía. La inducción de la CIP2A puede, por lo tanto, ser un mediador crítico que une la señalización mitogénica desregulado faciliten la expresión de c-Myc en
CRC.
En conclusión, los resultados de este estudio muestran que
CIP2A
se asocia con la supervivencia del cáncer colorrectal relacionados. Alta expresión de
CIP2A
ARNm se correlaciona con una menor SLE y la SG. Por lo tanto,
CIP2A
representa un nuevo factor pronóstico en el diagnóstico del cáncer colorrectal. Además, CIP2A puede ser un objetivo terapéutico prometedor en el desarrollo de terapias para el cáncer colorrectal.
información de apoyo
Figura S1.
curvas de Kaplan-Meier de supervivencia libre de enfermedad de los pacientes (n = 226) con respecto a los
CIP2A
estado de la expresión de ARNm en el análisis de microarrays publicado. (A & amp; B) DFS de todos los pacientes de acuerdo con el conjunto de sondas de microarrays
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s001 gratis (EPS)
figura S2..
supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con cáncer de colon en la UICC I-III etapa, agrupados de acuerdo con
CIP2A
estado de la expresión de ARNm. (A) UICC I; (B) de la UICC II; . (C) de la UICC III
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s002 gratis (EPS)
Figura S3. El análisis de regresión lineal de
relativa
CIP2A
la expresión del ARNm normalizado a dos genes de limpieza, b2MG y GAPDH (n = 104; R
2 = 0,86). La regresión lineal es altamente significativa (p & lt; 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s003 gratis (PSD)
Tabla S1. .
Primer secuencias
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s004 gratis (DOCX)
Tabla S2.
Características de los pacientes con CCR y la asociación entre el
CIP2A
expresión y las variables clínico-patológicas (invasión linfovascular y la ubicación se documentó para 100 pacientes)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s005
(DOCX)
Reconocimientos
agradecemos a cristiano Jurowich, Christoph Isbert y Andreas Thalheimer para la recogida de muestras de tumores.