Extracto
El estrés se ha propuesto ser un factor promotor de tumores a través de la secreción de neuromediadores específicos, como Urocortin2 y 3 (Ucn2 /3), sin embargo, su papel en el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo difícil de alcanzar. Hemos observado que Ucn2 /3 y su receptor de la corticotropina Liberar receptor del factor de 2 (CRF2) fueron hasta reguladas en alto grado y pobremente diferenciado CRC. Esto sugiere un papel para CRF2 en la pérdida de la organización celular y la progresión del tumor. El uso de células HT-29 y SW620, dos líneas celulares de CRC que difieren en sus capacidades para realizar contactos célula-célula, se encontró que las señales de CRF2 a través de /ERK vía Src para inducir la alteración de las uniones célula-célula y la lanzadera de p120ctn y Kaiso en el núcleo. En las células HT-29, esta vía de señalización también conduce a la remodelación de la adhesión celular por i) la fosforilación de la Quinasa de Adhesión Focal y ii) una modificación del citoesqueleto de actina y los complejos de adhesión focales. Estos acontecimientos estimulan la migración celular y la invasión. En conclusión, nuestros resultados indican que la señalización de CRF2 controles organización celular y puede promover el potencial metastásico de las células CRC humanos a través de una transición epitelio-mesenquimal como proceso. Esto contribuye a la comprensión de los efectos promotores de tumores de moléculas de tensión y designa Ucn2 /3-CRF2 tándem como un objetivo de prevenir la progresión de la CRC y la agresividad
Visto:. Ducarouge B, Pelissier-Rota M, M Lainé , Cristina N, Vachez Y, Scoazec JY, et al. (2013) CRF2 señalización es una novela Regulador de la adhesión celular y la migración de células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (11): e79335. doi: 10.1371 /journal.pone.0079335
Editor: Alice Y. W. Chang, Memorial Hospital Chang Gung de Kaohsiung, Taiwán
Recibido: 1 de julio de 2013; Aceptado: 30 de septiembre de 2013; Publicado: 18 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ducarouge et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (www.arc-cancer.net), la Ligue Nationale contre le Cancer (www.ligue-cancer.net), Asociación François Aupetit (www.afa.asso.fr), GEFLUC (www.gefluc.org) y el cáncer de ESPOIR Isère (www.espoir-isere-cancer.com). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. El grado histológico es un importante marcador pronóstico como de alto grado, tumores poco diferenciados suelen ser más agresivo e invasivo que su bajo grado, homólogos bien diferenciados. Una característica distintiva de CRC es la pérdida de la organización celular. interacciones adhesivas entre células y la matriz extracelular (ECM) son factores determinantes de la organización del tejido y sus modulaciones participan en la migración celular y la metástasis tumoral.
En las células epiteliales, la adhesión célula-célula se mantiene a través de varios complejos de proteínas tales como adherentes uniones (AJ). Las cadherinas son proteínas transmembrana que nuclean AJ formando homotipica de calcio dependientes de interacciones con cadherinas de las células vecinas. La manipulación de la función de E-cadherina en el epitelio intestinal ha revelado un papel importante en la diferenciación celular o la adhesión celular /matriz [1]. E-cadherina se ve disminuida en el CCR invasivo, junto con la adquisición de un fenotipo mesenquimal [2]. El dominio intracelular de la E-cadherina interacciona directamente con ß-catenina y p120 (CTN). Regulan AJ mediante el control de la agrupación cadherina, endocitosis o estabilidad y anclaje del citoesqueleto de actina (revisado en [3]). En E-cadherina células deficientes p120ctn servicio de enlace con el citoplasma y /o núcleo donde se ejerce diferentes funciones dependiendo de sus socios [4], [5]. En el núcleo, p120ctn puede interactuar con el factor de transcripción Kaiso y alivia su actividad de los genes represión [6], [7]. localización nuclear anormal de p120ctn y Kaiso es pronóstico de la agresividad en el CCR [8].
Micro-ambiente controla la progresión del cáncer a través de los contactos celulares o señales mediadoras [9]. El factor de liberación de corticotropina (CRF) y análogos como urocortins (Ucns) [10] se secretan péptidos relacionados con el estrés. Actúan a través de dos receptores acoplados a proteínas G, CRF1 y CRF2, con diferentes afinidades [11]. CRF y Ucn1 unen ambos receptores, mientras que Ucn2 /3 son selectivos para CRF2. receptores de CRF se acoplan principalmente a Gαs y desencadenar la formación de AMPc a través de la adenilato ciclasa de activación [12]. Si el sistema de CRF está bien documentado en el tracto gastrointestinal para su expresión y regulación por el estrés y la inflamación, su implicación en CRC es poco investigado [13], [14]. Ligandos y receptores se expresan y se secretan por diversas células normales y cancerosas. Por lo tanto, el sistema de CRF podría modular el tumor micro-entorno por activaciones autocrinos /paracrinos en células de cáncer o del estroma [9], [15], [16]. El objetivo de este estudio fue determinar la expresión de CRF2 y sus ligandos en el CCR y cómo su señalización podría participar en la progresión tumoral. Nuestros resultados describen la expresión aberrante de CRF2 y ligandos en ambos tumores y líneas celulares de CRC, en función de su grado y /o estado de diferenciación. El uso de las líneas de células HT-29 y SW620, descubrimos que la señalización de CRF2 modifica la adhesión celular y estableció un mecanismo por el cual subrayan moléculas pueden participar en la progresión tumoral.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
las líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano HT-29 y SW620 obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% en DMEM que contenía glucosa 25 mM (Invitrogen , Cergy Pontoise, Francia) y suplementado con 10% FCS, 5% de penicilina y estreptomicina. El constructo de CRF2 humano-GFP se clonó en el vector de expresión pBabe. Las infecciones retrovirales de las células HT-29 se realizaron como se describe anteriormente [17] y después se cultivaron en medio que contenía 2 mg /ml de puromicina (BD Biosciences), siguiendo a la selección por FACS de células infectadas por virus.
anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos policlonales dirigidos contra CRF2 eran de Abcam (12964, París, Francia). El péptido de inmunización usado para generar el anticuerpo CRF2 fue diseñado en la secuencia conservada de las isoformas alfa, beta y gamma. Este anticuerpo sería entonces reconocer todas las isoformas del receptor. anticuerpo monoclonal anti-humano de E-cadherina (HECD1) se obtuvo de Takara Bioquímicos (Cambrex Bio Science, París, Francia). El anticuerpo monoclonal contra p120ctn (clon 98) se adquirió de BD Transduction Laboratories (Pont de Claix, Francia). Anti-actina, los anticuerpos policlonales anti-MMP3, y anti-Kaiso, los anticuerpos monoclonales anti-vinculin se obtuvieron de Sigma Aldrich (L'Isle d'Abeau, Francia). Los anticuerpos policlonales dirigidos contra Src-P
Tyr418 se adquirieron de Calbiochem MBL (Fontenay-sous-Bois, Francia), monoclonal anti-Src y anticuerpos anti-MMP7 eran de Millipore (Molsheim, Francia). Los anticuerpos monoclonales contra ERK y ERK-P
Tyr204 eran de laboratorios de transducción de BD y Santa Cruz de TEBU (Le Perray en Yvelines, Francia), respectivamente. Policlonales anti-FAK-P
antobodies Ser910 se obtuvieron de Invitrogen (Cergy Pontoise, Francia). cabra Alexa-conjugado anticuerpo secundario anti-ratón se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR). Horse Radish cabra peroxidasa conjugado anticuerpo secundario anti-ratón se obtuvo de Bio-Rad (Marnes-la-Coquette, Francia), los anticuerpos anti-conejo de burro fueron obtenidos de Jackson Immunoresearch (Immunotech, Marsella, Francia). Topro3 se adquirió de Invitrogen. Urocortins, CRF y astressin 2b fueron adquiridos de Sigma Aldrich.
cohorte de pacientes, tejido micro arrays e inmunohistoquímica
Este estudio se realizó sobre cDNA de una cohorte de 30 pacientes con CCR. Las muestras de tumor y los tejidos congelados peritumoral se obtuvieron del Banco de tejido tumoral Hospices Civils de Lyon, apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (INCA) y el Ministerio de Sanidad francés. El banco de tejidos se ajusta a la normativa francesa. Todos los pacientes han dado su consentimiento informado por escrito para el uso de muestras de tejidos con fines de investigación; en ausencia de consentimiento informado, muestras de tejidos de pacientes que se sabe que fallecido también podrían usarse para fines de investigación, de acuerdo con la reglamentación francesa. Procedimientos para la recogida, el almacenamiento y la liberación de las muestras de tejido están en conformidad con las recomendaciones nacionales e internacionales y un programa de gestión de la calidad se ha desarrollado. Todos los proyectos presentados al banco de tejidos son revisados y aprobados por su Comité Científico, que también verifica su conformidad con las normas éticas. Para preservar el anonimato, un ID específico se atribuyó a cada paciente. Para cada muestra, el ADNc a partir de tejido tumoral fue emparejado con el ADNc del tejido normal adyacente. Las etapas de los tumores se definen de acuerdo con el estado TNM de los tumores (American Joint Committee on sistema de estadificación del cáncer). Tejido micro arrays (TMA) CDA3 se adquirieron en el peso súper BIO CHIPS (Corea). El portaobjetos se bloquea en TBS /BSA 3% /Tween-20 0,1% y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anti-CRF2 en 1:100. Cuanto más IHC se realizó con Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, Courtaboeuf, Francia), se contratiñeron con 1 min de incubación en hematoxilina, se deshidrataron y se montó con DPX. Cada microscopio adquisiciones se redujeron en "TRIBUN" y cuantificados con la imagen cuantificaciones J. La IHC se realizaron en ImageJ FICA con la función CIE Lab de la segmentación basada en el color de umbral para separar la tinción CRF2 de la contra-tinción hematoxilina. Seis campos diferentes de cada muestra fueron segmentados y el valor de gris medio se calculó para el CRF2 y la hematoxilina. La intensidad CRF2 para cada muestra es la media de la relación de CRF2 /hematoxilina calculado sobre los seis campos diferentes.
fraccionamiento de la célula
Para fraccionamiento nuclear, de células se lisaron en HEPES 10 mM /MgCl2 1,5 mM /KCl 10 mM /DTT 0,5 mM /NP40 0,05% /pH 7,9. Después de una centrifugación de 10 min a 3000 rpm y 4 ° C, los pellets se resuspendieron en HEPES 5 mM /MgCl2 1,5 mM /EDTA 0,2 mM /DTT 0,5 mM /glicerol 26% (v /v) /pH 7,9, y se homogeneizaron con 20 completa accidentes cerebrovasculares en Dounce. Después de 30 min de incubación en hielo, los lisados se centrifugaron 20 min a 24000 g y 4 ° C. Los sobrenadantes que contienen extractos nucleares fueron analizados por inmunotransferencia.
inmunotransferencia e inmunoprecipitación
Un total de lisados o fracciones subcelulares fueron procesadas para la inmunotransferencia como se describe anteriormente [18].
tinción de inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y luego se trató como se describe anteriormente [18]. Después de la fijación con PFA 4% de sacarosa, los sitios no específicos se bloquearon durante 1 hora a 37 ° C con 3% de BSA 0,5% Tween20. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora a 37 ° C con anticuerpos específicos que se diluyeron en la solución de bloqueo en 1:100 para primaria y 1:500 para anticuerpos secundarios. fotomicrografías de fluorescencia se tomaron con un microscopio confocal en el objetivo × 100 (Leica TCS SPE) o un microscopio de epifluorescencia en el × 100 objetivo (ZEISS, AvioVert 200M).
RT y qPCR
Total extracciones de ARN se realizaron usando Trizol
TM reactivo y 1 g de ARN total fue desnaturalizado y posteriormente procesadas para la transcripción inversa usando M-MLV (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizaron con un ciclador de luz 480 y la biblioteca de sondas universales (Roche). Las secuencias de cebadores y sondas se resumen en la Tabla 1.
Preparación de ECM y la adhesión celular
placas de cultivo de tejidos fueron recubiertas con LM-332 usando los siguientes métodos: células epidermoides A431 se cultivaron a confluencia en varias superficies a 37 ° C para permitir el depósito de LM-332, a continuación, se eliminaron las células como se describe anteriormente [19], [20]. Brevemente, las monocapas confluentes se extrajeron secuencialmente con 1% (v /v) de Triton X-100 en PBS, seguido de 2 M de urea en 1 M NaCl. Las placas se lavaron en PBS, se incubaron con 1% de BSA, y se almacenaron a -20 ° C. Human colágeno tipo IV de placenta se obtuvo de Sigma Aldrich. Recubrimiento de placas de Petri de plástico (placas de microtitulación de 96 pocillos, Nunclone; Nunc, Roskilde, Dinamarca) se realizó por incubación durante la noche con proteínas de la MEC (10 mg /ml) a 4 ° C. Las placas se saturaron con 3% de BSA en PBS durante 2 horas a 37 ° C (w /v). células HT-29 CRF2-GFP se pretrataron o no con 100 nM UCN3 durante 30 min antes de ser plateado (5 × 10
4 células /pocillo) por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertos y se incubó de 0 a 60 min a 37 ° C. Las células no adherentes se retiraron por lavado tres veces con PBS, y la adhesión celular se estimó por un ensayo de proliferación celular (CellTiter 96 AQ
ueous celular no radiactivo Ensayo de proliferación; Promega)
transmigración celular y la invasión. células
HT-29-GFP CRF2 se sembraron en 24 cultivos polarizados pocillos (8 M de tamaño de poro) (Becton Dickinson). Después de la confluencia celular, el medio de cultivo se cosechó el suero durante la noche en arriba y abajo de las cámaras. entonces transmigración se inició mediante la creación de un gradiente de suero con 10% de FCS en la cámara inferior, con o sin 100 nM UCN3 en cada cámara. 72 horas después del inicio de la transmigración, hisopos de algodón se utilizan para eliminar las células en la superficie superior de los cultivos polarizados. Después de la fijación con PFA 4%, las células migratorias se tiñeron con hematoxilina y se contaron manualmente al microscopio. Los valores promedio +/- SEM fueron calculados y analizados utilizando el test de Student
. Células
HT-29-GFP (CRF2 2.5 10
-5 /ml) se colocaron en el compartimento superior de un 24 pocillos múltiples insertar placa de inserción (BD Falcon) que se ha separado del compartimento inferior por la membrana de Matrigel BD-Matrix, con tamaño de poro 0,4-m. RPMI libre de suero con o sin UCN3 (1 M) se añadieron en el compartimiento de la parte superior y 10% de FCS en el compartimiento inferior. Después de 48 horas a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%, las células que habían invadido a través del Matrigel, se analizaron como se ha descrito antes para el ensayo de transmigración.
La viabilidad celular se evaluó con el kit de CellTiter 96 (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
degradación de la gelatina ensayo
Acerca de 40 l (proteínas de células 20 a 30 g) medio de cultivo cosechado se sometieron a electroforesis en condiciones no reductoras en un gel de acrilamida al 10% que contiene 1 mg /ml de gelatina (Sigma-Aldrich), según el método descrito por Werb y col., [21]. Después de la electroforesis, los geles se lavaron a temperatura ambiente durante 3 × 30 min en 2% de Triton X-100 y durante la noche a 37 ° C en tampón que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,7) y mM CaCl 5
2.Thereafter , los geles se tiñeron con 0,1% (peso /vol) de Coomassie Brillant Blue R-250 en 50% (vol /vol) isopropil alcohol /10% (vol /vol) de ácido acético glacial durante 60 minutos y se destiñeron en 20% (vol /vol) de alcohol isopropílico /5% (vol /vol) de ácido acético glacial.
El análisis densitométrico y estadísticas
Las inmunotransferencias mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Todos los gráficos representan el valor medio ± desviación estándar de los niveles de expresión de proteínas medidos por análisis densitométrico en el software "Image J" (NIH). Los niveles relativos de expresión de ARNm o proteínas se determinaron como sigue: la expresión de nivel de cada transcripción o la proteína se normalizó a i) su limpieza de genes en qPCR o RT-PCR; ii) a la actina en westernblots lisado enteras o las histonas en westernblots extracto nuclear. En algunos experimentos, y con el fin de mostrar un aumento de veces sobre el control, la expresión relativa de las transcripciones o proteínas en condiciones de control se pone a 1. Las estadísticas son unpaired t-test y significación estadística viene dada por el número de asteriscos (* P & lt; 0,05 ; ** P & lt; 0,01; *** p & lt;. 0.001)
resultados
la expresión de CRF2 y sus ligandos aumentan con la puesta en escena en los tejidos y líneas celulares de CRC
han realizado primera qPCR para CRF2α (la principal isoforma CRF2 del epitelio del colon), [22] y Ucn2 /3 en los tejidos normales y CRC de 30 pacientes, para comprender mejor su regulación durante la progresión tumoral (Figura 1A). Los hallazgos clinicopatológicas de los tumores utilizados en el estudio se muestran en la Tabla 2. Los tumores se agruparon en bajo (n = 19, que corresponde a las etapas 1-2) y alta (n = 11, que corresponde a las etapas 3-4) grados y estandarizada a sus tejidos normales. El análisis estadístico reveló un aumento significativo de la expresión de mRNA y CRF2α UCN3 en los tumores en comparación con los tejidos normales de acuerdo con el grado del tumor. No hubo diferencias significativas de las transcripciones Ucn2 en estas condiciones. Sin embargo, cuando el análisis se realiza en los tumores de tejidos solamente, un patrón se reveló en relación con la expresión de mRNA Ucn2: los niveles de transcripción Ucn2 se aumentaron de acuerdo con el estado de PNM la invasión de los ganglios linfáticos y la inestabilidad de microsatélites (MSI). Por último, CRF2α, Ucn2 y los niveles de transcripción UCN3 no se correlacionaron con las mutaciones de
K-ras o B-raf
. Un resultado similar se encontró con líneas celulares de CRC (complementario Figura S1). El análisis inmunohistoquímico se utilizó con el fin de detectar la expresión de la proteína del receptor CRF2 en secciones colorrectales correspondiente a tejidos normales (n = 9), de grado bajo (n = 24) y de alto grado tumores (n = 18) (Figura 1B). La proporción de muestras mayores que la media de los tejidos normales se incrementó de 22% en normal a 33% y 72% en los tumores de bajo y alto grado, respectivamente (Figura 1C, panel izquierdo). Por otra parte, la expresión de la proteína CRF2 aumentó de acuerdo con el grado del tumor (ANOVA p = 0,047) (panel derecho). Estos resultados sugieren una relación entre la expresión de la proteína CRF2 y grados tumorales más altas. Hemos ampliado nuestro análisis de qPCR en 17 líneas celulares de CRC humanos (Figura complementario S1). Curiosamente, hemos encontrado que la expresión de ligandos CRF2 se correlaciona inversamente con marcadores de diferenciación epitelial como E-cadherina (
Cdh1
) pero correlacionado con los responsables mesenquimales como la vimentina (
Vim
), lo que sugiere un papel de CRF2 en la desorganización celular observada durante la progresión del tumor. Se seleccionaron dos líneas celulares de CRC: i) HT-29 células, que expresan alto nivel de E-cadherina, pero bajo nivel de Ucn2 y sin vimentina; ii) las células SW620, células mesenquimales pobremente diferenciado que expresan altos niveles de Ucn2 y vimentina en comparación a un nivel débil de E-cadherina (Figura 2A). La expresión de CRF2 y E-cadherina a nivel de proteínas se confirmó por inmunotransferencia (Figura 2B). Usando células HT-29 que sobreexpresan de forma estable el CRF2 acoplado a proteína GFP (células HT -29 CRF2-GFP) se observó que CRF2-GFP se localiza predominantemente en la membrana, en los contactos intercelulares (Figura 2C). Esta observación fue apoyada por el análisis de microscopía confocal que muestra una co-localización de la proteína CRF2-GFP con E-cadherina en células HT-29 (Figura 2D). Con UCN3 (el agonista CRF2 más eficiente en las células HT-29, véase la Figura suplementaria S2), las células se alteraron los contactos y CRF2-GFP desplazan en vesículas citoplásmicas (Figura 2C).
Los histogramas (A) que representa CRF2α, Ucn2 y UCN3 transcripción de expresión normalizaron a la limpieza de genes PGK (fosfoglicerato quinasa) en los tejidos humanos normales o CRC (bajos y altos grados). (B) Representante CRF2 inmunohistoquímica se realiza en tejidos de CRC de bajo a alto grado. Barra de escala, 50 micras. (C) Los histogramas que representan la expresión de proteínas CRF2 cuantificado de inmunohistoquímica. Cada muestra se representa como barras oscuras +/- SD (izquierda) y el valor medio de cada grupo +/- SD (derecha). De alto grado es estadísticamente diferente de lo normal en *, p. & Lt; 0,05
(A) Caracterización de líneas HT-29 y células SW620 de la expresión del ARNm de Ucn2, vimentina (Vim) y E-cadherina ( Cdh1) normalizó a la limpieza de genes HPRT (fosforribosiltransferasa humana). (B) E-cadherina /actina y proteínas de expresión de CRF2 /actina se cuantificó mediante inmunotransferencia en SW620 y líneas de células HT-29. (C) La microscopía confocal análisis de la distribución CRF2-GFP en células HT-29 tratadas con UCN3. Barra de escala, 15 micras. (D) La microscopía confocal análisis de CRF2-GFP y distribución de E-cadherina en células HT-29. Barra de escala, 20 micras.
En conjunto, estos datos indican que CRF2 y sus ligandos se expresan en líneas celulares humanas de CRC y de acuerdo con el grado del tumor y /o estado de diferenciación. CRC células podrían activar su CRF2 a través de una producción autocrina de ligandos, especialmente en líneas de células indiferenciadas.
Regulación de los contactos célula-célula por CRF2 señalización
señalización CRF2 se ha extendido recientemente a la no canónica G acoplados a proteínas receptoras, incluyendo las vías de Src quinasa que interacciona directamente con los receptores de CRF endocitosis y participa en la activación de ERK [23], [24]. Src-P
Tyr418 expresión se incrementó progresivamente de 5 a 30 min, mientras que la Src total se mantuvo sin cambios (Figura 3A). La forma fosforilada de Src ha sido co-inmunoprecipitado con CRF2 durante la primera etapa de la cinética (Figura complementario S3). En CRC, activación de la quinasa Src se correlaciona con la perturbación E-cadherina, grado histológico y el mal pronóstico [25]. Así se investigó la participación de la actividad de Src en la disociación celular mediada por UCN3. En las células HT-29, el análisis de microscopía confocal mostró que la tinción de cadherina E produjo un nido de abeja como patrón en la corteza membrana lateral (Figura 3B). La activación de CRF2 por UCN3 alterado rápidamente este patrón. Sólo una tinción de membrana lineal que espese y se rompieron mientras persistió numerosas acumulaciones citoplasmáticos aparecieron, lo que indica una endocitosis de E-cadherina asociado a la interrupción AJ. La cicloheximida se utiliza para prevenir la acumulación de neosynthesized E-cadherina. Los ensayos que utilizan anticuerpos de internalización HECD-1 se realizaron para confirmar la endocitosis inducida por E-cadherina-UCN3 (figura S4 complementario). disociación celular y la endocitosis de E-cadherina, tras la exposición UCN3 fue impedida por el pre-tratamiento con el inhibidor PP2 familia Src, lo que indica que se requiere la activación de Src para la contactos célula-célula mediada por UCN3 interrupción (Figura 3C). En las células SW620, que expresan bajos niveles de E-cadherina y realizan pocas AJ, el bloqueo de la señalización de CRF2 por su astressin2b agonista específico (A2b) durante 24 h fue responsable de un aumento de la expresión de E-cadherina (Figura 3D). El análisis de inmunofluorescencia de la distribución de E-cadherina en las células SW620 mostró débil expresión en la membrana y la célula-célula contactos con o sin UCN3 (Figura 3E). En presencia de A2b, células SW620 forman racimos y E-cadherina se localizó en los contactos célula-célula. UCN3 invierte ligeramente agrupación celular inducida por A2b. El análisis por inmunotransferencia de modulación de propiedades adhesivas de las células SW620 también se pone de manifiesto en ensayos de agregación, lo que demuestra que tanto las células adherentes y no adherentes fueron capaces de agregarse en presencia de A2b (Adicional Figura S5).
(A) de Src P
Tyr418 y Src total de la expresión en células HT-29 siguiendo el curso del tiempo de tratamiento UCN3. (B) Confocal análisis de la distribución de E-cadherina en células HT-29 tratadas previamente con cicloheximida antes del tratamiento UCN3. Barra de escala, 15 micras. (C) Efecto de PP2 (10 m, 1 h) sobre la distribución de E-cadherina en células HT-29 tratadas o no con UCN3, analizadas por microscopía de epifluorescencia. Barra de escala, 20 mM. (D) Efecto de los antagonistas de CRF2 (A2b, 8 nM, 24 horas) en la expresión de E-cadherina en las células SW620. La cuantificación se realizó de inmunotransferencias y normalizado a la actina. (E) de distribución de E-cadherina en células SW620 tratado previamente o no con A2b y tratarse adicionalmente o no con UCN3. Analizado se realizaron por microscopía de epifluorescencia. Barra de escala, 10 mM.
E-cadherina se asocia con catenina en los complejos AJ. La interrupción de los contactos célula-célula conduce a AJ proteínas disociación y citoplásmica y /o la localización nuclear de cateninas, que promueven la invasión de células en CRC [26]. En las células HT-29 tratadas con UCN3, p120ctn se acumula en el citoplasma y el núcleo (Figura 4A). En el núcleo, p120ctn ha sido descrito para regular la actividad del factor de transcripción Kaiso. UCN3 aumentado significativamente p120ctn y expresión Kaiso nuclear como se observa por inmunotransferencia después del fraccionamiento nuclear (Figura 4B). Para identificar las moléculas de señalización implicadas en este nuclear shuttling, hemos probado el efecto de Src (PP2) y los inhibidores de MEK (U0126). Como se muestra en la Figura 4C, se encontró que estos inhibidores invierten la acumulación nuclear inducida por UCN3 de estas proteínas. También indujo un aumento de la expresión nuclear basal de p120ctn y Kaiso, probablemente debido a su efecto tóxico. La distribución nuclear de Kaiso se analizaron por microscopía confocal (Figura 4D). El porcentaje de núcleos positivos para Kaiso aumentó aproximadamente 40% en las células HT-29 tratadas con UCN3. Curiosamente, en las células de control, las células correspondientes a núcleos positivos para Kaiso se observaron en la periferia de la agrupación, que corresponde a las células con contactos menos intercelulares. Bajo UCN3, las células en el centro de la agrupación se convirtió en positivo para núcleos etiquetado de kaiso.
(A) análisis confocal de la localización p120ctn en células HT-29 tratadas previamente con cicloheximida antes del tratamiento UCN3. Barra de escala, 10 micras. (B) Análisis de inmunotransferencia de p120ctn y expresión de proteínas Kaiso en extractos nucleares de células HT-29 tratadas o no con UCN3 (expresión se normalizó a las histonas). (C) Los efectos de los inhibidores de Src y MEK (PP2 y U0126: 10 M, 1 hr) en p120ctn y expresión de proteínas Kaiso en extractos nucleares de HT-29 tratadas o no con UCN3. La expresión se normalizó a las histonas. (D) Confocal análisis de la distribución celular de Kaiso en células HT-29. Los núcleos se tiñeron con Topro3. Las células negativas para el etiquetado de los núcleos de Kaiso fueron limitadas por una línea de puntos blancos. Barra de escala, 60 micras.
En conjunto, nuestros datos indican que las señales CRF2 a través de una vía de Src para inducir la interrupción por endocitosis AJ E-cadherina. Esto es seguido por p120ctn y Kaiso translocación nuclear. A través de esta ruta, CRF2 puede participar en la desdiferenciación celular y la migración.
señalización CRF2 reorganiza los contactos célula-matriz en favor de la migración celular y la invasión
migración de las células del cáncer que se requiere para la metástasis y los resultados de la reorganización de los contactos célula-célula y célula-matriz. disociación celular inducida por UCN3 también se asoció con la remodelación de la forma celular como se observa mediante tinción del citoesqueleto de actina con faloidina-TRITC en el polo basal de células HT-29 (Figura 5A). En las células no tratadas, la actina se distribuyó en la periferia de la célula y organizada como fibras de estrés repartidos en las células. Con UCN3, la tinción de actina fue menos intensa en la periferia de la célula donde se disocian los contactos. También hubo menos fibras de estrés, que aparecieron más corto y más fragmentado. La remodelación de la forma celular es impulsado por quinasas intracelulares de señalización. En esta línea, la vía ERK ha también a menudo se ha activado en respuesta a la activación de CRF2. En las células HT-29-GFP CRF2, hemos demostrado que ERK fosforilada fue en Tyr
204 en un corto período de tiempo después de la exposición UCN3 (Figura 5B). La relación de ERK fosforilada /total se incrementó por un pliegue 2.5 entre 5 y 15 min y regresó a su nivel basal a los 30 y 60 min. PP2, invirtió la activación de ERK inducida por UCN3 sin cambiar su nivel basal (bajo el panel). El inhibidor de MEK, U0126, induce la pérdida de las formas fosforiladas de ERK en condiciones basales y después del tratamiento UCN3. La adhesión celular y la migración remodelación implica la adhesión focal (FA) quinasa (FAK). Esta quinasa podría ser fosforilada en Ser
910 por la quinasa ERK Ser /Thr. Hemos determinado así el nivel de la fosforilación de FAK en las células HT-29-GFP CRF2 expuestos a UCN3 (Figura 5C). FAK P
Ser910 se aumentó transitoriamente con un máximo a 30 min. Esta fosforilación fue ligeramente inhibido por PP2 y U0126 en condiciones basales y abolió bajo tratamiento UCN3. Estos datos sugieren que UCN3 activa un /ERK /FAK cascada de fosforilación Src a través del receptor CRF2.
(A) de fluorescencia Phaloidin-TRITC se analiza por microscopía confocal en el polo basal de las células HT-29-GFP CRF2 siguiente UCN3 tratamiento. Barra de escala, 5 micras. (B) ERK-P
Tyr204 /ERK relación total cuantificado de inmunotransferencia en células HT-29 tratadas con UCN3 (0 a 60 min) (panel superior). Efectos de Src (PP2: 10 m, 1 h) o MEK (U0126: 10 M, 1 h) inhibidores de ERK inducida UCN3-P
Tyr204 (panel inferior). (C) mediada por fosforilación de UCN3 FAK- P
Ser910 en el TC-29. Cuantificaciones se realizaron de inmunotransferencias y normalizado a la actina (panel superior). Efectos de Src (PP2, 10 m, 1 h) y ERK (U0126, 10 mM, 1 h) inhibidores de UCN3 inducida FAK-P
Ser910 (panel inferior). (D) Confocal análisis de la distribución vinculina en el polo basal de HT-29 tras el tratamiento UCN3. Barra de escala, 20 micras. (E) La cuantificación del número de patch por tamaño a los 30 minutos del tratamiento UCN3.
estructuras de adhesión focal, que están regulados por la FAK, participar en las interacciones célula-ECM. Estas interacciones están mediadas por varios receptores transmembrana, tales como las integrinas, vinculados a los componentes del citoesqueleto y moléculas de andamios como vinculina [27]. Se analizó el efecto de UCN3 en la FA a través de la distribución de vinculina (Figura 5D). Sin UCN3, vinculina se expresó en parches fuertes distribuidos principalmente en la periferia de la célula. Con UCN3, garras puntuadas más pequeñas aparecieron en tinción vinculina que se distribuye homogéneamente por toda la célula y todavía no se limita en la periferia, sobre todo en 30 min. La cuantificación de estos parches de tamaño reveló que pequeños parches aumentaron mientras que las grandes permanecen sin cambios (Figura 5E). Esta etiqueta sugiere la formación de contactos focales nacientes, que se han descrito anteriormente para participar en la adhesión celular y la migración [28]. Hemos realizado experimentos de adhesión celular con el fin de probar si la reorganización vinculina inducida por UCN3 podría alterar la unión de células a colágeno IV (CoIV) y laminina 332 (LM-332) (dos principales proteínas de la MEC de la lámina basal de colon) (Figura 6A). UCN3 disminuye HT-29 la adhesión celular en estos dos componentes de la matriz en 20 y 60 min de chapado. Para determinar si este efecto se asoció con la migración y /o a la invasión probamos el impacto de UCN3 sobre HT-29 de la motilidad celular por transwell la migración y la invasión de Matrigel ensayos (Figuras 6B y C). tratamiento UCN3 aumentó significativamente el nivel de la migración celular y la invasión en comparación con las células control. Este efecto no fue apoyada por la modificación de la viabilidad celular (Figura 6D), pero podría ser regulada por la secreción de las metaloproteasas de matriz (MMPs). Nosotros por lo tanto, examinó la expresión y la actividad de MMP. Como se muestra en la figura 6E, se encontraron niveles de mRNA de MMP 3 y MMP7 que aumentar de forma transitoria por UCN3. No hemos observado modulación significativa de MMP2 y MMP9 transcripciones (datos no mostrados). (UN).