Extracto
CMTM3 humano se ha propuesto como un gen supresor tumoral putativo. La pérdida de CMTM3 se ha encontrado en varios carcinomas. Sin embargo, la regulación de la expresión CMTM3 y su función en la progresión tumoral siguen siendo en gran parte desconocido. A continuación, se determinó la regulación de la expresión CMTM3, la función y el mecanismo molecular en las células de cáncer de testículo humanos. CMTM3 era frecuentemente regulado por disminución o silenciado en líneas celulares de cáncer de testículo y tejidos tumorales, pero altamente expresado en los tejidos testiculares normales. El re-expresión de CMTM3 suprimió significativamente la formación de colonias, la proliferación, y la capacidad de migración de las células de cáncer de testículo mediante la inducción de una detención del ciclo celular G2 y la apoptosis. Además, la re-expresión de CMTM3 activa la transcripción de p53, la acumulación de p53 inducida, hasta reguladas la expresión de p21, y el aumento de la escisión de la caspasa 9, 8, 3, y PARP. La regulación a la baja de
CMTM3
en los tejidos tumorales clínicos se asoció con la metilación de un solo sitio CpG se encuentra dentro de la región Sp1 /Sp3-sensible del núcleo promotor. Estos resultados indican que CMTM3 puede funcionar como supresor de tumores a través de la inducción de una detención del ciclo celular G2 y la apoptosis. CMTM3 es, pues, involucrados en la patogénesis del cáncer testicular, y se frecuentemente al menos parcialmente silenciado por la metilación de un solo sitio CpG, específica en los tejidos tumorales
Visto:. Li Z, Xie J, Wu J, Li W , Nie L, Sun X, et al. (2014) CMTM3 inhibe el cáncer de testículo humano el crecimiento de células induciendo la detención del ciclo celular y la apoptosis. PLoS ONE 9 (2): e88965. doi: 10.1371 /journal.pone.0088965
Editor: Thomas G. Hofmann, el Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Alemania |
Recibido: Octubre 15, 2013; Aceptado 16 de enero de 2014; Publicado: 28 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China (subvención Nº 2014CD745200, http://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81272840, http: //www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm), y el Fondo de jóvenes científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81201579, http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los tumores de células germinales testiculares (TTCG) son comunes en hombres de 15 a 35 años y representan el 1% de todas las neoplasias malignas en los hombres [1]. La incidencia de TTCG ha aumentado dramáticamente en el último siglo [2].
TTCG originados por el gonocitos transformadas o espermatogonias indiferenciadas, que se derivan de células germinales fetales y células madre adultas germen, respectivamente. TTCG se clasifican como seminomas o tumores de células germinales no seminomatosos en función de sus características histológicas [1]. Los seminomas son los tumores de células germinales testiculares más frecuentes (50-70%). Los tumores de células germinales no seminomatosos incluyen el carcinoma embrionario celular, tumores del saco vitelino, coriocarcinoma y teratomas [1]. TTCG se han convertido en una de las neoplasias sólidas más curables, debido a los avances en los métodos diagnósticos y terapéuticos [3]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que operan en TTCG no se entienden completamente.
CKLF-como MARVEL dominio transmembrana que contiene 3 (CMTM3) pertenece a la superfamilia de genes de factor de quimioquinas como, una nueva familia que es similar a la quimiocina y transmembrana 4 superfamilias de moléculas de señalización.
CMTM3
es uno de varios genes del factor de quimioquinas como ubicados en un grupo en el cromosoma 16q22. proteína CMTM3 contiene una cremallera de leucina y dos motivos LXXLL. Esta proteína de 20 kDa se localiza en el citoplasma y sirve como un andamio para proteínas en el retículo endoplásmico y la membrana nuclear [4].
CMTM3
es altamente expresado en el sistema reproductor masculino, con el más alto nivel de expresión en los testículos [4].
Estudios anteriores también indicaron que varios miembros de la superfamilia CMTM pueden desempeñar un papel importante en los sistemas reproductivos masculinos y inmunes y en la tumorigénesis [5] - [12]. Recientemente se ha demostrado que
CMTM3
está silenciada o hacia abajo-regulada en gástrico, de mama, de la nasofaringe, esófago, colon y carcinomas renales [8], [13]. Su expresión se correlaciona inversamente con su condición de promotor de la metilación CpG [8], [13]. El re-expresión de CMTM3 en las células tumorales que carecen de su expresión conduce a la supresión del crecimiento celular y la apoptosis, lo que sugiere que CMTM3 es una novela supresor de tumor [8]. Sin embargo, su papel en el desarrollo y progresión del cáncer no ha sido claramente definido hasta la fecha.
En este estudio, se observó que
CMTM3
era con frecuencia las reguladas en los tejidos de cáncer de testículo a través de metilación en una específico, solo sitio CpG ubicada dentro de la región Sp1 /Sp3 sensible del promotor. La expresión ectópica de
CMTM3
inhibió la formación de colonias, la proliferación, la migración y la capacidad invasiva de las células del cáncer testicular. Estas funciones de CMTM3 se lograron mediante la modulación de la progresión del ciclo celular y la apoptosis.
Materiales y Métodos
Las células cancerosas y las muestras clínicas
Una línea celular humana seminoma (NCCIT), próstata líneas celulares de cáncer (LNCaP, DU145, PC3 y 22Rv1), líneas celulares de cáncer renal (OSRC-2 y 786-O), líneas celulares de tumores de vejiga se utilizaron (HTB9-5637 y T24) y una línea celular de riñón epitelial humano HEK-293 . Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco /BRL) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO
2.
veinte pares de tejidos de cáncer de testículo y los tejidos testiculares no cancerosas emparejados fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía primaria en el hospital de la Segunda Popular de Shenzhen y el hospital de Shenzhen Universidad de Pekín con pacientes o guardadores, el consentimiento escrito, y ha sido aprobado por el comité de ética del hospital de Segundo Popular de Shenzhen, Shenzhen, China. Las muestras se fijaron de inmediato, ya sea en el 10% formalina neutra para histología e inmunohistoquímica o se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C para su posterior PCR. H & amp; E-manchado diapositivas de todos los casos se revisaron para confirmar los diagnósticos. Los tumores de células germinales testiculares consistieron en 15 casos de seminoma, carcinoma embrionario 2, 1 teratoma, carcinoma embrionario 1 mixta y teratoma, y 1 tumor de células de Leydig de acuerdo a criterios de la Organización Mundial de la Salud [14]. Cinco muestras normales de tejido testicular de los adultos que se habían sometido a la autopsia de rutina también se utilizaron para los controles. Los pacientes son 6-58 años con una media de 38 años.
semicuantitativa de transcripción inversa-PCR y PCR en tiempo real
El aislamiento de ARN total y la transcripción reversa se realizó como se ha descrito previamente [15]. El análisis semi-cuantitativo por PCR de
CMTM3
se realizó usando cebadores específicos, y
GAPDH
se utilizó como control interno.
CMTM3
y
GAPDH
cebadores fueron
CMTM3
-F: 5'-TTTTATCTGCTATGTGGCGTCC-3 ', y
CMTM3
-R: 5'-TGTCTTGTGGGCTGTGGTCTC -3 ';
GAPDH
-F: 5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ', y
GAPDH
-R: 5'-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3'. Los ensayos de PCR en tiempo real se realizaron utilizando Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). El ensayo se realizó por triplicado utilizando diferentes conjuntos de cebadores:
CMTM3
-F: 5'-GCTTCTTTGCTACCATCGTGTTTG-3 ', y
CMTM3
-R: 5'-GCCTTCAGTCAG AGTCCGAGTC-3';
GAPDH
-F: 5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3 ';
GAPDH
-R: 5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3 '. El nivel de expresión relativa de
CMTM3
se determinó mediante el uso de la 2
-ΔΔCt método [16].
La extracción de proteínas y Western blot análisis
Los tejidos o células eran se lisaron mediante tampón RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa. Una cantidad de 30 g de proteína total se resolvió en SDS-poliacrilamida al 12% geles y transferidos a membranas de PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciences Piscataway, NJ, EE.UU.). Después de bloquear con BSA al 5% en solución salina tris tamponada con con 0,1% de Tween 20 (TBST) a temperatura ambiente durante 2 h, la membrana se sondó con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Después de lavar tres veces con tampón de TBST, las membranas se incubaron con IgG de rábano picante conjugada con peroxidasa. Las señales Blot se visualizaron con el sustrato Super Señal West Pico quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las membranas fueron despojados con tampón de extracción a 40 ° C durante 30 min con agitación suave y se volvieron a sondar con un anticuerpo policlonal de conejo contra β-actina (1:10000, Santa Cruz Biotechnology) como control para carga de proteína.
Construcción de plásmidos informadores promotor, transfección y luciferasa ensayo
Para construir una serie de
CMTM3
plásmidos informadores de luciferasa promotor impulsado, seis fragmentos de ADN de aguas arriba de la
CMTM3
codón de inicio fueron amplificados por PCR (PCR Primers de la Tabla S1 S1 en File) y clonado en el vector pGL3-Basic (Promega). Las inserciones se confirmaron por secuenciación directa. 293FT células PC3 y se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos a 1 x 10
5 células /pocillo y transitoriamente transfectadas con el reportero pGL3 promotor y pRLSV40 como se describe anteriormente [15], [17]. Cuando se indica, los plásmidos de expresión pCMV-SP3 (OriGene, Rockville, MD, EE.UU.) pCMV-SP1 o se co-transfectaron en las células. Se determinó la actividad de luciferasa usando el Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) y se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. Cada experimento se realizó tres veces por triplicado. La actividad se define como la relación de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla. Para el
in vitro
ensayo de metilación en el
CMTM3
fragmento del promotor, Sss I metilasa se utilizó como se informó anteriormente [15].
tratamiento con bisulfito de ADN y análisis de metilación
La modificación con bisulfito del ADN y bisulfito de secuenciación genómica (BGS) se realizaron como se describe anteriormente [15], [18]. Bisulfito de secuenciación de cebadores de PCR (BGS-F, TAGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA, y BGS-R, ACCTTTAAAAAAACAAAAAAAAACCC) fueron diseñados utilizando el programa en línea, MethPrimer (http://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) [19]. PCR se realizó durante 40 ciclos con Hotstart Taq polimerasa (Qiagen, Hilden, Alemania). Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI). De ocho a diez clones blancos para cada muestra fueron seleccionados al azar para la secuenciación.
La inmunohistoquímica
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de CMTM3 usando una técnica estándar de dos etapas como se describe anteriormente [15]. Después de la desparafinación y rehidratación, los portaobjetos de tejido se cocinan para recuperar el antígeno en un horno de microondas con tampón de 10 mM de citrato (pH 6) durante 15 min. Los portaobjetos se sumergieron en 3% H
2O
2 para 20 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena, se lavaron con PBS, y se incubaron con suero bovino normal 3% en TBS durante 30 min para evitar la unión no específica de el anticuerpo primario. A continuación, las diapositivas de tejido se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo contra purificada CMTM3 (1:500, proporcionado amablemente por el Dr. Han, Pekín Centro Universitario de Genómica de Enfermedades humano) o IgG de conejo normal como control a 4 ° C durante la noche. Después de lavar tres veces con PBS, los portaobjetos se incubaron con cabra anti-IgG de conejo-HRP (sc-2030, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después del lavado, los tejidos se tiñeron con una solución recién preparada de DAB (Dako, Carpinteria, CA) y se visualizaron y fotografiaron con una Leica DM4000B (Leica Microsystems, Inc.).
Se evaluó la expresión inmunohistoquímica de CMTM3 basan un representante campo de gran aumento de los puntos de la matriz de tejido 2 por dos investigadores independientes. La expresión de CMTM3, basado en el cálculo de una puntuación total inmunotinción (TIS) como el producto de una puntuación proporción (PS) y una puntuación de intensidad (IS), se cuantificó bajo el microscopio y se divide en cuatro subgrupos: ninguna expresión (0-4) ; expresión débil (+: 5,6,8); una expresión moderada (++: 9,10,12); expresión intensa (+++: 15). [20]
infección por adenovirus
El adenovirus con el
CMTM3
gen (Ad
CMTM3
) y el adenovirus vacío (Ad-null) fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Dr. Han [7]. células NCCIT se sembraron a 5000 células /cm
2 en placas de cultivo de tejido, y después de 24 h, la infección se llevó a cabo mediante la exposición de las células a adenovirus en la multiplicidad requerida de infección (MOI) en medios de cultivo celular libre de suero durante 60 min, seguido por la adición de medio que contiene suero durante 1-4 días.
la proliferación celular
para el análisis de la proliferación celular, las células fueron infectadas NCCIT como anteriormente, y se midió la proliferación celular a las 24, 48 y 72 h usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8) siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia espectrofotométrica a 490 nm se midió utilizando un lector de microplacas. Los datos se presentan como la media de al menos tres experimentos independientes.
Colonia ensayo de formación de
Las células fueron infectadas con Ad-
CMTM3
o Ad-nulo. 24 h después de la infección, se sembraron 1000 células en cada pocillo de placas de 6 pocillos y se mantuvieron en medio completo durante 2 semanas. Las colonias supervivientes (≥ 50 células por colonia) se fijaron con metanol, se tiñeron con cristal violeta, se contaron y se fotografiaron. Cada experimento se realizó por triplicado y se realizó tres veces.
cicatrización de heridas ensayo
Para el ensayo de cicatrización de heridas in vitro, las células infectadas con Ad-
CMTM3
o Ad -null se cultivaron en placas de seis pocillos hasta la confluencia. A cero recta se ha creado a través de la capa de células usando una punta de micropipeta estéril, y se removieron los residuos por lavado de las células con medio libre de suero. Las células fueron fotografiados 0 y 36 h después de la herida. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Ensayos de apoptosis
La muerte celular apoptótica se evaluó por citometría de flujo utilizando la Anexina V-FITC /PI Kit de detección de apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 72 h, se recogieron las células y se incubaron con anexina V-FITC y PI de 30 min en la oscuridad a 4 ° C. se realizó inmediatamente el análisis de citometría de flujo. Los datos se presentan como gráficos de puntos bi-paramétricos que muestran Anexina V-FITC fluorescencia verde frente a fluorescencia roja PI. Los experimentos se realizaron tres veces.
PCR cuantitativa para la vía de la apoptosis
Cuarenta y ocho horas después de que las células fueron infectadas con Ad-
CMTM3
o Ad-nulo, las células fueron cosechadas , y el ARN total se aisló y se purificó con el Kit de Aislamiento de ARN RNeasy (Qiagen). Una cantidad de 2 g de RNA total se usó para sintetizar ADNc con el Kit de RT2 Primera Strand (SABiosciences, QIAGEN). Los ADNc se añadieron a una placa de 96 pocillos de la RT
2 Profiler PCR sistema de antenas (apoptosis humano array PCR). RT-PCR cuantitativa para 84 genes relacionados con la apoptosis humana se llevó a cabo utilizando el sistema ICycler iQ5 PCR en tiempo real (Bio-Rad, Hercules, CA). El análisis de datos se realizó utilizando el ΔΔ
C
T
método con cinco genes de mantenimiento (
GAPDH
,
RPL13A
,
B2M
,
ACTB
, y
HPRT1
) seleccionada para la normalización. Las transcripciones fueron considerados como ausentes si C
t & gt; 35 y se eliminaron del análisis. Los cambios en la expresión génica se determinaron mediante la comparación de los niveles de transcripción de genes en las células infectadas con Ad-CMTM3 a las células infectadas con Ad-nulo.
análisis del ciclo celular
Cuarenta y ocho horas después de que las células fueron infectadas con Ad
CMTM3
o Ad-nulo, se tripsinizaron las células, se lavaron dos veces, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en helado de etanol al 70%. Después las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI), el análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo en una clasificación de células activadas por fluorescencia escáner. La distribución del ciclo celular se analizó con el software Cell Quest.
Los análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 19. El análisis de la expresión de CMTM3 entre los tejidos de cáncer de testículo y de los tejidos adyacentes correspondientes se evaluaron mediante la prueba t de Student. Las comparaciones de las variables categóricas se realizaron mediante el x
2 test o prueba t de 2 colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si el valor de p fue inferior a 0,05.
Resultados
CMTM3 es downregulated con frecuencia en los cánceres testiculares
Para investigar el papel de CMTM3 en el cáncer urogenital, lo primero que preguntó la base de datos Oncomine [21] para evaluar los niveles de expresión relativa de
CMTM3
en el cáncer urogenital. Dos estudios independientes demostraron que
CMTM3
expresión se disminuyó de forma estadísticamente significativa en los tumores testiculares [22], [23] (Figura 1A, 1B). También medimos
CMTM3
niveles de mRNA en 10 líneas celulares de cáncer urogenital. En comparación con la alta expresión de
CMTM3 Hoteles en tejidos normales testículo humano, la expresión de
CMTM3
fue silenciada en una línea de células de seminoma (NCCIT) y las reguladas o silenciados en 2 de 4 próstata líneas celulares de cáncer, 2 de 3 líneas celulares de cáncer renal y en ninguna de las líneas celulares tumorales de vejiga estudiados (Figura 1C). Además, se analizó la expresión de
CMTM3
en 20 tejidos tumorales testiculares pareadas y los correspondientes tejidos adyacentes benignos.
CMTM3
niveles de mRNA fueron silenciados o muy downregulated en 16 de 20 casos de cáncer de testículo con una disminución de 5 veces en general en comparación con el correspondiente tejido adyacente benigna (
P
= 0,002) (Figura 1D) . Los resultados se confirmaron en los niveles de proteína por tinción inmunohistoquímica (Figura 1E)
.
(A y B) La expresión de CMTM3 en muestras individuales procedentes de tejidos normales o de testículo cáncer de testículo se muestra (datos normalizados a la escala de log2 los conjuntos de datos Sperger [23] y Korkola [22]). Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba t de Student, con valores de p se indican en cada panel. (C) La expresión de
CMTM3 Hoteles en tejidos testiculares normales y líneas celulares de cáncer urogenital se determinaron por tiempo real RT-PCR. Los datos se muestran como la media ± S.D. para tres experimentos independientes. (D) La expresión de
CMTM página 3 de cada 20 muestras de tumores testiculares y tejidos testiculares normales emparejados se determinó por tiempo real RT-PCR. Los datos se muestran como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. (E) tinción inmunohistoquímica Representante para CMTM3 en muestras de tumores testiculares y tejidos testiculares normales emparejados.
Además, extendemos el análisis de la expresión CMTM3 a una cohorte independiente de microarrays de tejido testicular mediante técnicas de inmunohistoquímica (Tabla 1, Figura S1 S1 en el archivo). De los 75 casos de tumores testiculares, 36 (48%) casos de tumores no mostraron expresión CMTM3, 27 (36%) casos de tumores tenían una baja expresión CMTM3, y 12 (16%) casos de tumor tenía expresión CMTM3 moderada. Todos los casos de 18 (100%) de los tejidos normales adyacentes de cáncer y tejidos testiculares normales tenían expresión CMTM3 intensivo intensivo o fuerte (Tabla 1). Todo caso de 8 (100%) de la atrofia tenía expresión CMTM3 intensivo. Es importante destacar que no se observó ningún caso en CMTM3 tinción fue más intensa en el tumor que en testículos normales, destacando aún más la especificidad del patrón observado (Tabla 1). También se investigó la correlación entre las expresiones CMTM3 en el seminoma con los parámetros patológicos, y se dio cuenta de que la disminución CMTM3 se asoció significativamente con el estadio T avanzados (Tabla S2 en Archivo S1).
Re-expresión de CMTM3 inhibe la célula el crecimiento y la migración celular
El silenciamiento de
CMTM3
en el cáncer testicular indicó que CMTM3 podría ser un supresor tumoral funcional en la carcinogénesis testicular. Para investigar el efecto inhibidor del crecimiento de los
CMTM3
, la re-expresión de
CMTM3 Hoteles en las células infectadas transitoriamente NCCIT fue confirmada por RT-PCR y Western Blot (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2B, el crecimiento celular se redujo significativamente en Ad-
CMTM3
infectado con células NCCIT en comparación con células de control Ad-null-infectada. El efecto supresor sobre el crecimiento celular del cáncer se confirmó adicionalmente mediante un ensayo de formación de colonias. número de colonias se redujeron significativamente en comparación con las células de control al 32% en las células infectadas con Ad-NCCIT
CMTM3
(P & lt; 0,01). (Figura 2C)
(A) Expresión de CMTM3 en células NCCIT después de la infección con Ad-CMTM3 se confirmó mediante RT-PCR y transferencias de Western. la proliferación (B) de la célula se detectó mediante el ensayo de WST-1 en las células NCCIT después de la infección con Ad-nulo o Ad
CMTM3
. (C) Los resultados representativos de los ensayos de colonias de formación con células NCCIT. (D) La migración se determinó mediante un ensayo de cicatrización de heridas en las células NCCIT infectadas con Ad-nulo o Ad-
CMTM3
. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Además, el efecto de CMTM3 sobre la motilidad de células de cáncer de testículo se examinó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Las monocapas confluentes de células se rascaron para formar heridas y luego se cultivaron durante 24 h. CMTM3 expresión ectópica llevado a reducir significativamente la cicatrización de heridas migración de las células en comparación con las células infectadas con Ad-nula (Figura 2D). Ad
CMTM3
células transfectadas se convirtieron en redondo y extraído, mientras que no se observó ningún cambio obvio en Ad-nulos células infectadas, lo cual es coherente con un informe anterior [8].
Re- expresión de CMTM3 induce la detención del ciclo celular en G2 fago y apoptosis de las células
el marcada supresión de la proliferación por CMTM3 nos llevó a evaluar los efectos de CMTM3 en la distribución del ciclo celular y la apoptosis de las células de cáncer de testículo. Los resultados representativos de la distribución del ciclo celular en Ad-null- o Ad-
CMTM3
infectado con células NCCIT se muestran en la Figura 3A. Citometría de flujo El análisis reveló una detención significativa G2 del ciclo celular en las células que expresan CMTM3-en comparación con las células de control infectadas (Figura 3A).
(A) análisis del ciclo celular Representante. Los resultados se representan como la media ± S.D. y se basan en tres experimentos independientes (p & lt; 0,01). fases G1 y G2 en rojo, S fases en blanco. (B) células NCCIT infectadas con Ad-nulo y Ad-
CMTM3
se marcaron con FITC-anexina V /PI, y la apoptosis se evaluó por citometría de flujo. (C) Análisis de transferencia Western de ciclo-celular y las proteínas relacionadas con la apoptosis en
CMTM3
infectados células NCCIT Ad-null- y administrativos. β-actina se utilizó como control. Todos los experimentos se realizaron tres veces. (D) Una representación esquemática del modelo propuesto representa una ruta de apoptosis independiente de p53 en los tumores testiculares.
También se investigó el efecto apoptótico de CMTM3 en células de cáncer de testículo usando Anexina V-FITC /PI tinción ensayos. La proporción de células con anexina V-positivo /PI-positivas se incrementó en un 15,4% en Ad
CMTM3
-transduced células NCCIT (Figura 3B). Estos resultados indican que el efecto inhibidor sobre la proliferación celular por CMTM3 más probable es mediada por la detención del ciclo celular en G2 y la apoptosis.
CMTM3 induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en una manera independiente de p53
Para explorar el mecanismo molecular de la detención del ciclo celular inducida por CMTM3, se evaluó el efecto de CMTM3 re-expresión en la expresión del regulador del ciclo celular, p21. Como se muestra en la Figura 3C, CMTM3 puede aumentar los niveles de ARNm y de proteína de p21.
Para determinar el mecanismo molecular de la apoptosis inducida por CMTM3, hemos utilizado la apoptosis humano RT
2 Matriz Profiler PCR, que contiene 84 genes apoptóticos conocidos, para monitorear los perfiles de expresión de células infectadas con Ad-NCCIT
CMTM3
. Para nuestra sorpresa, los resultados demostraron que
TP53
y una serie de genes (
APAF1
,
BAX
, y
BCL10
) fueron significativamente arriba regulado (Tabla 2). Estos resultados se verificaron mediante qPCR con diferentes cebadores que los utilizados en la matriz de PCR. Los niveles de proteína también se incrementaron en una magnitud similar (Figura 3C, Tabla 2).
A continuación, se exploró la activación de la vía apoptótica mediante análisis Western. Como se muestra en la Figura 3C, el fragmento escindido de la caspasa-3 se incrementó marcadamente, mientras que pro-caspasa-3 se redujo notablemente en la re-expresión células de cáncer de testículo CMTM3 comparación con los controles (Figura 3C). Re-expresión de expresión de la proteína caspasa-9 CMTM3 también promovió notablemente en las células de cáncer de testículo. Mientras tanto, se observó un aumento de poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa en células transfectadas-CMTM3 pero rara vez se detectó en células de control (Figura 3C). Estos datos sugieren que CMTM3 facilita la apoptosis de células de cáncer testicular de una manera independiente de p53, como p53 no es completamente funcional en las células NCCIT [24] (Figura 3D).
metilación de un sitio específico, de un solo CpG en clínica especímenes de cáncer de testículo se asocia significativamente con la expresión del transcrito CMTM3
a medida que la regulación epigenética está implicado en la expresión de
CMTM3
[8], nos preguntamos si
CMTM3
metilación del ADN promotor es asociada con una reducción correspondiente en la expresión CMTM3 en los cánceres testiculares.
Para definir la región de promotor que controla
CMTM3
expresión, se generaron una serie de construcciones del promotor truncado y se insertó en los vectores indicadores de luciferasa pGL3, y la actividad del promotor se determinó por el ensayo de luciferasa. Como se muestra en la Figura 4A, se encontró que la actividad del promotor más significativo en un fragmento ~ 400 pb (-343 a -83 pb de iniciar el sitio codón). Dos supuestos sitios de unión para los elementos Sp1 /Sp3 en el fragmento de ~ 400 pb fueron identificados por los programas de software de predicción motivo factor de transcripción.
(A) La actividad del promotor de las construcciones de deleción CMTM3 humanos en 293FT y PC3 células. Las células fueron transfectadas con constructos de 0,8 g pGL3-básicos o reportero de luciferasa que contienen diferentes fragmentos del promotor tamaño. (B) Efectos de Sp1 /Sp3 sobre la expresión del gen indicador. 293FT células PC3 y fueron transfectadas con pCMV
Sp1 /Sp3
plásmidos de expresión o el vector vacío como control. (C) El fragmento del promotor (pGL-D) y el fragmento vitro metilado en (pGL-PD SssI) se transfectaron en 293FT y PC3 células, y se realizó un ensayo de luciferasa. Todas las construcciones se cotransfectaron con pRLSV40 vector como un control interno para eficiencia de transfección. La actividad de luciferasa se expresa como el porcentaje de actividad del control. Los datos se expresan como la media ± EE
Para confirmar si el correspondiente
cis-actuando elementos
, SP1 y SP3, están involucrados en la regulación de
CMTM3
expresión génica, y 293FT células PC3 fueron co-transfectadas con el constructo pGL3-
PD Opiniones y pCMV
Sp1
o pCMV
Sp3
. Luciferase ensayos de gen reportero mostraron que la sobreexpresión de Sp1 o Sp3 podrían aumentar significativamente
CMTM3
la actividad del promotor (Figura 4B). Por otra parte, la actividad del promotor CMTM3 se redujo drásticamente después de la metilación (Figura 4C).
A continuación realizó la secuenciación de bisulfito de 53 sitios CpG incluyendo el
CMTM3
región núcleo promotor (-353 a 126 pb de iniciar el sitio codón) en 13 muestras de tumores de testículo primaria emparejados (Figura 5A). Los resultados mostraron que un solo sitio CpG a -155 pb, que se encuentra en la unión de los dos sitios de unión Sp1 /Sp3, fue metilado más significativamente en los tejidos tumorales (40,4% y 9,0%, respectivamente), en la que
CMTM3
se había reducido regulado, que en los correspondientes tejidos no tumorales (Figura 5B). Sin metilación del ADN significativa se observó en los otros 52 sitios CpG. Se observó una asociación inversa estadísticamente significativa entre la metilación del sitio CpG solo a -155 pb y el nivel de
CMTM3
la expresión de ARNm en muestras clínicas (
P = 0,01
, R
2 = 0,246) (Figura 5C). Este hallazgo sugiere que
CMTM3
la transcripción en el cáncer testicular se determina, al menos en parte, por la metilación de un sitio específico, solo CpG dentro de la
CMTM3
región promotora.
(A) estructura esquemática del gen CMTM3, islas CpG, sitios de unión del factor de transcripción putativo y el sitio de inicio de transcripción. Los exones se indican mediante rectángulos verdes. El sitio de inicio de la traducción se indica mediante una flecha curva. La flecha hacia abajo indica el sitio de unión potencial para Sp1 /Sp3. cebadores BGS para los análisis de metilación se indican. (B) La metilación de la región promotora se analizó por CMTM3 BGS. Se muestra la metilación de 8 sitios CpG en la región núcleo promotor para 3 tumoral emparejados y los correspondientes tejidos adyacentes benignos. (C) La metilación del sitio CpG solo a -155 pb de la región promotora para CMTM3 13 tumor emparejados y tejidos adyacentes correspondiente benignos, representa como la expresión CMTM3 mRNA en tejidos de cáncer de testículo. Se observa una correlación negativa estadísticamente significativa. La correlación de Pearson, p = 0,01, R
2 = 0,246.
Discusión
CMTM3
está altamente expresado en testículos normales [25], pero su papel en el cáncer testicular sigue siendo difícil de alcanzar. En el presente estudio, encontramos que
CMTM3
se downregulated frecuencia o silenciados en líneas celulares de cáncer testicular y tumores primarios (Figura 1, Tabla 1) .We llevaron a cabo otros estudios funcionales en las células NCCIT para dar a conocer la función biológica de CMTM3. Se encontró que la re-expresión de CMTM3 deteriora fuertemente la motilidad NCCIT celular y la formación de colonias suprimida (Figura 2), que era consistente con informes anteriores en otros tipos de cáncer [8], [13]. Análisis del ciclo celular demostró que CMTM3 inhibe la proliferación celular mediante el aumento de la proporción de células en la fase G2 y la promoción de la apoptosis de células (Figura 3A, 3B). Estos datos sugieren que las funciones de CMTM3 como un supresor tumoral en TTCG. Estudios anteriores mostraron que las proteínas de la familia, incluyendo CMTM CMTM3 [8], CMTM5 [26], [27], y CMTM8 [28], [29], puede inducir la apoptosis de las células. Sin embargo, la vía apoptótica y el mecanismo sigue siendo difícil. En el presente estudio, se encontró que la re-expresión de CMTM3 en las células NCCIT promueve la transcripción de
TP53
,
P21
, y
BAX
, y el aumento de su proteína los niveles de una magnitud similar (Tabla 2, Figura 3C). p53 no es completamente funcional en las células NCCIT, lo que sugiere que no hay una clara correlación entre la trans-activación de p53 y la inducción de apoptosis en las células NCCIT [24]. Sin embargo, p21 aumentó de forma significativa. Por lo tanto, se planteó la posibilidad de que CMTM3 podría inducir una detención del ciclo celular G2 y facilitar la apoptosis de las células a través de p21 u otras vías de una manera independiente de p53, como se informó en otros estudios (Figura 3D) [30] - [32].
la baja regulación de los supresores de tumores se asocia con la inhibición de la transcripción a través de la inducción de modificaciones epigenéticas represivas en el promotor, incluyendo la metilación del ADN y la modificación de las histonas [33].