Extracto
quimiocina CXCL12 y receptor CXCR4 han surgido como dianas terapéuticas prometedoras para el cáncer de ovario, una enfermedad que sigue teniendo un pronóstico sombrío. CXCL12-CXCR4 señalización proliferación unidades, la supervivencia, y la invasión de células de cáncer de ovario, lo que lleva al crecimiento del tumor y la metástasis. efectos pleiotrópicos de CXCR4 en múltiples pasos clave en el cáncer de ovario sugieren que el bloqueo de esta vía será mejorar los resultados para los pacientes con esta enfermedad. Para cuantificar CXCL12-CXCR4 señalización en ensayos basados en células y modelos de ratón vivo de cáncer de ovario, hemos desarrollado un reportero de luciferasa complementación roja clic escarabajo que detecta la activación de CXCR4 basado en el reclutamiento de la proteína citosólica adaptador de β-arrestina 2. Tanto en dos cultivos de células dimensionales y tridimensionales, se estableció que la bioluminiscencia de este reportero medidas de activación CXCL12 dependiente de CXCR4 y la inhibición de esta vía con AMD3100, una pequeña molécula aprobado clínicamente que la unión bloques CXCL12-CXCR4. Se utilizó este sistema de imágenes para cuantificar CXCL12-CXCR4 señalización en un modelo de ratón de cáncer de ovario metastásico y mostraron que el tratamiento con AMD3100 interrumpe esta vía
in vivo
. La terapia de combinación con AMD3100 y cisplatino disminuyó significativamente la carga tumoral en ratones, aunque las diferencias en la supervivencia global no fueron significativamente mayores que el tratamiento con cualquiera de los agentes en monoterapia. Estos estudios establecen un sistema indicador de imágenes moleculares para el análisis de CXCL12-CXCR4 señalización en cáncer de ovario, que se puede utilizar para investigar la biología y el enfoque terapéutico de esta vía en ensayos basados en células y ratones vivos
Visto:. Salomonnson E , Stacer AC, Ehrlich, Luker KE, Luker GD (2013) Imágenes CXCL12-CXCR4 señalización en la terapia del cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10.1371 /journal.pone.0051500
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2012; Aceptado: 1 Noviembre 2012; Publicado: 23 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Salomonnson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (NIH, R01CA136553 R01CA136829 y P50CA093990) y el Departamento de Defensa (W81XWH-09-1-0128). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
quimiocina CXCL12 (SDF-1) y su receptor CXCR4 están fuertemente implicados como factores determinantes de la iniciación del tumor y la metástasis de cáncer intraperitoneal [1] de ovario. CXCL12 es secretada por ≈70-90% de las células de cáncer de ovario, así como células mesoteliales en el peritoneo de ratones y seres humanos [2] [3] [4] [5]. Los pacientes con los más altos niveles de CXCL12 expresión en células de cáncer de ovario tienen un pronóstico significativamente peor, haciendo hincapié en la importancia biológica de esta molécula de señalización en la progresión de la enfermedad [6]. Efectos de CXCL12 en el cáncer de ovario parecen estar mediados por CXCR4, uno de los dos receptores conocidos para este quimioquinas. La amplificación de CXCR4 es un evento temprano en la transformación maligna de las células epiteliales de ovario, lo que sugiere que CXCL12-CXCR4 es fundamental para la patogénesis de esta enfermedad [7]. Aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer de ovario tiene CXCR4 en células malignas, y estos pacientes han reducido significativamente la supervivencia global [4]. señalización a través de CXCR4 CXCL12 promueve la proliferación, invasión y metástasis de las células de cáncer de ovario, todos los cuales contribuyen a la enfermedad más agresiva. Los efectos adversos de CXCL12 en el cáncer de ovario también pueden deberse a los efectos sobre el compartimiento del estroma del microambiente del tumor, incluyendo una mayor angiogénesis y el reclutamiento de células inmunosupresoras [8] [9] [10] [11].
Centro funciones de CXCL12-CXCR4 señalización en las células malignas y la posición microambiente tumoral este eje de señalización como un objetivo clave para mejorar la terapia para los pacientes con cáncer de ovario. En modelos de ratón, nosotros y otros han demostrado que el bloqueo de CXCL12-CXCR4 señalización con ARN de interferencia contra CXCL12 o un inhibidor de molécula pequeña de CXCL12-CXCR4 vinculante (AMD3100) limita el crecimiento de los implantes de células de cáncer de ovario [12], [13], [14 ]. La inhibición de la señalización de CXCL12-CXCR4 también prolonga la supervivencia de ratones con cáncer de ovario. Sin embargo, los efectos de la terapia de agente único son modestos, lo que sugiere que la orientación CXCL12-CXCR4 en combinación con otro agente puede ser más beneficioso.
El establecimiento de un compuesto que golpea con eficacia su objetivo previsto es esencial para el desarrollo de fármacos en la pre-clínica modelos y ensayos clínicos. Para analizar la farmacodinámica de los fármacos dirigidos a CXCL12-CXCR4 señalización en modelos de ratón de cáncer de ovario, hemos desarrollado un indicador de luciferasa de escarabajo de complementación clic a la imagen y cuantificar la activación y la inhibición de esta vía
in vivo
. En este sistema, CXCR4 y la citosólica proteína adaptadora β-arrestina 2 se fusionan con amino inactivo (CBRN) y carboxi (CBC) fragmentos terminales de luciferasa de elatérido roja. El reportero mide la activación de CXCR4 CXCL12 señalización basado en el reclutamiento de la proteína adaptadora citosólico β-arrestina 2 de este receptor. El reclutamiento de β-arrestina 2 es un evento común, a principios de la activación de los receptores de quimioquinas y la gran familia de receptores transmembrana de siete [15]. Con el sistema de complementación de la luciferasa, las interacciones entre el CXCR4 y β-arrestina 2 Reconstituir activa clic luciferasa de escarabajo para producir luz, proporcionando una métrica de imágenes para CXCR4 señalización en las células intactas, cultivos esferoides tridimensionales, y ratones vivos. Los esferoides son un intermedio importante entre ensayos de cultivo celular estándar de dos dimensiones y xenoinjertos tumorales desde esferoides tumorales reproduzcan difusión de los compuestos en los tumores y la formación de esferoides de cáncer de ovario en el líquido ascítico de pacientes restringido. Desde la complementación de la luciferasa es reversible, este reportero de imágenes también se puede utilizar para medir los efectos de compuestos de bloqueo de CXCL12-CXCR4 señalización
Opiniones y
in vivo
.
Se utilizó este in vitro reportero de imágenes para analizar CXCL12-CXCR4 señalización en cáncer de ovario y establecer que AMD3100, un inhibidor de molécula pequeña de CXCR4, la activación del receptor bloques en el microambiente tumoral. El uso de este sistema de imagen, se determinó que la terapia de combinación con cisplatino y AMD3100 disminuyó significativamente la carga global de tumor en un modelo de ratón de cáncer de ovario humano con metástasis intraperitoneales. Estos resultados establecen un nuevo método de imagen molecular para analizar CXCL12-CXCR4 señalización en el cáncer de ovario y sugieren un posible beneficio terapéutico de la combinación de la inhibición selectiva de esta vía de receptores de quimioquinas con fármacos quimioterapéuticos estándar.
Materiales y Métodos
los plásmidos
Para generar fusiones de CXCR4 con el fragmento N-terminal de la luciferasa clic escarabajo rojo (NRBQ) (Promega), amplificado por PCR y CXCR4 clonó el producto en los sitios XhoI y AgeI de EGFP-N1 (Clontech). Se utilizó PCR para amplificar la secuencia de ADN para los aminoácidos 2-413 de la luciferasa de elatérido roja (CBRN) y se clonó este producto en sitios AgeI y NotI de EGFP-N1 [16]. Esta estrategia de clonación elimina EGFP del vector. Amplificamos la secuencia de los aminoácidos 395-542 de la luciferasa de elatérido (CBC) por PCR y se clonó el producto en los sitios AgeI y NotI de EGFP-N1 para crear una fusión con el extremo C-terminal de β-arrestina 2 (regalo de Robert Lefkowitz). Para transferir las construcciones de la cadena principal EGFP-N1 a FUW vector lentiviral, se utilizó PCR para amplificar la secuencia de ADN diana y añadir sitios XbaI para clonación. Construcciones utilizadas para este estudio se resumen en la Figura 1 (Fig. 1A), y los cebadores de PCR utilizados para la clonación se enumeran en la Tabla 1.
A) Panel muestra vectores lentivirales y las células transducidas de forma estable utilizados para los estudios de imagen. B) Diagrama esquemático del sistema de complementación roja clic escarabajo. fragmentos N- y C-terminales de la luciferasa de elatérido roja se fusionan al C-terminales de CXCR4 y β-arrestina 2, respectivamente. la unión a CXCR4 CXCL12 provoca el reclutamiento de β-arrestina 2 al receptor activado, reconstituyendo clic luciferasa de escarabajo rojo para producir luz.
Células
HeyA8 células de cáncer de ovario (siempre por Gordon Mills, MD Anderson Cancer Center) fueron transducidas de forma estable con lentivirus recombinantes para CXCR4-NRBQ y Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC) [17]. Se utilizó la transducción lentiviral para establecer poblaciones de células que expresan de forma estable HeyA8 CXCL12 condensado con
Gaussia
luciferasa (HeyA8-CXCL12-GL), sin condensar
Gaussia
luciferasa (Hey-GL), y luciferasa de luciérnaga y proteína fluorescente verde (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. También transduced células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y HeyA8-CXCL12-GL con la proteína fluorescente eqFP650 [20]. La figura 1 muestra una lista de células establemente transducidas utilizadas en este estudio (Fig. 1A). Todas las células se mantuvieron en DMEM con 10% de suero fetal bovino, 1% de glutamina, y 0,1% de penicilina /estreptomicina.
Citometría de flujo
Las células intactas se tiñeron con un anticuerpo para CXCR4 (clon 12G5 , R & amp; D Systems) o control de isotipo emparejado como se describe previamente para revelar los niveles de la superficie celular de este receptor [21]. células sin teñir de cada población celular se utilizaron como controles de compensación para citometría de flujo.
Western blotting
Las células fueron cultivadas en medio que contiene suero 1% durante la noche y después se estimularon durante 10 minutos con diversas concentraciones de recombinante CXCL12-α (R & amp; D Systems) para la activación de AKT. Para determinar la activación CXCL12 dependiente de ERK1 /2, se trataron las células privadas de suero con 100 CXCL12-α ng /ml durante 0, 5, 15, o 30 minutos en la presencia de control del vehículo o 1 AMD3100 mu M, un inhibidor de molécula pequeña de CXCR4 (Tocris). Los lisados celulares fueron borrados por AKT fosforilada o fosforilada ERK1 /2 (Cell Signaling) como se ha descrito anteriormente [19]. Blots fueron despojados y re-probaron para AKT total de o total ERK1 /2 como control de carga. También utilizamos Western Blot para determinar la expresión endógena de β-arrestina 2 y β-arrestin 2-CBC en las células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC (Cell Signaling). Las membranas fueron despojados un tiempo adicional y re-probaron para gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control adicional de carga. Medimos las intensidades de las bandas con ImageJ y los valores dividido por AKT fosforilada por AKT total y GAPDH. Se realizó cálculos similares para ERK fosforilada con respecto al total de ERK y GAPDH. Por tanto AKT fosforilada y ERK, que normalizó todos los valores de las células no tratadas con CXCL12.
Dos experimentos de cultivo celular tridimensional
plateó 1,5 × 10
4 HeyA8-CXCR4-NRBQ /células Ar-CBC por pocillo en placas de pocillos negros pared 96 un día antes de los ensayos. Cambiamos medio del medio de cultivo estándar a DMEM con 1% de suero para los experimentos. Se incubaron las células para aumentar los períodos de tiempo con 100 CXCL12-α ng /ml (R & amp; D Systems) o durante 60 minutos con concentraciones crecientes de quimiocina. En experimentos seleccionados, las células se incubaron con AMD3100 para inhibir la unión a CXCR4 o control de vehículo en concentraciones que se indican en la Figura leyendas CXCL12. Hemos añadido 150 mg /ml de luciferina (Promega) a los pocillos y luego cuantificamos bioluminiscencia de las células vivas utilizando un IVIS 100 (Perkin Elmer). La bioluminiscencia de la luciferasa de elatérido se cuantificó como se describió previamente y se normalizó para la proteína total por pocillo se cuantifica por tinción sulforrodamina B [19]. Los datos se expresaron como valores medios ± SEM para la luminiscencia en relación con los controles no tratados.
esferoides
Los esferoides se formaron en placas de caída de 384 pocillos que cuelgan mediante la siembra de un total de 2 × 10
4 HeyA8 células por pocillo [22]. Se han utilizado dos tipos diferentes de esferoides: 1) células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC mezclados con el mismo número de células HeyA8-CXCL12-GL al ensayo de activación e inhibición de la señalización CXCR4; o 2) células HeyA8-FL /GFP en combinación con el mismo número de células ya sea HeyA8-CXCL12-GL o HeyA8-GL, respectivamente, para los ensayos de viabilidad celular en respuesta a cisplatino. Para los experimentos con AMD3100, el aumento se añadieron concentraciones del compuesto de esferoides un día después de la siembra en placas colgando de caída. Incubamos esferoides con AMD3100 o vehículo para uno o dos días antes de la cuantificación de la bioluminiscencia. células HeyA8-FL /GFP en células esferoides con cualquiera HeyA8-CXCL12-GL o HeyA8-GL fueron tratados durante uno o dos días con concentraciones crecientes de cisplatino. Se cuantificó la fluorescencia de eqFP650 en un espectro IVIS antes de la cuantificación de la bioluminiscencia después de la adición de 6 mg /ml a cada luciferina esferoides. Hemos normalizado de flujo de fotones bioluminiscencia a la fluorescencia luminosidad para dar cuenta de las diferencias en el número de células.
Los estudios en animales
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Michigan Comité para el Uso y Cuidado de los Animales. Los animales fueron cambiados a pienso sin clorofila (Dietas de Investigación) para todos los estudios para minimizar la fluorescencia de fondo en los estudios de imagen. 2,5 × 10
5 células cada una de las células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y HeyA8-CXCL12-GL fueron inyectados por vía intraperitoneal en 100 l de NaCl 0,9% en 5-7 semanas de edad hembra NOD /SCID
IL2rγ
- /- ratones hembra (Taconic). Para inhibir la unión a CXCR4 CXCL12, se utilizó 5-día, bombas osmóticas 1,0 l /hora (para el experimento mostrado en la Fig. 5) o 14 días, 0,5 l /hora bombas osmóticas (para el experimento que se muestra en la Fig. 6) (Alzet) cargado con 25 mg /ml AMD3100 o control del vehículo NaCl 0,9%. Estas bombas suministran 1.25 o 0.625 mg AMD3100 /g /hora para cada ratón. Las bombas se implantaron en los momentos indicados en el texto de cada figura. Para los estudios de tratamiento se muestran en la Figura 6, inyectamos ratones con 4 mg /kg de cisplatino i.p. o vehículo emparejado cada 5 días. Cisplatino o vehículo de PBS inyecciones continuaron durante todo el periodo de dos semanas que las bombas de infusión osmótica estaban en su lugar. Todos los ratones recibieron compuesto activo (AMD3100 y /o cisplatino) o vehículo adaptado para ambas vías de administración (bomba de infusión osmótica y la inyección i.p.). Como ejemplos, los ratones de control de vehículo recibieron bombas osmóticas con 0,9% de NaCl y i.p. inyecciones de PBS, mientras que los ratones en el grupo de tratamiento AMD3100 tenían bombas osmóticas con AMD3100 y i.p. PBS.
Ratón de imágenes
Imágenes de bioluminiscencia se realizó en un espectro IVIS (Perkin Elmer). imágenes de fluorescencia y las imágenes luciferasa de escarabajo con luciferina se realizaron como se describe anteriormente [23]. datos de imágenes se cuantificaron como radiación de fluorescencia o de flujo de fotones, respectivamente. Los datos para la complementación clic escarabajo rojo de la luciferasa se normalizaron a la carga tumoral total asignado por fluorescencia de eqFP650.
Estadísticas
Los gráficos y los análisis estadísticos se prepararon con GraphPad Prism. estudios de cultivos celulares se realizaron 3-5 veces, mientras que los estudios con animales se realizaron dos veces. Los datos se representan como valores medios con el error estándar de la media (SEM). Los pares de datos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se analizaron mediante la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon.
Resultados
Haga clic en la complementación reportero escarabajo para la interacción de CXCR4 y β-arrestina 2
unión a CXCL12 resultados del receptor CXCR4 en el reclutamiento de la proteína citosólica adaptador de β-arrestina 2 al receptor activado. A la imagen y cuantificar este paso clave en la transducción de señales, se utilizó un ensayo de complementación fragmento de proteína recientemente descrito basado en clic luciferasa de escarabajo rojo [16]. En este sistema, CXCR4 se fusiona al fragmento N-terminal de la luciferasa de elatérido (CXCR4-CBRN) y β-arrestina 2 al fragmento C-terminal de esta enzima (Ar-CBC) (Fig. 1B). El reclutamiento de β-arrestina 2 a CXCR4 también reúne fragmentos de luciferasa para producir bioluminiscencia como una medida cuantitativa de esta interacción de proteínas en la señalización CXCR4.
transduced células de cáncer de ovario HeyA8 con vectores lentivirales para CXCR4-NRBQ y Ar- CBC. células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC Akt fosforilada en respuesta a la incubación con CXCL12 como determinados por Western Blot, lo que demuestra que estas células activan un efector aguas abajo conocido de CXCL12-CXCR4 (Fig. 2A). En comparación con las células parentales HeyA8, las células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC mostraron una mayor activación de AKT en respuesta a CXCL12, en consonancia con la transducción de CXCR4 funcional adicional en las células reportero de imágenes. Se demostró además que las células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC muestran la activación dependiente del tiempo de quinasas ERK1 /2, que fue inhibida por una concentración de saturación (1 M) de la AMD3100 inhibidor de CXCR4 (Fig. 2B). células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC sobreexpresan β-arrestin 2-CBC con respecto a la proteína endógena, determinada por Western Blot.
A) las células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y los padres eran HeyA8 tratados con concentraciones crecientes de CXCL12 durante 10 minutos. transferencia de Western de lisados de células totales muestra AKT fosforilada y total, respectivamente. Se utilizó GAPDH como control de carga. El gráfico muestra las intensidades de banda relativas de AKT fosforilada en cada línea celular normalizado a AKT total y GAPDH. B) las células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC se trataron con 100 CXCL12-α ng /ml durante 0, 5, 15, o 30 minutos en ausencia o presencia de 1 M AMD3100. Total de lisados de células se probaron para fosforilada y total de ERK1 /2, respectivamente. Los lisados también se analizaron por Western blot para la expresión de β-arrestin 2-CBC y endógeno β-arrestin 1 y 2. GAPDH se muestra como control de carga. C) La citometría de flujo de la expresión de CXCR4 en diversas líneas celulares HeyA8 utilizados en este estudio. línea oscura y líneas discontinuas en histogramas denotan control de isotipo y tinción con anticuerpos CXCR4.
Se utilizó citometría de flujo para evaluar la expresión de la superficie celular de CXCR4 en células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC, como así como las células HeyA8 parentales y las células transducidas de forma estable con
Gaussia
luciferasa (HeyA8-GL), CXCL12 fusionado a Gaussia luciferasa (HeyA8-CXCL12-GL), o luciferasa de luciérnaga y GFP (HeyA8-FL-GFP). Todas las células expresaron niveles similares de CXCR4 superficie celular (Fig. 2C). Aunque transducidas con CXCR4-CBRN, HeyA8-CXCR4-CBRN /células Ar-CBC tenían niveles de CXCR4 superficie celular que fueron comparables a las células parentales HeyA8, probablemente debido a la sobreexpresión de β-arrestina 2 causas internalización de este receptor de la superficie celular. [24], [25].
unidades de CXCL12 complementación entre el CXCR4 y β-arrestina 2
Para establecer que la bioluminiscencia de HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC medidas células activación de la señalización CXCR4 , se trataron cultivos monocapa de estas células con concentraciones crecientes de CXCL12 durante 60 minutos. Se han tratado cultivos paralelos de células con una concentración inhibitoria (1 M) de la AMD3100 inhibidor de CXCR4 o de control del vehículo durante el período de incubación [26] [27]. El tratamiento con CXCL12 produjo un aumento dependiente de la concentración en la bioluminiscencia de la asociación de CXCR4-CBRN y Ar-CBC, alcanzando pico de inducción de 3 veces en 1 mg /ml CXCL12 (Fig. 3A). En comparación, las células tratadas con AMD3100 mostró sólo bioluminiscencia basal sin respuesta a CXCL12.
) células A HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC se sembraron en forma de cultivos de dos dimensiones en placas de 96 pocillos y se incubaron con el aumento concentraciones de CXCL12-α en presencia de AMD3100 1 M o control del vehículo. Los datos se representan gráficamente como valores medios de luminiscencia en relación con células no tratadas con CXCL12 (n = 4 por condición). Las barras de error indican SEM. B) las células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC se trataron con 100 ng /ml CXCL12 para aumentar los períodos de tiempo en presencia de AMD3100 1 M o control del vehículo. Los datos se representan gráficamente como valores medios ± SEM de luminiscencia en relación con las células no incubadas con CXCL12 (n = 4 por condición). *, P & lt; 0,05; **, P. & Lt; 0,01
También se incubaron células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC con 100 ng /ml CXCL12 y AMD3100 o vehículo de control 1 M durante periodos crecientes de tiempo a través de 4 horas antes de medir la actividad luciferasa. En relación con las células no tratadas, células incubadas con 100 ng /ml CXCL12 y control del vehículo mostraron aumentos dependientes del tiempo en la bioluminiscencia, alcanzando un máximo en aproximadamente la inducción de 2 veces en 2 horas y luego disminución modesta (Fig. 3B). AMD3100 efectos de CXCL12 en la complementación entre la bioluminiscencia CXCR4-NRBQ y Ar-CBC completamente bloqueado. En conjunto, estos estudios muestran que la bioluminiscencia de las células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC responde a CXCL12 y establecen que este sistema reportero puede cuantificar la inhibición de la señalización de CXCL12-CXCR4.
Los efectos del fármaco en cultivo de esferoides
Los estudios recientes sugieren que los esferoides y los sistemas de cultivo de células en tres dimensiones similares son los modelos más fisiológicos de drogas dirigidos y eficacia, debido a factores que incluyen interacciones intercelulares directos y difusión restringida de compuestos [28], [29]. Además, las células de cáncer de ovario en pacientes forman esferoides en la ascitis, lo que representa una barrera potencial para la administración de fármacos [30]. Para modelar el microambiente del tumor de cáncer de ovario
in vivo
, hemos utilizado esferoides de células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC combinados con igual número de células HeyA8-CXCL12-GL, reproduciendo el cáncer de ovario humano en el que tumor células secretan CXCL12 y /o expresan CXCR4. Mientras que las células HeyA8 parentales no expresan CXCL12 como se determina por QRT-PCR (datos no mostrados), las células HeyA8-CXCL12-GL secretan aproximadamente 12 ng /ml CXCL12 en un período de 24 horas, que es comparable a los valores reportados para otras células de cáncer de ovario que secretan este quimioquinas endógena [19] [31]. Se han tratado esferoides con concentraciones crecientes de AMD3100 durante 24 horas antes de la cuantificación de la bioluminiscencia. En relación con esferoides tratados con el control del vehículo, AMD3100 inhibe la bioluminiscencia de la asociación de CXCR4-NRBQ y Ar-CBC. La actividad de luciferasa de la complementación reportero disminuyó ≈50% en esferoides tratados con 1 AMD3100 mu M (p & lt; 0,05) (Fig. 4A). Hemos observado resultados similares cuando hemos ampliado incubaciones a dos días con AMD3100 (datos no mostrados). La inhibición de CXCR4, tal como se cuantifica por el ensayo de complementación, fue menos eficaz en esferoides en comparación con un cultivo monocapa, lo que sugiere que la penetración tridimensional límites arquitectura de AMD3100 a todas las células. Sin embargo, observamos que las culturas esferoide criterio de los efectos de la exposición crónica a CXCL12 en vez de aguda Además de quimioquinas como se hace en la cultura de dos dimensiones, que también pueden contribuir a las diferencias en la eficacia de AMD3100.
A) culturas esferoide células HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y HeyA8-CXCL12-GL se trataron durante 24 horas con concentraciones crecientes de AMD3100. Los datos se representan gráficamente como valores medios ± SEM de luminiscencia para elatérido complementación en relación con esferoides tratados sólo con vehículo de control (n = 10 esferoides por condición). B) las células HeyA8-FL-GFP se cultivaron como esferoides con células HeyA8-CXCL12-GL o HeyA8-GL y después se trataron con concentraciones crecientes de cisplatino durante 24 horas. Los datos se representan gráficamente como valores medios ± SEM para luminiscencia de luciferasa de luciérnaga con respecto a los esferoides no tratados con cisplatino (n = 10 esferoides por condición). *, P. & Lt; 0,05
Hemos probado los efectos protectores de CXCL12 contra la citotoxicidad del cisplatino, un fármaco quimioterapéutico estándar para el cáncer de ovario. Para estos ensayos, se utilizó células HeyA8-FL-GFP, que expresan endógenamente CXCR4 (véase Fig. 2C). actividad de la luciferasa de la luciérnaga es directamente proporcional al número de células tumorales, proporcionando un ensayo fácil para la viabilidad celular en esferoides intactas [32]. Hemos generado esferoides combinando células HeyA8-FL-GFP con células HeyA8-CXCL12-GL o HeyA8-GL, respectivamente, y después se trató esferoides con concentraciones crecientes de cisplatino durante 24 horas. En esferoides que contienen células HeyA8-CXCL12-GL, células HeyA8-FL-GFP fueron protegidos modestamente contra los efectos citotóxicos del cisplatino, aunque sólo a 10 mM tenían que detectan diferencias significativas en la citotoxicidad relativa a esferoides que contienen células HeyA8-GL (p & lt; 0,05) (Fig. 4B). El grado de citotoxicidad fue comparable después de los tratamientos farmacológicos para 48 horas (datos no mostrados). Estos estudios muestran que CXCL12 confiere protección contra la muy modesta cisplatino en esferoides está constituida solo de las células de cáncer de ovario.
En vivo
imágenes de CXCR4 y β-arrestina 2 complementación en cáncer de ovario
Se utilizó un modelo de xenoinjertos de tumores humanos de cáncer de ovario metastásico intraperitoneal para determinar en qué medida la complementación entre el CXCR4 y β-arrestina 2 detecta la activación y la inhibición de CXCR4
in vivo
. Estamos co-inyectó el mismo número de células HeyA8-CXCL12-GL-HeyA8 CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y por vía intraperitoneal en ratones y utilizamos imágenes de bioluminiscencia para cuantificar el reclutamiento de β-arrestina 2 a CXCR4. En condiciones basales, se observó fácilmente bioluminiscencia de complementación entre HeyA8-CXCR4-NRBQ y Ar-CBC (Fig. 5A), lo que indica la señalización CXCR4 activa en las células malignas. ratones Nos separan entonces al azar en grupos tratados durante cinco días, ya sea con AMD3100 o control de vehículo suministrada desde bombas de infusión osmótica. No hubo evidencia fenotípica de toxicidad en ratones tratados con AMD3100. Los ratones tratados con AMD3100 tenía relativamente menos crecimiento de células de cáncer de ovario que los animales que recibieron sólo el control del vehículo tal como se cuantifica por la fluorescencia de la proteína fluorescente roja lejana eqFP650 expresa en las células malignas (Fig 5B.) (P & lt; 0,05). El uso de la fluorescencia de eqFP650 para normalizar las diferencias en el número total de células de cáncer de ovario, la bioluminiscencia de la interacción de CXCR4-CBRN con Ar-CBC fue significativamente menor en los ratones que recibieron AMD3100 durante cinco días en comparación con el control del vehículo. En conjunto, estos datos muestran la utilidad de este sistema de imagen para la medición de la orientación farmacológica de CXCL12-CXCR4 señalización y efectos resultantes del crecimiento del tumor
in vivo
(Fig 5C.) (P & lt; 0,05).
A) imágenes representativas de ratones con implantes intraperitoneales de HeyA8-CXCR4-NRBQ /células HeyA8-CXCL12-GL Ar-CBC y. Las imágenes se obtuvieron antes y después de 5 días de tratamiento con bombas osmóticas que contienen AMD3100 o control del vehículo. La barra de escala representa los rangos de valores de flujo de fotones que aparecen en las imágenes pseudocolor. B) La fluorescencia de las células de cáncer de ovario se midió en ratones tratados con AMD3100 o control del vehículo viviente. El gráfico muestra los valores medios + SEM para la fluorescencia relativa a los valores medidos en el día 0 antes de comenzar el tratamiento. Las flechas muestran el período en que las bombas osmóticas estaban en su lugar. C) cuantificado de datos de flujo de fotones para la complementación clic escarabajo rojo en ratones tratados con AMD3100 o control del vehículo, respectivamente. Los datos se normalizaron a la fluorescencia tumor para cada ratón y se representan como valores medios + SEM (n = 7 ratones por grupo). *, P. & Lt; 0,05
La terapia de combinación con cisplatino AMD3100 y reduce la carga tumoral
previamente demostrado que la terapia de agente único con AMD3100 mejora solo modestamente la supervivencia de ratones con cáncer de ovario intraperitoneal diseminada [14]. La hipótesis de que la terapia combinada con AMD3100 y un fármaco quimioterapéutico estándar mejoraría significativamente el control de tumor y la supervivencia, en base a estudios en la leucemia que muestran que CXCL12 en el microambiente tumoral confiere resistencia a los fármacos citotóxicos estándar [33]. Para probar esta hipótesis, se implantaron ratones con células HeyA8-CXCL12-GL-HeyA8 CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y. Una semana después de la implantación de los tumores Aleatorizamos ratones a los cuatro grupos de tratamiento: 1) control del vehículo; 2) AMD3100 entregado por las bombas de infusión osmótica de dos semanas; 3) cisplatino se administra como 4 mg /kg i.p. cada 5 días; y 4) en combinación AMD3100 y cisplatino. Continuamos inyecciones de cisplatino a través del período de entrega de dos semanas de AMD3100 bombas y luego suspendió toda la terapia.
Se utilizó la bioluminiscencia de HeyA8-CXCR4-NRBQ /Ar-CBC para analizar CXCR4 señalización
in vivo
y la fluorescencia de imágenes para eqFP650 para cuantificar la carga tumoral con el tiempo. Se calculó el área bajo la curva para la bioluminiscencia y fluorescencia y utilizamos relaciones de estos parámetros para evaluar la inhibición de CXCR4 en el tiempo (Fig. 6A). Los ratones tratados con AMD3100 o la combinación de AMD3100 y cisplatino tenía bioluminiscencia significativamente menor de CXCR4-CBRN y Ar-CBC complementación con relación a la carga global de tumor, que muestra que este fármaco con éxito bloques CXCR4 señalización en las células de cáncer de ovario
in vivo
(p & lt; 0,01)
a) Área bajo el análisis de la curva de los datos de imagen para relaciones de complementación clic luciferasa de escarabajo rojo para CXCR4 y β-arrestina 2 normalizado a la fluorescencia eqFP650 (carga tumoral) en ratones implantados con HeyA8. células -CXCR4-NRBQ /Ar-CBC y HeyA8-CXCL12-GL. Los datos se muestran en los grupos tratados con el control del vehículo, AMD3100, cisplatino, o ambos AMD3100 y cisplatino durante dos semanas, comenzando una semana después de la implantación de células. El gráfico muestra los valores medios ± SEM (n = 7 ratones por grupo). *, P & lt; 0,05. B) Área bajo la curva de análisis de fluorescencia de eqFP650 producida por las células de cáncer de ovario implantados en el transcurso del experimento. El gráfico muestra los valores medios ± SEM. *, P & lt; 0,05, **, p & lt; 0,01. curvas C) de Kaplan-Meier para la supervivencia de los ratones tratados con vehículo, AMD3100, cisplatino, o AMD3100 y cisplatino. Todos los grupos de tratamiento difieren de control del vehículo (p & lt; 0,05). Pero no el uno del otro
Los ratones tratados con un solo agente AMD3100 o cisplatino había modesta, pero significativa, la reducción de la carga tumoral mide por imágenes de fluorescencia durante el curso del experimento (p & lt; 0,05) (Fig 6B.). En comparación, la terapia de combinación tanto con AMD3100 y cisplatino redujo significativamente el número total de células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC en relación con el control del vehículo o cualquier fármaco solo (p & lt; 0,01 y p & lt; 0,05, respectivamente). Estas diferencias eran evidentes a pesar de que los ratones recibieron sólo dos semanas de tratamiento con estos fármacos. Los ratones implantados con células de cáncer de ovario HeyA8 desarrollaron ascitis, pero no había ninguna diferencia en los pesos del cuerpo en general entre los distintos grupos de tratamiento (datos no mostrados). Hubo una tendencia hacia una mayor supervivencia en los ratones tratados tanto con AMD3100 y cisplatino (Fig. 6C). Sin embargo, las diferencias entre AMD3100, cisplatino, y AMD3100 combinado y cisplatino no fueron significativos, aunque todos los tratamientos mejorados supervivencia en relación con el control del vehículo (p & lt; 0,05).
Discusión
El cáncer de ovario sigue siendo la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos con una supervivencia global a los cinco año de ≈50%. Mal pronóstico del cáncer de ovario se debe en parte al hecho de que la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada asociada con intraperitoneal, el hígado o metástasis sistémicas [34]. El cáncer de ovario es inicialmente sensibles a la quimioterapia con fármacos basados en platino, aunque la mayoría de los pacientes recaen con células tumorales resistentes a los medicamentos dentro de aproximadamente un año.