Extracto
Antecedentes
metilación del ADN del promotor islas CpG se asocia con la supresión de genes, y sus perfiles únicos en todo el genoma se han relacionado con la progresión del tumor. Junto con las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, ahora se puede determinar de manera eficiente los perfiles de metilación de todo el genoma de las células cancerosas. Además, las tecnologías experimentales y computacionales hacen que sea posible encontrar la relación funcional entre los patrones de metilación específicos de cáncer y sus parámetros clínico.
Metodología /Principales conclusiones
sistema metiloma Cáncer (CMS) es una web aplicación de base de datos con base diseñado para la visualización, la comparación y el análisis estadístico de la metilación del ADN específico del cáncer humano. intensidades de metilación se obtuvieron de MBDCap-secuenciación, pre-procesados y almacenados en la base de datos. 191 muestras de pacientes (169 tumoral y 22 muestras normales) y el cáncer de mama 41 líneas celulares se depositan en la base de datos, que comprende alrededor de 6,6 mil millones secuencia asignada de forma única lee. Esto proporciona retratos epigenéticos integrales y de todo el genoma del cáncer de mama y cáncer de endometrio humano hasta la fecha. Se proponen dos puntos de vista de los usuarios a entender mejor la estructura de la metilación en el nivel genómico o alteración metilación sistémica a nivel del gen. Además, se proporcionan una variedad de pistas de anotación para cubrir la información genómica. CMS incluye funciones analíticas importante para la interpretación de los datos de metilación, tales como la detección de regiones diferencialmente metilado, el cálculo estadístico de las intensidades de metilación globales, múltiples conjuntos de genes de las categorías de importancia biológica, la interactividad con UCSC través de datos de medida de pista. Nosotros, los ejemplos también presentes de descubrimientos que utilizan el marco.
Conclusiones /Importancia
CMS proporciona la visualización y funciones analíticas para conjuntos de datos metiloma cáncer. Una amplia colección de conjuntos de datos, una variedad de funciones analíticas integradas y amplias aplicaciones con importancia biológica y traslacional hacen de este sistema potente y único en la investigación del cáncer de metilación. CMS es libremente accesible en: http://cbbiweb.uthscsa.edu/KMethylomes/
Visto:. Gu M, Doderer MS, Huang Y-W, Roa JC, Goodfellow PJ, Kizer EL, et al. (2013) CMS: Un sistema basado en web para la visualización y análisis de metilación de genoma completo de datos de los cánceres humanos. PLoS ONE 8 (4): e60980. doi: 10.1371 /journal.pone.0060980
Editor: Eric Y. Chuang, Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 31 de julio de 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 22 de abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Gu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por R01 CA069065, U54 CA113001 (Programa de Biología del cáncer Integral), CA054174 P30 (Centro de cáncer de la ayuda de subvención), NCATS 8UL1TR000149 (CTSA) de los Institutos nacionales de Salud, Texas CPRIT RP101195-C04, de Estados Unidos y por donaciones generosas de cáncer La terapia y la Fundación Centro de Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN de las islas CpG promotoras se asocia con la supresión génica en muestras de tumores en comparación con contraparte normal, y sus perfiles únicos en todo el genoma se han relacionado con la progresión del tumor y se puede utilizar para predecir la supervivencia del paciente [1]. se detectó la hipometilación Global en tumores de mama y de colon en comparación con los tejidos normales correspondientes [2], [3]. Más específicamente, en el cáncer de mama, se ha demostrado que la hipometilación del cuerpo gen está asociada con el silenciamiento de genes, mientras que la hipermetilación de las regiones cercanas a un sitio de inicio de transcripción (TSS) tiende a causar un efecto similar [4]. Además, la interacción entre la metilación del ADN y factores de transcripción (TFS) son importantes para la regulación de los fenotipos celulares humanas. Con el avance de la tecnología de secuenciación, análisis a gran escala de la metilación de todo el genoma se convierte en factible. Varios métodos experimentales se han desarrollado para capturar ADN metiladas, incluyendo MeDIP [5], MBD [6], metilC [7], y RRB [8]. Junto con las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, estos métodos pueden ahora determinar de manera eficiente los perfiles de metilación de todo el genoma de las células. Por otra parte, se han propuesto varios métodos computacionales y estadísticos para el análisis de las regiones diferencialmente metiladas (DMR). Estas tecnologías experimentales y computacionales hacen que sea posible encontrar la relación funcional entre los patrones de metilación específicos de cáncer y la supresión de genes, y su asociación con los parámetros clínico-patológicos, lo que lleva a la identificación de biomarcadores candidatos para el diagnóstico y el pronóstico [9].
Aquí se describe un nuevo sistema de metiloma cáncer que recoge de manera sistemática, organiza, analiza y visualiza un gran conjunto de datos de metilación del ADN mediante secuenciación de endometrio y de mama humanos. Los conjuntos de datos se obtienen mediante el uso de protocolo MBDCap-seq, una técnica utilizada para capturar ADN metilado mediante el uso de un dominio de unión a metil-CpG columna (MBD) de proteína seguido de secuenciación de próxima generación [10]. El bajo costo y la presentación imparcial de los perfiles de metilación de ambas regiones insulares no CpG CpG y lo hacen adecuado para el análisis de perfil de metilación de todo el genoma. 191 muestras de pacientes (169 tumor y 21 muestras normales) y 41 de cáncer de mama líneas celulares se procesaron con el protocolo MBDCap-seq, generando un total de alrededor de 6600 millones secuencia asignada de forma única lee. Los conjuntos de datos fueron pre-procesados y almacenados en una base de datos MySQL. CMS ofrece herramientas fáciles de usar para una rápida identificación de las regiones diferencialmente metilado (DMR) entre los diferentes grupos de muestras (por ejemplo, normal frente a tumores), independientemente de la proximidad del gen. intensidades de metilación se generaron por tanto de todo el genoma (resolución de 100 pb) y el gen (por cada gen anotada RefSeq) niveles. Por otra parte, la ontología de genes, vías biológicas, y otras bases de datos de genes firma molecular se han integrado en la CMS, permitiendo la comparación (a través de la metilación) de los genes funcionales y biológicos correlacionados a través de diferentes tipos de cáncer, y el examen de alteración sistémica en la vía biológica, la función y la red de interacción los niveles. Los usuarios pueden subir sus perfiles de metilación (generados a partir de las tecnologías de secuenciación de próxima generación en una resolución de 100 pb) o conjunto de genes para observar la metilación diferencial comparando con nuestra colección única de tumores. Además, los usuarios pueden descargar intensidades de metilación de una región de interés o la totalidad del genoma para su posterior análisis (haciendo clic en el enlace en la página de "Recursos" de la página web). Con CMS, los biólogos pueden acceder a cualquier gen de interés, examinar y descubrir fenómeno epigenético significativa, tales como (pero no limitados a) Diferencia de metilación entre los tipos de tumores, genes con perfiles correlacionados metilación y la concordancia, diferencialmente los genes metilados dentro de una vía, comparación de ADN marcas de metilación y la modificación de las histonas.
resultados
CMS integra la base de datos (a partir de los datos de secuenciación de todo el genoma de metilación de los cánceres humanos), la tecnología de interfaz web, y las funciones estadísticas y analíticas poderosas juntos, permitiendo genome- los perfiles de metilación amplia visualización y descubrimiento fenómeno biológico significativo de cánceres humanos (Figura S1 en el archivo S1).
Genoma MBDCap-secuenciación de endometrio y cáncer de mama
Un total de 232 muestras clínicas y líneas celulares derivadas de mama humano y las cohortes de cáncer de endometrio se procesaron y se depositan en la base de datos. Entre ellos, 77 son los tumores de mama, 10 muestras normales de mama, líneas celulares de cáncer de mama (41 ICBP [11]), 92 tumores endometriales (71 muestras no recurrentes y recurrentes 21 muestras) y 12 muestras endometriales normales. tecnología MBDCap-secuenciación se utilizó para detectar las regiones metiladas. fragmentos metilados, unidos a un dominio de unión a proteínas metil-CpG, se eluyeron para la secuenciación con el Illumina /Solexa Genome Analyzer II. Aproximadamente 12,7 mil millones fueron generados secuencia lee y el 52% de lecturas fueron asignadas a lugares únicos del genoma. la secuenciación de todo el genoma de la metilación del ADN de esta amplia serie de muestras clínicas y líneas celulares hizo que fuera un estudio único de perfiles metiloma tumoral (Figura S1 en el archivo S1). Los datos de más de 1000 muestras clínicas, incluyendo ovario, oral, colorrectal, carcinoma hepatocelular, pulmón y próstata, eventualmente serán depositados en esta base de datos.
Diseño de interfaz web y la base de datos
la interfaz web fue desarrollado en Java utilizando la SideCache [12] marco, con el apoyo de una biblioteca a disposición del público JavaScript gráficos (http://www.walterzorn.de/) para la representación gráfica y la imagen. CMB página web se implementa en un servidor web Apache Tomcat (http://tomcat.apache.org/), y apoyado por una base de datos MySQL de metilación de datos (Figura S1 en el archivo S1). Los métodos de la función y analíticos incrustados en el marco fueron escritos en letra R. Además, una API de servicios web también se implementó para permitir la integración con otros sitios web genoma. Esta interfaz web fue probado completamente en Firefox, y es también compatible con Safari y Chrome. También es compatible con IE con una función desactivada (véase la sección Visualización de conjuntos de datos de metilación)
Visualización de conjuntos de datos de metilación
CMS puede ser visualizado en dos modos distintos:. Vista genómico y el gen de visión centrada .
genómica Ver.
la vista genómico es para la visualización de todo el genoma y el análisis de la intensidad de metilación (Figura 1).
Esta página web está diseñada para el genome- amplia visualización y el análisis de la intensidad de la metilación (A, B, C). la intensidad de la metilación está calculada de antemano para un tamaño de bin 100 pb y se muestra el uso de un mapa de calor gradiente de color rojo. Una variedad de anotaciones genómicas funcionales y barras de herramientas proporcionan a los usuarios más opciones en la navegación por la página web. Los métodos estadísticos fueron incrustados, incluyendo el análisis DMR (A) y el cálculo estadístico (C). Enlaces a la UCSC genoma navegador (D) y a la vista de genes (E) están disponibles para su posterior análisis
se llevaron a cabo diferentes tipos de pistas de datos para las funciones de visualización del genoma (Figura 1A, B):. Genómica coordinar la pista (la localización genómica de la región visualizada, incluyendo el cromosoma, inicio región y posiciones finales); pista contenido de GC (el porcentaje de GC en la posición genómica, calculado en una resolución de 100 pb); h3k4me1 pista modificación de las histonas de la línea celular GM12878 (obtenido a partir de la UCSC genoma construir hg19, mesa wgEncodeBroadHistoneGm12878H3k4me1StdSig.bigWig, liftover a hg18); pistas de conservación de la secuencia de la UCSC (obtenidos a partir de la UCSC genoma construir hg18); CpG pista isla (obtenido a partir de la UCSC genoma construir hg18, http://genome.ucsc.edu); pista de anotación de genes (incluido el inicio de genes y posiciones finales, símbolo de genes y el número de acceso); y la pista (s) de intensidad de metilación (la intensidad de metilación es representada por la profundidad de color, corresponde de color rojo oscuro a alto valor metilación, blanco significa bajos o ningún valor metilación, en 100 resolución pb). anotación detallada se muestra en la vista de punta flotante cuando un usuario mueve el cursor sobre el contenido de GC, la isla CpG y pistas de anotación de genes. Un solo clic en la pista (s) perfiles de metilación puede generar un cuadro de diálogo emergente con una intensidad de metilación (lee número para esa posición en particular, esta función se desactiva en IE). La pista de la intensidad de la metilación es flexible con varias opciones (seleccionados del botón de "pistas" desplegable en la barra de herramientas). En general hay dos tipos de intensidad de metilación pistas que los usuarios pueden optar por mostrar -
Tarjetas telefónicas individuales o
Resumen
pistas. Una pista individual muestra la intensidad de la metilación de todo el genoma en 100 pb bin tamaño de cada muestra de tumor /normal de seleccionado. Los usuarios pueden optar por mostrar un tumor única (por ejemplo, de mama o de endometrio), o de todos los tumores juntos. Resumen de pista (Figura 1C, véase la sección métodos estadísticos incrustado abajo) contiene estadísticas globales de la media, la frecuencia y la diferencia con respecto a todos los tumores.
Una colección de herramientas de barras funcionales bien diseñados, en la presente página web. Los usuarios pueden navegar por el genoma mediante zoom dentro y fuera, mueven a la izquierda o hacia la derecha a lo largo de la dirección genómico, o el traslado a los genes vecinos. Los usuarios pueden buscar genes /región de interés escribiendo directamente los símbolos de genes o coordenadas región.
Análisis DMR (ver sección de métodos estadísticos incrustado abajo) se llevó a cabo en el visor genómico. En función de DMR, los usuarios pueden seleccionar muestras candidatos marcando las casillas de verificación en la pista (s) de intensidad metilación, y luego rellenar los parámetros necesarios (ver Materiales y Métodos). Los valores por defecto son preseleccionados. El DMR de salida de un archivo en un formato de texto delimitado por tabuladores (ver Materiales y Métodos). Todos los archivos de salida se generan en la demanda y eficiente, pero pueden estar limitadas por la velocidad de descarga de la red del usuario.
Se generaron Enlaces a UCSC genoma navegador (Figura 1D, véase Visualización de la metilación del ADN y las histonas la sección de datos de modificación, por ejemplo, del uso). Una lista de los genes incluidos en la región genómica actual se muestra en la parte inferior izquierda de la vista genómico página web, y los enlaces se crean para acceder a la vista centrada en el gen de los genes particulares (Figura 1E).
Gene Centric Ver.
Una forma alternativa de visualizar los datos de metilación es la vista genocéntrica que muestra el mapa de calor metilación de conjuntos de genes seleccionados (Figura 2).
Esta página web está diseñado para la visualización y análisis de metilación intensidad a nivel del gen. En la barra de herramientas, cuatro capas de opciones están disponibles para permitir selecciones conjuntos de genes específicos. intensidades de metilación de regiones promotoras de genes (+/- 2 kb alrededor región TSS) fueron pre-calculado y se muestran utilizando un mapa de calor gradiente de color rojo. Un cuadro blanco /verde en el lado del símbolo de genes muestra las regiones promotoras de este gen en particular con o sin isla (s) CpG. Al hacer clic en el símbolo de genes en el lado izquierdo del panel de mapa de calor hará que el usuario de nuevo al espectador genómico centrado en el gen seleccionado, permitiendo la visualización de los patrones de metilación de detalle.
En esta página web, los usuarios pueden escriba un símbolo de genes y visualizar el estado de metilación del gen dado en todas las muestras tumorales, junto con los primeros 40 genes más correlacionados con patrones de metilación similares calculados por correlación de Pearson (ver Materiales y Métodos). Por otra parte, cuatro capas de opciones están disponibles para permitir la selección de la función biológica específica, red de interacción, y conjuntos de genes correlacionados (Figura 2). Hay ocho clases principales de conjuntos de genes (algunos de ellos pueden incluir subconjuntos). Estos están predefinidos en la primera capa, incluidos los genes correlacionados (véase Materiales y Métodos), cromosómicas, ontología de genes, sistemas de perturbación, las vías biológicas, microRNAs, factores de transcripción, y el barrio de genes del cáncer. Los nombres de los conjuntos de genes primarios y sus fuentes se enumeran en la Tabla 1 [13] - [19]. El estado de metilación de un conjunto de genes elegido puede visualizarse para todos los tumores dentro de la CMS, o cualesquiera tipos de tumores de la selección del usuario. Grandes conjuntos de genes puede ralentizar el tiempo de presentación de metilación mapa de calor, por lo que es preferible elegir más pequeños conjuntos de genes para iniciar el proceso. La opción "Filtro de búsqueda" permite al usuario encontrar todos los conjuntos de genes (excepto aquellos entre los "genes correlacionados"), que contengan las palabras en el campo de búsqueda.
En el panel de mapa de calor, la metilación intensidades fueron pre-calculan promediando la normalizada (normalización lineal, ver Materiales y Métodos) lee el número de +/- 2-kb de un sitio de inicio de transcripción (TSS) y se almacenan en la base de datos MySQL. A diferencia de la vista genómico, el gen espectador céntrica se organiza de la siguiente manera: las muestras tumorales o normales se colocan en columnas y filas son los genes, similar al formato de microarrays común. La escala de color mapa de calor del gen visión centrada es el mismo que el de vista genómico. Las regiones promotoras con o sin isla (s) CpG están anotados con un cuadro blanco /verde en el lado del símbolo de genes. El panel de mapa de calor hace que sea posible visualizar los perfiles distintos /similares /especiales de metilación (Ver Descubrimiento por el uso de la sección CMS) entre diferentes tipos de tumores, o entre los genes dentro de las categorías biológicamente significativos similares.
Al hacer clic en el símbolo de genes en el lado izquierdo del panel de mapa de calor traerá el usuario de nuevo al espectador genómico centrado en el gen seleccionado, que permite la visualización de los patrones de metilación detalle en el promotor, el exón, intrón y sus regiones vecinas.
entrada y salida
a la vista genómico, los usuarios que deseen visualizar y analizar sus propios datos puede habilitar una pista personalizado. Los datos enviados por los usuarios son privadas, basada en la sesión (no almacena después del final de la sesión), y no vista por otras personas. Uno por otro lado, para una región de interés (menos de 1 Mbps, se muestra en la parte inferior derecha de la página Web de vista genómico), los usuarios pueden descargar las lecturas de la información (en formato CAMA) para su posterior análisis.
a la vista centrada en el gen, sino que también proporciona una opción de carga de archivos para permitir a los usuarios cargar sus conjuntos de genes personalizados (sólo símbolos oficiales de genes). El conjunto de genes de encargo se mostrará como "Entrada de usuario" en el botón desplegable de la capa de conjunto de genes. Los usuarios también pueden descargar la intensidad de la metilación del panel de mapa de calor actual haciendo clic en el botón en la parte inferior derecha de la página web.
Embedded métodos estadísticos
La hipermetilación de las islas CpG del promotor del gen es una de las alteraciones más frecuentes que conducen a cáncer, y un mecanismo epigenético importante para el silenciamiento de genes. Para permitir la detección de las regiones de metilación diferencial entre dos grupos de la muestra, la función de identificación DMR se ha incrustado en el marco. En CMS, pistas metiloma individuales (incluyendo subidas de usuario personalizada de vía) o pistas de resumen se pueden asignar a uno de dos grupos, que se define como "tratado" y "control" (véase la sección Visualización de conjuntos de datos de metilación). Un algoritmo de detección de DMR, basado en
t-test
, prueba de Wilcoxon o correlación de Pearson se puede seleccionar para evaluar la importancia de la metilación diferencial de hasta 1 mega pares de bases. La descripción del algoritmo DMR se proporciona en los Materiales y Métodos.
Además de la función de DMR, también diseñada Resumen pistas para visualizar las intensidades de metilación promediados y revelar características intrínsecas de cada grupo tumoral. Tres tipos de pistas de resumen se muestran juntos como se muestra en la Figura 1C, que son: (a) Media pista, lo que proporciona el estado de metilación promedio de más de un grupo particular de muestras. Actualmente las estadísticas de resumen se evalúan sobre i) todas las muestras, ii) Normales, tumores y líneas celulares de cáncer de mama, y iii) los tumores no recurrentes de endometrio, tumores recurrentes, y normal de endometrio; (B) seguimiento de la frecuencia de metilación (véase Materiales y Métodos). La media y pistas de frecuencia proporcionan una idea de si el cambio es la metilación de las muestras mayoritarios o minoritarios muestras con intensidad metilación grande; (C) Diferencia de pista, que visualiza la metilación diferencial por diferencia /frecuencia media entre los grupos de muestras en cada bin tamaño, tales como un tumor vs-media normal de mama, y no recurrente /recurrente vs normal frec de endometrio.
perfiles
Tumor de metilación específica
Los mecanismos de tumorigénesis son diferentes entre los tipos de cáncer, por lo que es importante encontrar diferencias genéticas /epigenética para su posterior análisis. Aquí se utilizó el gen HOXB2 (homeobox humano B2), un miembro de la familia Antphomeobox que codifica una proteína nuclear con un dominio homeobox de unión a ADN, y un gen conocido asociado con el crecimiento tumoral y la invasión [20], [21] como una ejemplo para ilustrar cómo CMS es capaz de determinar los perfiles de metilación específicos de tumores de cáncer de mama y de endometrio
.
a la vista genómico, los usuarios pueden escribir HOXB2 en el cuadro de navegación, y seleccione "Todos los tumores" en las canciones desplegable caja, a continuación, haga clic en el botón "Actualizar vista". Para una mejor visualización de los perfiles de metilación, los usuarios pueden hacer clic en el "zoom in" botón cuatro veces. Es evidente que se encontró hipermetilación entre los tumores de mama y normal (Figura 3A), que incluye cuatro regiones (
p
-valor & lt; 0,01), calculado por la función de DMR utilizando parámetros por defecto. Sin embargo, se encontró que la hipometilación entre los tumores de endometrio y tejidos normales (Figura 3B), que incluye una región con
p-valor
& lt; 10
4 (Tabla S1 en el archivo S1). Además, los usuarios pueden navegar por la pista de resumen seleccionando "Todos los resúmenes" en el cuadro desplegable pistas. La pista de media, que representa a cientos de pistas individuales, simplifica la visualización de regiones diferencialmente metilado que dan un resultado más intuitivo. Además de los genes que están hypermethylated sólo en tumores de mama (compárese con normales de mama), los usuarios también pueden encontrar genes que se hypermethylated sólo en tumores de endometrio (comparar con normales endometriales) (como CCDC81, Figura S2 en S1 File), y en ambos tumores (como SOX11, Figura S3 en File S1).
HOXB2 se hypermethylated en tumores de mama en comparación con el de mama normal (a), mientras que hypomethylated en tumores de cáncer de endometrio en comparación con lo normal endometrial (B).
perfiles de metilación similares entre los genes relacionados biológicamente
genes Homeodominio codifican factores de transcripción que afectan a la diferenciación y la proliferación durante el desarrollo. En el genoma humano, cuatro grupos de genes del homeodominio (HOXA, Hoxb, Hoxc y Hoxd) se distribuyen en los cromosomas 7p15, 17q21, 12q13 y 2q31, respectivamente. los genes del homeodominio no agrupados se distribuyen por todo el genoma. Una pregunta directa es "¿cuáles son los otros genes que muestran el mismo patrón de metilación como la de HOXB2, tal vez compartiendo el mismo mecanismo de metilación?" Continuando con el proceso anterior en la vista genómico, los usuarios pueden hacer clic en el enlace de genes en la parte inferior izquierda para obtener la vista centrada en el gen. Las 40 mejores genes correlacionados de HOXB2 se muestra en la Figura 4. La mayoría de ellos tienen un perfil similar a la metilación HOXB2, que se hypermethylated en tumores de mama (Figura 4, caja de tablero azul), y de que sea hypomethylated o no muestra diferencias en los tumores de endometrio comparar a los tejidos normales (Figura 4, la caja tablero verde).
conjunto de genes con similares perfiles de metilación de HOXB2 se encontraron por la elección de los "genes correlacionados" conjuntos de genes en la vista centrada en el gen. La mayoría de los genes están hypermethylated en tumores de mama (caja tablero azul), y sin diferencias significativas en muestras endometriales (cuadro tablero verde).
En los 40 genes correlacionados, tres de ellos pertenecen a HoxB familia de genes (HOXB2, HOXB4 y HOXB7), tres genes contienen homeodominio (DLX1, LHX4, y Vax2) y dos de ellos pertenecen a la familia de genes HIST (HIST1H3I y HIST1H4L). Un perfil de metilación similar de los genes dentro de la misma familia de genes define la concordancia de metilación, lo que puede conducir a la silenciación de genes sincronizada. Por otra parte, los usuarios también pueden encontrar los vecinos genómicas de HOXB2 eligiendo conjunto de genes "cromosómico" en la capa uno, "Chr17" en la capa dos, "q" del brazo en la capa tres y "chr17q21" en la capa de cuatro. Este cytoband abarca 287 genes, y alberga el grupo de genes HoxB incluyendo tres genes (HOXB2, Hoxb4 y HOXB7) se superponen con los genes correlacionados 40 HOXB2. Observe que los tres genes son a la vez en la misma familia de genes y la misma localización genómica, lo que puede indicar la concordancia biológica significativa para aquellos genes. Los usuarios pueden encontrar los valores perdidos por varios genes en "cromosómicas" conjuntos de genes, debido a la falta de anotación de transcripción dentro de la liberación NCBI secuencia de referencia (RefSeq) contenida en la UCSC genoma navegador o símbolos de genes obsoletos. Este fenómeno también ocurre para las otras clases de 7 categorías.
conjuntos de genes diferencialmente metiladas dentro de una vía
Para examinar el cambio sistémico de la actividad de la vía biológica o funciones que se relacionó con HOXB2 u otra familia HOX genes, se examinaron el gen siguiente establece para ilustrar el descubrimiento funcional mediante el uso de herramientas CMS. HOXB13, un miembro de la familia HOX reside en el conjunto de HOXB2 y muestra un patrón de metilación similar a HOXB2. HOXB13, es también un miembro de la "vía de andrógenos mediada", como se muestra en la Figura 5. Se muestra un patrón de hipermetilación distinto entre los tumores de mama, pero no de cáncer de mama y líneas celulares de cáncer de endometrio. En concreto, el patrón de la hipermetilación distinta de BRCA1, SNURF, GMTM2, NROB1, CDK11B, LATS2, HRAS, mapk3, RPS6KA3 y EGR1 demarcar estado de metilación del grupo de tumor de mama (no líneas celulares), junto con HOXB13.
El conjunto de genes "señalización mediada por andrógenos", que contiene el grupo de genes HOX fueron seleccionados como un ejemplo. Varios genes dentro de la caja de tablero azul se hypermethylated en tumores de mama en comparación con los tejidos normales, mientras que otros no muestran diferencias significativas. Para las muestras de endometrio, no hubo diferencia significativa se encontró para cualquiera de los genes entre los tumores y normales.
También compararon los perfiles de metilación de genes resistentes a tamoxifeno [22], y se identificaron varios genes de hipermetilación en los tumores de mama, como ACTA1, ISG15, PTK6 y Sephs2 (Figura 1E). La mayoría de ellos no mostraron diferencias significativas en muestras endometriales.
Visualización de la metilación del ADN, junto con los datos de la modificación de histonas
Un enlace URL conveniente UCSC abre la región genómica actual en la UCSC genoma navegador para los usuarios que deseen ver otros datos genómicos (parte inferior derecha de la vista genómico, la Figura 1D). Alternativamente, los usuarios pueden seleccionar hasta cuatro pistas de intensidad y ver esas pistas junto con otras pistas por defecto en el navegador UCSC genoma.
Por ejemplo, se informó gen DLC1 tener una mayor metilación del ADN en su sitio de inicio de transcripción (TSS ) región, mientras que la disminución de la modificación de histonas en H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac en la región SAT [4]. Los usuarios pueden escribir DLC1 en vista genómico página web, y se visualizó la región TSS (CHR8: 13,033,864-13,035,942) haciendo clic en el "zoom" en botones y "mover". Podemos tener la impresión general de que los tumores de mama se hypermethylated con relación a las normales de mama, mientras que los tumores endometriales no muestran ninguna diferencia con respecto a las normales del endometrio. Los usuarios pueden recoger a 4 muestras al azar marcando la casilla de verificación en el lado derecho de la página web de muestras de mama (por ejemplo, brn80, brt22, brt69 y brt37), y luego haga clic en el "Visualizar las filas seleccionadas en el botón UCSC Genome Browser" en la parte inferior derecha de la página web, para abrir una página web UCSC. Para comparar con las pistas de modificaciones de las histonas, los usuarios tienen que seleccionar "completa" para cada pista a medida y las pistas Amplio histonas. Las pistas modificación de las histonas (Figura 6) están de acuerdo con el informe anterior [4] si bien estos datos no pueden provenir de cáncer de mama. pistas personalizadas (metilación del ADN) de los cánceres de mama han aumentado metilación (similar a la anterior conclusión) con una excepción (la pista 3ª, brt22), que muestra los patrones específicos del paciente (Figura 6A). Como era de esperar, no hubo mayor metilación encontrado para muestras endometriales (Figura 6B).
La región de TSS DLC1 se utiliza como un ejemplo. 4 muestras fueron seleccionadas al azar marcando la casilla de verificación en el lado derecho de la página web de muestras de mama (por ejemplo, brn80, brt22, brt69 y brt37). La opción de "lleno" a medida para cada pista y las pistas Amplio histonas fue seleccionado para la comparación de las marcas de metilación del ADN y la modificación de las histonas. Resultados similares se obtuvieron como informe anterior [4]. Se encontró una excepción (la 3
er pista, brt22), que muestra los patrones específicos del paciente (A); y no hubo aumento de la metilación se encontró en muestras endometriales (B).
Discusión
En nuestros estudios, HOXB2 se utilizó como un ejemplo para descubrir la información biológicamente significativa por el uso de CMS . Esto se debe a HOXB2 fue encontrado como un regulador del crecimiento tumoral en el cáncer de mama [23]. Curiosamente, encontramos HOXB2 se hypermethylated en los tejidos normales del endometrio en comparación con los tumores de endometrio (Figura 3B). En el estudio anterior, HOXB2 se informó a ser importante en las células normales del endometrio [24]. Por otra parte, HOXB2, HOXB4 y HOXB7 juntos mostró la función clave en los cánceres de pulmón [25]. En nuestro estudio, también identificó que los 3 genes están correlacionados en sus perfiles de metilación. Esto podría sugerir que estos tres genes funcionan juntos en cánceres de mama y de endometrio. Además, HOXB13 y BRCA1 son todos de "vía de andrógenos mediada" (Figura 5), y se encuentran todos a ser hypermethylated en tumores de mama que los tejidos normales en nuestro estudio. Esto también es coherente con el informe previo que HOXB13 actúa como represor de la señalización del receptor de andrógenos en el cáncer de próstata, lo que puede afectar a los genes BRCA1 (cofactor asociado a AR) [26].
Ha habido varios sitios web disponibles en la epigenética anteriores publicadas informes. Uno de los más famosos es Hoja de Ruta Proyecto Epigenómica (REP) (http://www.roadmapepigenomics.org/). Este proyecto se compone de un grupo de diversas bases de datos, herramientas de navegador /visualización, y herramientas bioinformáticas. Los usuarios pueden ver muchos tipos de marcas epigenéticas en su navegador (por ejemplo UCSC REP, http://www.epigenomebrowser.org/), o descargar los datos de uno de los repositorios de datos (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/epigenomics). En comparación con la CMS, REP es más completo, tanto en la variedad de datos y herramientas derivados. Sin embargo, CMS está diseñado para proporcionar muestras de tumores clínicos, y tenemos métodos estadísticos adicionales específicamente para el análisis y la comparación de todo el genoma de esas muestras (como la detección de DMR y genes correlacionados de función).
Conclusión
En este estudio, hemos propuesto CMS para la visualización y el análisis de conjuntos de datos de metilación de los cánceres. Se recogió un gran número de conjuntos de datos y procesado en nuestra base de datos. Varias herramientas estadísticas fueron incrustados para el análisis de datos. La visualización se desarrolla a través de una interfaz web basada en Java. descubrimientos útiles se hicieron por la extensa aplicación de este marco. Un gran conjunto de datos, una variedad de herramientas y aplicación extensiva con importancia biológica y de la traducción que hace que este marco potente y único en la investigación del cáncer de metilación.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido, línea celular y MBDCap- ss
las muestras de tejido se obtuvieron como parte de nuestro trabajo en curso sobre la caracterización de alteraciones moleculares en cáncer de endometrio y de mama carcinomas.
las líneas celulares de cáncer de mama ICBP se aisló el ADN genómico de la QIAamp DNA Mini Kit ( Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante.